第四章 實驗材料與方法
第一節 實驗動物之血清生化參數測量
一、實驗儀器
1. Olympus AU-640 儀器 2. Olympus AU-400 儀器
3. 超高速離心機為 Beckman OptimaTM MAX-E Ultracentrifuge (Rotor： TLA 110)
4. 分光光度儀
二、實驗材料與試劑
1. 膽固醇粉末購自 Sigma.
2. 豬油購自超級市場。
3. Hamsters basal diet (Laboratoryn Rodent Diet 50001 ) 購自 PMI® NUTRITION INTERNATIONAL (USA)。
4. 複方 KDS 718(丹參酚酸 B、薑黃素、葛根素及玫瑰花組成)由 廠商提供。
5. Pentothal 購自亞培化學。
6. Statin (HMG-CoA reductase inhibitors)，為降血脂藥物。
三、實驗動物
1. 4~5 週雄性倉鼠(Golden Syrian hamster)共 135 隻，購自國家 動物中心。飼養於台北醫學大學動物中心，飼養房的溫度維持在 23±2℃，相對濕度維持在 55±5%，實驗期間每週記錄其重量。
四、實驗方法
(一) 預試驗 I：
1. 目的： 採用不同組成 KDS718 複方，給予餵食高脂肪飼料的 動物，找出最佳降血脂配方。
2. 動物飼料：
High fat diet：Basal diet + 0.2% cholesterol + 5% lard oil Basal diet：Hamsters basal diet
3. 方法：4~5 週雄性倉鼠飼養一週後隨機分組並開始進行實 驗，10 種 KDS718 複方分別是 A1~A10，混合在粉狀飼料中，供倉 鼠自由攝取，每組3 隻，共 12 組，進行四週，分組如下：
(1) 實驗組
I. High fat diet + 0.5% A1 powder II. High fat diet + 0.5% A2 powder III. High fat diet + 0.5% A3 powder IV. High fat diet + 0.5% A4 powder V. High fat diet + 0.5% A5 powder
VI. High fat diet + 0.5% A6 powder VII. High fat diet + 0.5% A7 powder VIII. High fat diet + 0.5% A8 powder IX. High fat diet + 0.5% A9 powder X. High fat diet + 0.5% A10 powder (2) 控制組
XI. High fat diet (Positive control) XII. Basal diet (Negative control)
4. 實驗進行 4 週後，動物禁食空腹 12-14 小時，以 pentobarbital (40 mg/kg， IP)麻醉後所有動物均由心臟採血，血液離心後收集血 漿 ， 採 用 酵 素 法 在 Olympus AU-640 醫 學 檢 驗 儀 器 檢 測 血 中 triglycerides (TG) ， total cholesterol ， LDL-cholesterol 及 HDL-cholesterol 的含量。而 VLDL-cholesterol 依下列公式計算之：
VLDL-cholesterol ＝ total cholesterol-(LDL-cholesterol + HDL-cholesterol)。
(二) 預試驗 II
1. 目的：採用不同組成 KDS718 複方，給予餵食高脂肪飼料的 動物，找出最佳降血脂配方。
2. 動物飼料：
High fat diet：Basal diet + 0.2% cholesterol + 5% lard oil Basal diet：Hamsters basal diet
3. 方法：4~5 週雄性倉鼠飼養一週後隨機分組並開始進行實驗，
10 種 KDS718 複方分別是 B1~B10，混合在粉狀飼料中，供倉鼠自
由攝取，每組3 隻，共 12 組，進行四週，分組如下： XII. Basal diet (Negative control)
4. 實驗進行 4 週後，動物禁食空腹 12-14 小時，以 pentobarbital (40 mg/kg， IP)麻醉後所有動物均由心臟採血，血液離心後收集血 漿 ， 採 用 酵 素 法 在 Olympus AU-640 醫 學 檢 驗 儀 器 檢 測 血 中 triglycerides (TG) ， total cholesterol ， LDL-cholesterol 及 HDL-cholesterol 的含量。而 VLDL-cholesterol 依下列公式計算之：
VLDL-cholesterol ＝ total cholesterol-(LDL-cholesterol + HDL-cholesterol)。
(三) 正式實驗
1. 目的：試驗 KDS718 (預試驗的 B8 組成複方)是否可降低高脂 肪食物所引起的高血脂。
2. 動物飼料：
High fat diet：Basal diet + 0.2% cholesterol + 5% lard oil Basal diet：Hamsters basal diet
3.方法：4~5 週雄性倉鼠飼養一週後隨機分組並開始進行實驗，
高、中、低三種劑量的KDS718 配方，分別混合在粉狀飼料中，供 倉鼠自由攝取，每組12 隻，共 4 組，進行 12 週，分組如下：
I. Basal diet (Negative control) II. High fat diet (Positive control)
III. High fat diet + 0.1% KDS718 powder IV. High fat diet + 0.5% KDS718 powder V. High fat diet + 1% KDS718 powder
4. 實驗進行 6 週後，每組的一半動物(6 隻)禁食空腹 16 小時，
以pentobarbital (40 mg/kg， IP)麻醉後所有動物均由心臟採血，血 液離心後收集血漿，採用酵素法在 Olympus AU-640 醫學檢驗儀器 檢測血中 triglycerides (TG)，total cholesterol， LDL-cholesterol 及 HDL-cholesterol 的含量。使用 Olympus AU-400 儀器測量 GOP 及 GTP 的含量。部分血漿保存於-80ºC 冰櫃中，待分離 LDL，再檢測 LDL oxidation。
5. 實驗進行 12 週後，每組的另一半動物(6 隻)禁食空腹 16 小 時，以pentobarbital (40 mg/kg, IP)麻醉後所有動物均由心臟採血，
血液離心後收集血漿，採用酵素法在 Olympus AU-640 醫學檢驗儀 器檢測血中 triglycerides (TG)，total cholesterol， LDL-cholesterol
及HDL-cholesterol 的含量。而 VLDL-cholesterol 依下列公式計算之：
VLDL-cholesterol ＝ total cholesterol-(LDL-cholesterol + HDL-cholesterol)。使用 Olympus AU-400 儀器測量 GOP 及 GTP 的 含量。分離心臟及主動脈弓，保存於福馬林中，之後包埋切片，再 染以HE stain。收集肝組織，保存於-80ºC 收集肝組織，保存於-80ºC。
部分血漿保存於-80ºC 冰櫃中，待分離 LDL，再檢測 LDL oxidation。
6. LDL Oxidation
血清低密度脂蛋白氧化(Serum LDL Oxidation)之測定，採用銅 離子誘導LDL 氧化之延滯期(Lag phase)方法。
(1) LDL 的分離
0.5 ml serum+2.5 ml， 1.020 g/ml NaBr，離心 453，000 x g，3.5 h at 4°C， 之後取出浮於最上層部分約 0.5 ml (VLDL+IDL)丟棄，剩下 之溶液取2.5 ml + 0.5 m 1.230 g/ml NaBr，離心 453，000 x g，離心 3.5 小時，4°C(得總體積 3 ml 溶液。其計算方法為 1.020 g/ml x 2.5 ml+1.230 g/ml x 0.5 ml=1.055 g/ml x 3 ml) ，之後取浮於最上層部分約 1 ml 即為 LDL fraction。LDL fraction 放置於 Desalt column 離心去 鹽去EDTA 後，即可測量其氧化之延滯期。
(2) LDL Oxidation
25 μg/ml LDL 放 置 於 0.5 ml PBS(pH7.0-7.4 之 Phosphate buffered-saline)中，再加入 5 μM CuSO4 以分光光度儀於 OD234 nm 連
續測量5h，測量 conjugated dienes 的形成最大值，不再有明顯變化為 止。計算誘導低密度脂蛋白氧化之Lag phase (以 Propagation phase 的 切線對X 軸之截距代表 Lag phase)。
(四) 附加實驗
1. 目的：試驗 KDS718 (預試驗的 B8 組成複方)是否可降高膽固 醇(0.2% cholesterol)食物所引起的高血脂。
2. 動物飼料：
High cholesterol diet：Basal diet + 0.2% cholesterol.
Basal diet：Hamsters basal diet.
3. 方法：4~5 週雄性倉鼠飼養一週後隨機分組並開始進行實驗，
高、中二種劑量的KDS718 配方，分別混合在粉狀飼料中，供倉鼠 自由攝取，每組3 隻，共 5 組，進行 4 週，分組如下：
I. Basal diet (Negative control)
II. High cholesterol diet) (Positive control) III. High cholesterol + 0.5% KDS718 powder IV. High cholesterol + 1% KDS718 powder V. High cholesterol + 0.1% Statin powder
4.實驗進行 4 週後，禁食空腹 16 小時，以 pentobarbital (40 mg/kg，
IP)麻醉後所有動物均由心臟採血，血液離心後收集血漿，採用酵素 法在 Olympus AU-640 醫學檢驗儀器檢測血中 triglycerides， total cholesterol 的含量。