第四章 實驗材料與方法
第二節 基因安全性評估
壹、沙門氏逆突變試驗(Ames revertant mutagenesis test )
測試樣品以水及 DMSO 萃取後經無菌過濾，以 5000 ug/plate ~ 4.9 ug/plate 等劑量，在含有或不含有代謝活化系統(S9 混合物)的測 試條件下，對 5 種菌株 Salmonella typhimurium TA98、TA100、
TA1535、TA1537 及 WP-2ruvA 等進行 Ames Test 檢測。
一、實驗材料與試劑
1. 測試樣品 KDS718，內容物為棕色粉末。
2. 樣品前處理：
KDS718 粉末樣品以 DMSO 萃取適量樣品，使濃度為 100 mg/ml，將此混濁之 DMSO 萃取液，以桌上型離心機短暫離心後，
取出上層棕色萃取液，經以0.22 μm 無菌濾膜過濾，此時可得棕色 之濾液，濾液再以DMSO 進行稀釋，可得 0.1，0.5，1，2.5 及 5 mg/plate 等五種不同濃度之樣品。
3. 測試菌株：
Salmonella typhimurium TA1537、TA98、TA100、TA1535 及 E. coli
WP-2ruvA 等 5 菌株，皆購自日本 NITE Biological Resource Center。4. S9 混合物(Moltox， USA)由森淼大自然科技有限公司購 入，S9 蛋白質含量為 39 mg/ml。
5. 重要藥品來源：
(1) Ampicillin (AP) 、 -Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP)、Methyl methanesulfonate (MMS)、Biotin 購自 Sigma.
(2) Glucose-6-phosphate (G-6-P) 購自 Fluka.
(3) Rat liver S9 (Aroclor-1254-induced) 購自 Moltox.
(4) 2-Aminoanthracene (2AAT) 、 9-Aminoacridine (9AA) 、 2-Nitrofluorene (NF)、Sodium azide (SA) 購自 Aldrich.
二、實驗方法
前置培養法 (Preincubation method)
1. 將菌株同時活化於 Bio 與 Bio/His 平板，依照菌株之不同使用 含不同抗生素之平板，於37℃培養箱中培養 2 天。菌株應僅生長於 Bio/His 平板，於 Bio 平板中不應生長，若於 Bio 平板中有生長之現 象，則應進行組胺酸需求測試。
2. 將菌株由 Bio/His 平板上接種入固體培養基(LB agar)平板(含 AP 或不含抗生素)，置於 37℃培養箱中隔夜培養。
3. 由固體培養基平板上挑一菌落，皆種入 5ml 之液體營養培養
基(LB broth)(含 AP 或不含抗生素) 中，置於 37℃培養箱中震 (250rpm)培養 12~16 小時收菌。
4. 取 0.1ml 新鮮培養之菌液置於試管中，依序加入 0.5ml 之 S9 mix(不加 S9 者以 Buffer 取代)及測試樣品或陰性、陽性對照組。各 菌株使用之陽性對照藥劑如下：TA98 使用 2-Aminoanthracene (5 μg/plate, w/ S9)及 2-Nitrofluorene (20 μg/plate, w/o S9)；TA100 使用 2-Aminoanthracene (5 μg/plate,w/ S9)及 Sodium azide (5 μg/plate, w/o S9)；TA1535 使用 2-Aminoanthracene (5 μg/plate,w/ S9)及 Sodium azide (5 μg/plate, w/o S9)；TA1537 使用 2-Aminoanthracene (5 μg/plate,w/ S9)及 9-Aminoacridine(100 μg/plate,w/o S9)；WP-2 urvA 則用2-Aminoanthracene (5 μg/plate,w/ S9)及 Methyl methanesulfonate (500 μg/plate,w/o S9)。
5. 添加完各試劑，將試管置於 37℃培養箱中震盪(150rpm)培養 3 分鐘。
6. 將 Top agar(含 10％之 0.5mM Bio/His solution)加熱使其成溶 融態後，置於45℃水浴槽中保溫備用。
7. 取出試管，加入 2ml 溶融態之 Top agar(已含 10％之 0.5mM Bio/His solution)於混合液中，震盪均勻，鋪在已製備好之平板上。
所有菌株皆使用Minimal Glucose Plate。
8. 將平板正放待凝後，置於 37℃培養箱中到置培養 48-72 小時。
9. 逆突變菌落數計算：每樣測試樣品皆須測試 S9 混合物存在與 否時的致突變能力，且需三重複，求其逆突變菌落數之平均值。
三、結果分析與判定
1. 測試樣品對細菌造成之逆突變菌落數與陰性對照組有統計上 之明顯差異，至少有一劑量高於2 倍以上，且劑量與反應呈正相關 性者，均視為具有逆突變正反應作用。
2. TA98, TA100, WP-2ruvA 菌系任一劑量之回復突變數高於自 然回復突變菌落數(spontaneous revertants) 2 倍以上；或 TA1535, TA1537 菌系之回復突變數高於自然回復突變菌落數 3 倍以上，則判 定其致突變性屬正反應。
貳、鼷鼠淋巴瘤tk 分析
KDS718 樣品粉末以 DMSO 溶解過濾後，在含有或不含有代謝 活化系統(S9 混合物)的測試條件下，對鼷鼠淋巴瘤細胞株之 tk 基因 突變頻率進行分析。
一、實驗材料與試劑
1. KDS718 溶於 DMSO 中，濃度分別為 0.5 mg/ml,1 mg/ml, 10 mg/ml 及 50 mg/ml(1000×)，取上清液，過濾去菌後備用。
2. 細胞株：本實驗所使用之細胞株名稱為 L5178YTK+/- (編號為 BCRC 60112)，為鼷鼠淋巴球細胞(mouse lymphoma cell)，來源自食 品工業發展研究所生物資源與保存中心(新竹)。細胞培養條件為 37℃，5％ CO2。
3. 細胞培養基配製
DM00 ： DMEM medium without fetal bovine serum (FBS ， Biological Inc.)
DM05：DMEM medium with 5％ FBS 及 0.1％Pluronic F-68 (F-68, Sigma)
DM10：DMEM medium with 10％ FBS 及 0.1％Pluronic F-68 DM20：DMEM medium with 20％ FBS 及 0.1％Pluronic F-68
4. 代謝活化系統：
(1) S9 混 合 物 (Lot#1452, Aroclor 1254-induced rat liver., MoltoxTM,USA)由森淼大自然科技有限公司購入，該產品 S9 蛋白質 含量為38.7 mg/ml。
(2)S9 混合物之配製：組成為 5％ S9 混合物與 DMEM 含 2.4
salt,Sigma,N-0505, MO. USA) and 4.5 mg/ml isocitrate (trisodium salt, Sigma I-1252)，使用前新鮮配製。
5. 去除自發性突變試劑(HMT medium， 100X stock)
Hypoxanthine (Sigma， Cat#H-9636)： 68 mg 溶 於 100 ml DM00，過濾滅菌。
Methotrexate (Sigma， Cat#M-8407)：1.8 mg 溶於 10 ml 5％碳酸 鈉溶液過濾滅菌，再以DM00 稀釋至 18 μl/ml。
Thymidine (Sigma， Cat# T1895)： 12.1 mg 溶於 100ml DM00 中。
6. 致突變劑配製(100X stock)
Methyl methanesulfonate (MMS， Sigma， Cat#M4016)： 100 mg 溶 於 10 ml DMSO 中 ， 以 nylon 之 過 濾 滅 菌 膜 過 濾 滅 菌 Cyclophosphamide (CP， Sigma， Cat#29875)： 30 mg 溶於 10 ml DMSO 中，以 nylon 之過濾滅菌膜過濾滅菌
7. 篩選劑的配製(100X stock)
Trifluorothymidine (TFT， Sigma， Cat#T-2255)： 50 mg 溶於 D-PBS 中，過濾滅菌
8. 去除自發性突變
L5178Y TK+/-細胞株，解凍後經一次繼代培養，以 HMT medium 處理3 天，再換成正常培養基去除自發性突變株。
二、實驗方法
1. 細胞毒性測試(cytotoxicity test)：
(1)KDS718 粉末樣品以 DMSO 萃取適量樣品，使濃度為 100 mg/ml，將此混濁之 DMSO 萃取液，以桌上型離心機短暫離心後，
取出上層棕色萃取液，經以0.22m 無菌濾膜過濾，此時可得棕色之 濾液，濾液再以 DMSO 進行稀釋，可得 0.5，1，10，及 50 mg/ml 等四種不同濃度之樣品 (1000 X stock)。
(2)將不同濃度的 KDS718 樣品，在含有 S9 混合物(代謝活化)與 不含S9 混合物(無代謝活化)下加入細胞中，最終濃度分別為 5、2.5、
1.25 mg/ml，於 37℃，5％ CO2培養48 小時，將細胞液取出以 Trypan blue 計算細胞存活率。
(3)細胞毒性結果判讀
存活率百分率計算＝活細胞數/活細胞數＋死細胞數
當存活率百分率＞90％，樣品沒有細胞毒性；若樣品具有細胞 毒性，以存活率百分率＝20％或 5 mg/ml 為測試最高濃度。
2. 細胞基因毒性試驗
(1)細胞基因試驗分別於含有 S9 混合物(代謝活化)與不含 S9 混 合物(無代謝活化)下進行。在不含有 S9 代謝活化系統的陽性對照
對照組為CP，使用劑量為 3 μg/ml。
(2)細胞活化去除自發性突變後，將不同濃度的樣品加入細胞中 (1000 X 稀釋)，於 37℃，5％ CO2下培養 4 小時，將細胞液取出，
以離心800rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 DM00 培養基清洗 兩次去除樣品後，再以DM20 培養基調整細胞濃度為 2×105 cell/ml 種於T25 flask，每個 T25 flask 加入 10 ml 的細胞培養液，於 37℃，
5％ CO2培養48 小時。
(3)以 DM20 培養基將細胞稀釋成 8 cell/ml，並以 200 μl/well 的 量，1.6 cell/well 之細胞濃度，培養於 96 well 平盤三盤，在 37℃，
5％ CO2培養12 天。另以含有 7.5 ug/ml TFT 篩選劑的 DM20 培養 基將細胞稀釋成1×104 cell/ml，以 2000 cell/well 之細胞濃度，培養 於96 well 平盤三盤，在 37℃，5％ CO2中，靜置培養 12 天(培養 期間可不用更換培養基)。
(4)培養 12 天後，以肉眼觀察並計算形成細胞群落的孔數
(5) 計 算 zero term of Poission distribution P(0) 、 plating efficiency(P.E.％)、cloning efficiency(C.E.％)及 control％等。
Plating efficiency (P.E.％)： 指的是 96 well 平盤中，每 well 1.6 顆的 細胞經一段生長時間後的健康指標。
P(0)= number of empty wells/ total wells plated P.E.％= (-lnP(0)/number of cells per well) × 100％
Cloning efficiency (C.E.％)： 指的是 96 well 平盤中，每 well 兩千顆 的細胞經TFT 篩選突變株後並經一段生長時間，突變細胞是否有長 起來的一種指標。
P(0)= number of empty wells/ total wells plated C.E.％= (-lnP(0)/number of cells per well) × 100％
M.F. per survival：指的是每十萬顆存活細胞可能發生突變的頻率。
M.F. per survival= C.E.％ in selective medium/ P.E.％ in non-selective medium
三、統計分析與結果判定
1. 96 孔微盤以肉眼觀察細胞聚落形成的孔數，經統計計算出其 mean±S.D.。測試樣品對細胞造成之基因突變頻率(%)超過陰性對照 組2 倍以上，且有劑量與反應正相關性者，視為具有基因毒性反應。
參、小鼠周邊血液微核試驗
以雄性小鼠(ICR 品系)餵食 0.5、2.5 及 5 g/kg 劑量之受測物
「KDS718」經 48 小時後，觀察其周邊血液並計數網狀紅血球 (reticulocytes)中微核產生比例之差異。
一、實驗材料與試劑
1. 測試樣品 KDS718，內容物為棕色粉末。
2. 抗體 CD71-FITC (Abcam ab-33996)
3. ICR 雄性小鼠、6~8 周齡，購自樂斯科生技園區實驗動物培 育及研發中心(宜蘭，台灣)。
4. 環磷醯氨(Cyclophosphamide， Sigma C-0768) 5. 餵管(長 8 cm，內徑 1 mm)
6. 流式細胞儀(Flow cytometric-BD FACScalibur) 7. Heparin 抗凝劑(Sigma H-5515)
二、實驗方法
1. 動物品種及性別： ICR 雄性小鼠(6-8 週齡)購自樂斯科公司。
2. 飼養管理
實驗動物依照台北醫學大學實驗動物中心飼養管理方法進行：動 物飼養環境設定為23 ± 2℃、12 小時光照/黑暗、60 ± 10％相對溼 度，不限制飼料(LabDiet 5010/美國 Purina 公司生產)及飲水。
3. 動物數量： 五組實驗動物、每組 5 隻、共 25 隻。
4. 劑量範圍
以衛生署健康食品安全評估方法中，口服急毒性試驗一次給予試
驗物質之極限測試劑量5 g/kg 動物體重為設計依據，配製三種劑量 之受測物：低劑量0.5 g/kg、中劑量 2.5 g/kg 及高劑量 5 g/kg，中、
高劑量分別為低劑量的5 倍與 10 倍。
5. 空白組、實驗組、陰性對照組、陽性對照組
以無菌水作為陰性對照組(NC)，受測物 KDS718 溶於無菌水作 為實驗組，環磷醯氨(cyclophosphamide)溶於無菌水作為陽性對照組 (PC)。環磷醯氨為一已知致突變劑，不僅會增加具有微核之網狀紅 血球比例，且會影響紅血球生長過程之代謝機制，導致周邊血液中 網狀紅血球與正常成熟紅血球之比例較陰性對照組顯著減少，在本 試驗中給予劑量為100 mg/kg。
6. 受測物給予途徑及頻率： 餵管餵食一次 KDS718。
7. 試驗步驟及觀察
(1) 分組： ICR 小鼠(雄性)購進後觀察其健康情形及生長狀況，
一週後分組進行實驗。
(2) 灌食： 受測物依上述劑量每隻 ICR 小鼠低、中、高劑量分 別灌食0.05 ml、0.25 ml 及 0.5 ml，相當於 0.5、2.5 及 5 g/kg 動物體 重，陽性對照藥劑(20 mg/ml)對每隻小鼠投予 0.2 ml(相當於 100 mg/kg 劑量)。
(3) 檢體處理與分析
灌食 48 小時後，自小鼠眼窩採血。以 Flow cytometer 進行測試 分析，步驟如下：採集小鼠血液至少150μl，置於含 heparin 之離心 管中；從其中取出 100μl 血液加入 500μl 稀釋液(500 USP units heparin/ml PBS)中混合均勻；再從其中取出 450μl 經稀釋之血液，
離1 cm 處快速打入 5 ml， -80℃之乙醇固定至少 24 小時，之後取 1 ml 固定好之樣品加入 13 ml PBS，經離心(600 x g，5 min)，去除 上清液後打散細胞，取 35μl 細胞懸浮液加入 2μl RNase 與 10μl 抗體 (CD-71-FITC)，室溫反應 30 min 後以 PBS 清洗細胞，再加入 1 ml PI buffer (1.25μg propidium iodide/ml PBS)，隨即以流式細胞儀(Flow cytometric-BD FACScalibur)檢測 10,000 顆網狀紅血球，並以 Cell Quest 軟體進行分析，計算發生微核-網狀紅血球與網狀紅血球佔全 部紅血球的比例。
三、統計分析與結果判定
1. 每隻動物收集 50,000 顆紅血球，分析發生微核–網狀紅血球的 比例(％)(微核–網狀紅血球／網狀紅血球)，同時計算網狀紅血球佔 全部紅血球的比例(％)。
2. 實驗結果之數據以平均值(Mean)±標準差(SD)來表示，依 one-way ANOVA 進行統計，以 Duncan's multiple range test 進行各處
理組間之比較。若P 值小於 0.05，則表示劑量組與對照組之間有顯 著性差異。