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最後，以同時進行電泳的DNA 標記(DNA marker)作為判斷欲分離基因片 段的位置所在，並將該位置的凝膠切除後進行純化即完成基因的分離20。
(三) 互補 DNA 的製備
如前所述當基因欲表現及進行生物功能時，需藉由相關酵素的輔助 進行轉錄和轉譯的作用，以生成多肽或蛋白質始能為之。而在轉錄的過 程中，前文亦有提及當轉錄後的pre-mRNA 經由 RNA splicing 的作用而 去除內含子(intron)此不具外顯性生物功能的序列片段，此即代表真正涉 及生物功能表現與否的基因片段主要乃外顯子(exon)。而由於單細胞生物 本身並未區分exon 和 intron 而不具有 RNA splicing 的作用21，則倘欲轉 化特定基因於單細胞生物如大腸桿菌時，實有必要將 intron 的部分去 除。又，因RNA 具有於細胞中容易被分解之性質，從而有必要將其製備 成雙股型態的DNA。從而，此等雙股且僅具備外顯子的 DNA 之製備過 程，乃先分離純化細胞中所含有的 RNA，再置入具有 poly-T 之模板 (template)，以辨認帶有 poly-A 的且已經 RNA splicing 作用後而不具 intron 的mRNA，再運用反轉錄酶(reverse transcriptase)的催化作用，並加入相 關合成DNA 之素材，使 mRNA 反轉錄回 DNA 型態。最後再將原先的 RNA 分解後並加入 DNA 聚合酶(DNA polymerase) 和 DNA 之素材，使 該單股型態的 DNA 合成變為雙股型態則即告完成。此時，該經反轉錄 後的雙股DNA 因不具有 intron 部分的序列且與 mRNA 的序列為互補之 關係，而被稱之為互補DNA(complementary DNA，簡稱 cDNA)22。
(四) 基因片段的大量合成
基因序列片段的用途主要來自其所含的生物功能，且在實際上需要 以物質的形態存在始得實施。惟，分子生物技術之所以分子代稱係緣於 此等物質本身分子量極小，並其影響的生物機制運作亦存在於分子化學 結構間的微觀互動所生。故而於實驗中進行和觀察需求以及研究或醫療 應用上，皆有其必要放大其所生的生物功能，而尚需運用相關技術將特 定基因序列片段的數量增加。
最廣為人知且於研發單位最為常用的技術者，乃聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，簡稱 PCR)。此係透過於生物體外循環實施 溫度調整以及 DNA 聚合酶的作用的步驟，進而將特定基因片段數量以 二次方的指數倍增。具體而言，將欲定序的 DNA 片段、特定基因序列
20 Id. at 740-43.
21 Id. at 415.
22 Id. at 748-49.
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的單純分離的或互補DNA 作為合成模板加入溶液中，並一同加入 DNA 聚合酶、合成DNA 的素材以及特別訂做的引子(primer)。此等引子亦係 去氧核醣核酸且其序列和部分模板的序列相同，而能與合成標的進行互 補，進而增加合成效率。實驗過程中係將溫度調高使合成 DNA 標的的 雙股結構解開而形成個別單股結構，再降溫使引子得附著上DNA 標的，
同時DNA 聚合酶開始合成作用，當完成合成時 DNA 標的之數量就成為 原先的2 倍。只要依循此等實驗加以循環，即得使特定基因片段的數量 大量增加23。
除上述方法以外，另亦能透過仰賴特定模式生物其生長週期和相對 應之細胞週期(cell cycle)較短之特性，代表其等的自體 DNA 複製亦較為 頻繁，而將特定基因序列經轉化作用植入模式生物的基因體中，使其伴 隨著模式生物的自體DNA 複製，進而增加該基因序列的數量24。
第三目 基因改良之生物材料 一、 基因重組生物和其生產之蛋白質
基因重組技術(recombinant DNA technology)之內涵，係指透過酵素的使 用，將所欲連結的基因以分子生物技術組合之，並使模式生物擁有該重組基 因並自行複製該基因或表現該基因並產生相關之生物功能而言25。此技術首次 突破性的實踐，乃Boyer 和 Cohen 等科學家於 1973 嘗試在生物體外透過限制 酶和DNA 連結酶(DNA ligase)等實驗室操作，將真核細胞(eukaryotic cell)的基 因片段與大腸桿菌的質體DNA 相連結並轉化進大腸桿菌之中，再經由抗生素 篩選確定成功轉殖且得以表現之26。依此，發明人等所屬之史丹佛大學將此研 究成果申請專利27。爾後，於1979 年 Boyer 和 Itakura 科學家合作，以前述基 因重組方法將帶有表現人類胰島素(insulin)之 A、B 鍊(A、B chain)的人工合 成DNA 和經設計的質體分別相連結，並轉化於大腸桿菌中表現。接著，再運 用純化技術後將胰島素蛋白的A、B 鍊相結合，即可生產製造胰島素28。由於 胰島素得提供糖尿病(diabetes)患者輔助儲存其血糖以減緩相關併發症的發
23 Id. at 751-52.
24 Id. at 758-762.
25 Nature Education, Definition of the Recombinant DNA technology, available at
http://www.nature.com/scitable/definition/recombinant-dna-technology-dna-cloning-gene-cloning-7 (last visited: 01/05/201http://www.nature.com/scitable/definition/recombinant-dna-technology-dna-cloning-gene-cloning-7)。該原文為”A technology that uses enzymes to cut and paste together DNA sequences of interest. The recombined DNA sequences can be placed into vectors that carry the DNA into a host cell. In this host cell, the customized recombined DNA sequence can be copied or translated.”
26 Stanley N. Cohen et al., Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro, 70 PROC.NAT.ACAD.SCI. USA 3240, 3240-44 (1973).
27 US 4237224, PROCESS FOR PRODUCING BIOLOGICALLY FUNCTIONAL MOLECULAR CHIMERAS, filed at January 1979.
28 Keiichi Itakura et al., Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin, 76 PROC.NATI.ACAD.SCI. USA 106, 106-110 (1979).
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又名為免疫球蛋白(immunoglobulin)，是由人體免疫系統(immune system)中的 漿細胞(plasma cell)所製備，其形狀上成一 Y 字形的蛋白結構，其中上半部端 點處含有辨識抗原(antigen)的抗原連接處(antigen-binding site)。其免疫機制乃 因抗原多是以外來細菌或病毒本身存有的蛋白質，而抗體則會辨認該抗原而
由上所述，基因重組等分子生物技術實得做為蛋白質生產和合成(protein production and synthesis)之用，並且經基因工程所製備的具有醫療功效之生物 材料，又可作為生物製劑或生技藥品之用途32。實而，現今技術趨勢多以醫療
29 EP 0055945 A2, Human proinsulin and analogs thereof and method of preparation by microbial polypeptide expression and conversion thereof to human insulin, filed at December 1981 but withdraw at December 16th 1986.
30 Chemical Heritage Foundation, Herbert W. Boyer and Stanley N. Cohen, (2015), available at http://www.chemheritage.org/discover/online-resources/chemistry-in-history/themes/pharmaceutic als/preserving-health-with-biotechnology/berg-boyer-cohen.aspx (last visited: 01/05/2017);
Genentech, Our Founders, available at http://www.gene.com/about-us/leadership/our-founders (last visited: 01/05/2017).
31 Alexander E. Karu et al., Recombinant Antibody Technology, 37 ILAR J 132, 132-36 (1995). See also Bernald R. GLICK et al., MOLECULAR BIOTECHNOLOGY :PRINCIPLES AND
APPLICATION OF RECOMBINATION DNA, 337-341 (4th ed.2010).
32 U.S. Food and Drug Administration, What are “Biologics” Questions and Answers, available at http://www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/OfficeofMedicalProductsandTobacco/CBER/ucm1 33077.htm (last visited: 01/05/2017).
33 Germán L. Rosano et al., Recombinant protein expression in microbial systems, 5 FRONTIERS IN
MICROBIOLOGY A(341) 1, 1(2014).
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二、 基因轉殖生物
在前述基因與生物功能之關聯研究一節中，敘及需要利用模式生物以進 行相關實驗進而研究並證明其中的關聯性，以及後續該生物功能對於生物的 生理狀態和疾病發展的影響。而在該相關實驗中區分為生物體外(in vitro)和生 物體內(in vivo)兩類，前者實驗乃係使用細胞株或是低階模式生物以減少不確 定之變因，進而較易從研究結果中解讀基因和生物功能表現與否的因果關 係；後者則是透過於哺乳類動物體內進行實驗，藉由仔細觀察其經分子生物 技術處理後的各種生理和疾病狀況的改變，進而判斷該基因的生物功能的後 續影響機制或是尚有其他可能的生物功能。而兩類的實驗亦須運用前目所述 之大量表現、降低表現或剔除的實驗方法來驗證觀察的結果和基因的關聯 性，其等實驗方法在生物體外的運用上較為簡易，得透過擇選高或低表現量 的啟動子並於其後接上特定基因序列，或甚至切除該基因序列的方式即可，
惟於生物體內者則須透過則需運用基因轉殖方法(transgenic methodology)。
基因轉殖技術，有別於以傳統生物學方法透過誘發突變和繁殖等以製造 帶有特定性狀之生物，其係運作病毒的載體(retroviral vector)、顯微注射技術 (microinjection)或細胞核轉移技術(nuclear Transfer)，將設計好的重組基因片段 或基因組，轉染(rransfection)、植入或替換生物體受精卵(zygote)發育早期的 胚胎幹細胞(embryonic stem cell)、配子細胞(germ cell)或體細胞(somatic cell) 的細胞核，進而使細胞得以表現該特定基因。接著，再將此經基因轉殖的受 精卵重新植入母體予以發育成體，此時該成體的相關細胞則皆帶有此等特定 基因，依此即可透過該經基因轉殖後的生物觀察該特定基因影響其發育過 程、生理狀況和相關病理反應34。是以，基因轉殖生物因本身具有高度研究傾 向，於1984 年哈佛大學所屬的科學家 Philip Leder 等人則製備直接轉殖致癌 基因(oncogene)予非人類的哺乳類動物的胚胎細胞(embryo)或受精卵(fertilized oocyte)中，進而誘發癌症以利觀察其機轉和篩選有醫療效果之物質，並申請 專利保護之35，又被俗稱為哈佛鼠(oncomouse)。
除上述將基因轉殖進生物體表現外，亦有需仰賴特別之技術始能將特定 基因降低表現或剔除以觀察該基因於生物體內的運作和影響。而該技術常用 有二，一為使用干擾RNA(interference RNA，簡稱 RNAi)，另一則為 Cre–loxP 重組系統(Cre–loxP Recombination System)。前者作用機制之主體係透過 RNA 分解酶(RNase)分解環狀的 mRNA 或是雙股 RNA 而產生小干擾 RNA(small interfering RNA，簡稱 siRNA)、被轉錄之 microRNA(MicroRNA，簡稱 miRNA) 以 及 特 定 蛋 白 質 共 同 組 合 而 成 的 RNA 誘 導 沉 默 複 合 體 (RNA-inducing silencing complex，簡稱 RISC)。此 RISC 得透過 siRNA 和 miRNA 辨識欲分 解的RNA 序列進而將其分解，以達到抑制轉譯作用的發動。此外，RISC 尚
34 GLICK et al., supra note 31, at 845-56.
35 US 4736886 A, Transgenic Non-human Mammals, filed at June 1984.
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得透過進入細胞核而促使染色體DNA 製造更多的雙股 DNA 以回饋增加 RISC 的數量，以增強分解特定RNA 和抑制轉錄的效果36。從而，當瞭解上述的機 制後，即得設計一同時包含特定基因序列且與該序列互補之基因片段，使其 被轉譯時得以因鹼基互補性而形成雙股之結構，而其形狀類似髮夾(一邊因轉 曲而封閉，另一邊則無)，而又名為小型髮夾 RNA(shRNA)。依此，當將此設 計後的序列透過病毒載體轉染近細胞內表現時，則得透過上開作用機制辨識 生物體內的特定基因片段所轉譯的RNA，進而抑制其生物功能的運行。此外，
亦可透過針對該設計片段中前端的啟動子進行調控，進而調整抑制的效果37。 而後者所使用得生產Cre 重組酶(Cre recombinase)的 Cre 序列和被 Cre 重 組酶辨識的 loxP 序列皆源自於嗜菌體 P1(bacteriophage P1)。其作用機制乃當 兩個 loxP 序列方向相反時，Cre 重組酶會辨識之並將兩個 loxP 序列之間的序 列倒轉(inversion)；而在兩個 loxP 序列方向相同時 Cre 重組酶則會將其之間的 序列切除(excision)。依此，即可透過序列設計將兩個 loxP 序列設定為同方向 並含欲剔除的基因片段，利用此等 Cre 重組酶會辨識並切除之機制，於轉殖
亦可透過針對該設計片段中前端的啟動子進行調控，進而調整抑制的效果37。 而後者所使用得生產Cre 重組酶(Cre recombinase)的 Cre 序列和被 Cre 重 組酶辨識的 loxP 序列皆源自於嗜菌體 P1(bacteriophage P1)。其作用機制乃當 兩個 loxP 序列方向相反時，Cre 重組酶會辨識之並將兩個 loxP 序列之間的序 列倒轉(inversion)；而在兩個 loxP 序列方向相同時 Cre 重組酶則會將其之間的 序列切除(excision)。依此，即可透過序列設計將兩個 loxP 序列設定為同方向 並含欲剔除的基因片段，利用此等 Cre 重組酶會辨識並切除之機制，於轉殖