第一章 緒 論
第七節、 本論文之研究目的與策略
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第七節 本論文之研究目的與策略
由於已知 laminin β1 會在海馬迴中表現，然而至今尚不清楚其在學習記 憶中所扮演的角色及是否還透過其他下游訊息傳遞分子調控學習記憶的形
成。近來 SGK 在學習記憶中的研究逐漸萌芽，回顧實驗室先前的研究結果
顯示在水迷津試驗中學習較佳的大白鼠 SGK1 的表現較多，若是轉染突變
型 SGK S422A 質體則顯著地抑制大白鼠的空間學習記憶。此外，若是缺 少 ERK1/2 不只會影響長期增益效應；更顯著地影響動物於水迷津空間學 習試驗。本實驗室也證實 ERK1/2-SGK 的訊息傳遞路徑參與了大白鼠的空 間記憶學習，但是 laminin β1 是否會經由 ERK1/2-SGK 進而影響學習記憶 仍不清楚。因此，我們想確認 laminin β1 是否參與空間學習記憶的形成及 其是否透過 ERK1/2-SGK1 的訊息傳遞路徑進而影響空間記憶的形成。主 要研究的內容如下：
一、確認空間記憶的形成是否會影響 laminin β1 的表現量。
二、探討抑制大白鼠海馬迴CA1 區域 laminin β1 的表現是否影響水迷津試 驗學習的能力。
三、若是轉染laminin β1 質體至大白鼠海馬迴 CA1 區域是否也會影響大白 鼠的空間學習記憶。
四、如果 laminin β1 參與空間記憶的形成，那麼抑制或是促進 laminin β1 的表現可能會活化哪些分子。
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五、若是 ERK1/2 及 SGK1 會受到 laminin β1 的表現影響，那麼抑制大白 鼠海馬迴 CA1 區域 SGK1 的活化，是否會阻斷 laminin β1 的訊息傳遞 進而影響空間記憶的形成。
六、為了確認 laminin β1 是否會透過 ERK1/2 影響 SGK1 的磷酸化，利用 MEK 抑制劑抑制大白鼠海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化，確認是 否會阻斷 laminin β1 將訊息傳遞至 SGK1 進而影響空間記憶的形成。
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第二章
實驗材料與方法研究
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實驗材料與方法研究
第一節 實驗動物
本論文選用 Spraque-Dawley 品系之雄性大白鼠 (購自樂斯科, Bio LASCO Taiwan Co., Ltd)，年齡約八週大，體重介於 250~400 克之間。由 中央研究院生物醫學研究所動物房飼養與管理。動物房之室內溫度維持在 25±1 ℃，晝夜循環的設定為 12/12 小時，早上 8 時到下午 8 時為白晝。手 術後，將大白鼠飼養於籠中，充分給予飼料與飲水。實驗人員的操作遵照 (中 央研究院生物醫學研究所實驗動物手冊) 之規定進行。
第二節 水迷津學習試驗 (Morris water maze learning) 一、實驗儀器
水迷津學習試驗使用直徑 2 公尺、高 0.6 公尺的塑膠製圓形水池，池內 注入約 20 公分高的水，水溫控制在 25±2 ℃，在水池邊緣約 30 公分的固 定處放置一個透明平台 (直徑約 8 公分左右) ，水池內的水加入奶粉使其為 白色不透明混濁狀，在實驗進行的房間周圍放置兩個的訊號 (cue)，指引出 此訊號與平台間的空間關係。
二、隱藏式平台 (hidden platform)
隱藏式平台水迷津試驗最早是由 Morris 於 1984 年所提出的。在測試 時，將平台固定於水池邊緣30 公分處，此平台的頂部約低於水面 1.5 公分，
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將大白鼠面向池壁放入水中，允許其在池中自由游動直到找到平台並站立 其上為止，大白鼠從放入水池中到站立於平台上的時間記錄為逃離時間 (escape latency) ，逃離時間之上限為 60 秒，若大白鼠無法在 60 秒內找到 平台，則由實驗者將大白鼠自水中取出直接放在平台上。不論大白鼠是自
行尋獲平台或是被實驗者置於平台上，均在平台上停留 20 秒，如此構成一
個學習嘗試 (trial)。每三個學習嘗試為一個學習區段 (session)，每日進行一 個學習區段，在此三個學習嘗試中，大白鼠每次入水的位置都在不同的象 限中，並以隨機方式決定入水位置之象限順序。大白鼠在被放入有平台的 水池中進行訓練嘗試，記錄大白鼠逃離到平台的時間，以作為學習記憶好 壞的指標，若大白鼠對平台位置之空間學習記憶愈好，則將會愈快找到平 台，逃離時間因而愈短。在連續四天的學習嘗試之後，於第五天進行探測 試驗 (probe trial) ，將水池內的平台取出，保留原本牆壁上的空間線索，將
大白鼠放入池中游泳 60 秒，並利用攝影機連接行為測試軟體，記錄大白鼠
的游泳軌跡、速度、穿越平台的次數和停留在平台所在象限區域的時間。
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三、可見式平台 (visible platform)
為了確認所轉染的質體DNA 或是 siRNA 是否會造成個體動物於視覺區 辨能力 (visual discrimination) 和運動協調性 (motor coordination) 上的受
損，在測試時，將平台固定於水池邊緣 30 公分處，此平台的頂部高於水面
2.5 公分，並在平台上插上顏色鮮豔的旗子，牆面四周貼上顏色鮮艷及形狀 各異的幾何圖案當作尋找平台的線索，大白鼠面向池壁放入水中，允許其 在池中自由游動直到找到平台並站立其上為止，每天進行三個學習嘗試為 一個學習區段 (session)，連續進行四天，共 12 個學習嘗試，並記錄每個 學習嘗試的逃離時間 。
四、組織解剖
大白鼠在行為實驗測試後立即斷頭犧牲取出全腦，取出來的腦先浸泡於 4 ℃的磷酸鹽緩衝液 3 至 5 分鐘，於冰台上進行解剖。利用腦組織切割器 (brain slicer) 將腦組織以冠狀切面分割出 6 片，每片腦組織厚度 0.2 mm，
再以不鏽鋼管 (外徑 0.63 mm, 內徑 0.33 mm) 取出雙側的海馬迴 CA1 區 域、紋狀體 (striatum) 及杏仁核 (amygdala)，取出組織後立即以乾冰冰凍 起來，並儲存於-80 ℃冰箱中。
第三節 海馬迴內基因轉染作用 一、立體定位手術
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選 取 約 八 週 大 的 大 白 鼠 ， 進 行 腦 部 立 體 定 位 手 術(stereotaxic surgery) 。手術前，先注射麻醉劑巴比妥鹽 (sodium pentobarbital, 50 mg/kg) 至大白鼠腹腔，待全身麻醉 (足部反射動作消失) 。麻醉後，剃去頭部毛髮，
將其固定於立體定位儀 (stereotaxic instrument) 上，門牙固定桿 (tooth bar) 標高為 -2.4 mm。以手術刀切開頭皮，使頭骨露出，用生理食鹽水止血、
清潔後，以鉛筆定出前囪 (bregma) 的位置。依據大白鼠腦部定位圖譜 (Paxinos et al., 1980)，選擇海馬迴齒狀迴區域的座標。以前囪 (bregma) 為 原點，在其後方 3.5 mm，離中線 2.0 mm 的位置，埋入一根消毒過的不銹 鋼鋼管，往下植入 3.5 mm 至齒狀迴顆粒細胞層上。鋼管以三根螺絲釘及牙 粉固定於頭蓋骨，再放入等長的細鋼絲於鋼管中避免阻塞。待大白鼠醒來，
正常飼養一週後即可進行實驗。
二、Laminin β1 質體製備
建構 pCMV-Flag-laminin β1 質體基因，使用兩段引子 XhoI-laminin β1-F：5’- CCG CTC GAG CAT GGA AAG GCC CCT CTC CTC TCT CC-3’
以及 ApaI-laminin β1-R : 5’-GGG GGC CCT TAT AAG CAG GTG CTG TAA ACG GCA AC-3’ 進行聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) ，將大鼠海馬迴 laminin β1 全長 5490 bp 之互補去氧核糖核酸複製 出來 (附錄三)。將這 PCR 反應的產物接入含有 XhoI 及 ApaI 切位的 pCMV-Flag 載體上，形成 pCMV-Flag-laminin β1 質體。pCMV-Flag-laminin
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β1 質體是由 cytomegalovirus (CMV) 啟動子驅動且能於哺乳類動物細胞表 現 (附錄四) 。
三、Laminin β1-siRNA 與 SGK1-siRNA 的製備
SGK1-siRNA (Wu et al., 2004) 與 Laminin β1-siRNA 序列由 Ambion 合成，使用兩段引子 sgk-1-F：5’-GUC CCU CUC AAC AAA UCA ATT-3’
及 sgk-1-R：5’-UUG AUU UGU UGA GAG GGA CTT -3’ (Yang et al., 2006)。Laminin β1-siRNA 序列合成由 laminin β1-F：5’-GCA UUU CUG CCU UGA UCC ATT-3’及 laminin β1-R：5’-UGG AUC AAG GCA GAA AUG CTG -3’ (附錄六)。Negative siRNA #1(購自 Ambion) 。利用帶正電聚合物 jetSITM 10 mM (購自 polyplus transfection, France) 當作轉染載體，由於其 對細胞的傷害性極低，且可將帶負電的 Negative siRNA(8 pmol/μl)、laminin β1-siRNA (8 pmol/μl) 及 SGK1-siRNA (8 pmol/μl) 包裹住轉染至大白鼠海 馬迴 CA1 的位置 (兩側各注射 0.7 μl)，64 小時後進行水迷津學習試驗測試。
四、質體基因與聚乙烯亞胺 (PEI) 混合物的製備
將質體基因轉染 (transfection) 進入海馬迴 CA1 區域內之前，須先製備 質體和 polyethylenimine (簡稱 PEI) 混合物。首先純化大量的 Flag-laminin β1 質體，以 5 % 葡萄糖將濃度稀釋至 2.7 μg/μl 。將 0.45 μl 的 0.1 M PEI 和 0.55 μl laminin β1 質體 (2.7 μg/μl) 相互混合，並連續震盪 15 秒使其均 勻混合，於室溫下靜置 15 分鐘後，即可進行海馬迴 CA1 區域注射。動物
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在注射DNA/PEI 混合物後 64 小時才開始進行水迷津空間學習的行為實驗。
五、藥物的製備
1、本實驗中所使用的藥物 MEK 的抑制劑 (U0126) 購自 calbiochem (CA) 先 以100 % DMSO 溶解，配成 13.3 μg/μl 的原始濃度，待欲使用前再以生 理食鹽水 (0.9 % NaCl) 稀釋成 2 μg/μl (15 % DMSO)。U0126 在配製或 是注射入大白鼠海馬迴的過程時，需要注意避光。
2、均質緩衝液 (homogenization buffer) : Tris-HCl (50 mM, PH 8.0)、 NaCl (150 mM) 、 EDTA (2 mM)、NP-40 (1 %)、Na3VO4 (1 mM)、NaF (10 mM)、pepstatin A (20 μg/μl)、leupeptin (20 μg/μl)、aprotinin (20 μg/μl) 與PMSF (1 mM)。
3、5X loading dye : Tris-HCL 0.25M (pH 6.8)、DTT 0.5 M、SDS 10 %，
bromophenal blue 0.5 %、glycerol 50 %
4、電泳緩衝液 (running buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、0.1% SDS
5、轉漬緩衝液 (transfer buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、15% methanol
6、TBST : Tris-HCl (25 Mm, pH8.0)、NaCl (150 mM)、0.05% Tween-20 7、PBS (phosphate buffered saline) : NaCl (137 mM)、KCl (2.7 mM)、
KH2PO4 (1.8 mM)、Na2HPO4 (10 mM) 調至 Ph 7.4
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六、海馬迴 CA1 區域注射
將不鏽鋼管連接聚乙烯管 (PE-20)，聚乙烯管再連接至自動幫浦上的 10 μl 的微量注射筒 (Hamilton syringe)。注射前先以酒精擦拭注射針，然後再 將聚乙烯管及注射針充滿蒸餾水，留一個小氣泡於管中後，才將DNA/PEI 混 合物吸入，如此可避免 DNA/PEI 混合物與蒸餾水混合。以每分鐘 0.35 μl 的速度注入，每側 CA1 區域注射 0.7 μl 的 DNA/PEI 混合物。進行水迷津試 驗前 64 小時，先轉染 laminin β1 siRNA，於水迷津試驗進行第二天時，先 注射 0.7 μl 的 laminin β1 siRNA 溶液，並讓大鼠休息 30 分鐘後，再注射 0.5 μl 的 MEK 抑制劑 (U0126, 2 μg/μl) 至海馬迴 CA1 區域。注射完畢後必 須將不鏽鋼管停留在腦中五分鐘以上，才可將注射針取出，避免DNA/PEI 混 合物隨著針頭的拔出而滲出。
第四節 西方墨點法 (Western blot) 一、蛋白質萃取
將均質緩衝液 (homogenization buffer) 加入冷凍的海馬迴 CA1 區域組 織、紋狀體及杏仁核，置於冰上 15 分鐘 。以超音波震盪器 (Sonifer/cell disruptor，Branson Sonic Power Co, U.S.A.) 打碎細胞，使用小型探針 (micro probe)，輸出強度為第三級，輸出效能為 30 %，震盪 10 次。震碎 的細胞再以 14000 rpm 高速離心，於 4 ℃下離心 10 分鐘，以除去細胞殘
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骸與未被震碎的細胞。離心後，取出上清液，此即為組織均質液。
二、蛋白質濃度測定法
本實驗採用 Bio-Rad 公司出品的 protein assay dye reagent 測量所含蛋 白濃度。利用 Brillant Blue G-250 染劑 (Bio-Rad Labtories, USA) 與蛋白質 結合後，其最大吸收光譜會從 465 nm 轉移到 595 nm 之特性，然後以光譜 儀測定 595 nm 的吸光質。以牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 2、
4、6、8 μg/μl 四種濃度，作為推算樣品濃度的參考曲線。因此將樣品適度 稀釋後，取 1 μl 加至 799 μl 的水中，再加入 200 μl 的染劑，五分鐘後測定 蛋白質濃度。
三、免疫沉澱 (immunoprecipitation, IP)
大白鼠海馬迴 CA1 組織加入均質緩衝液 (homogenization buffer) [50mM Tris-HCl (pH7.4)，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 % IGEPAL CA-630，1 mM PMSF， 20 μg/ml leupeptin， 20 μg/ml aprotinin， 50 mM NaF， 1 mM Na3VO4] 於低溫環境下利用超音波震盪器將組織打碎，4 °C 離心 14,000g， 10 分鐘後吸取上清液，將此組織均質液與 20 μl 的 anti-Flag antibody (Sigma) 進行免疫沉澱兩小時，之後離心 1000 ×g 1 分鐘，清除上 清液，用 PBS (phosphate buffered saline) 清洗沉澱物，再次 1000 ×g 離 心 1 分鐘，移除上清液，重複此步驟兩次，將殘留的 buffer 清除，加入 2X loading dye，於 95 °C 加熱 10 分鐘 ，利用西方墨點分析。
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四、西方墨點法 (Western blot)
樣本經蛋白質定量後加入 5X loading dye 於 95 ℃加熱 10 分鐘，將含
樣本經蛋白質定量後加入 5X loading dye 於 95 ℃加熱 10 分鐘，將含