第一章 緒 論
第三節、 神經細胞可塑性
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老 鼠 記 憶 的 程 度 。(3) 單 項 抑 制 性 躲 避 學 習 試 驗 (one-way inhibitory avoidance learning task) ：將老鼠放在一個具有明亮區及黑暗區的行為箱 中，由於老鼠天性喜至黑暗處，當其進入黑暗區時，同時給予電擊，下回 老鼠再被放入行為箱時，若是記得曾被電擊，則停留於明亮區的時間較長 (Kesner and Hardy, 1983) 。1971 年 O’Keefe 將記錄電極放入大鼠的海馬 迴區域，發現海馬迴內的神經細胞對特定的空間位置會有動作電位的產 生，因此稱之為位置細胞 (place cells)，推測海馬迴內存在對空間位置有偏 好的細胞 (O'Keefe and Dostrovsky, 1971)。而這些位置細胞對空間的辨認 非常依賴視覺線索 (visual cues)，所以改變視覺線索會影響這些細胞的活 動。在黑暗環境下，這些位置細胞並沒有任何反應，但是當燈亮後細胞的 偏好性又馬上出現，若是忽然將燈熄滅，這些位置細胞的偏好性仍然存在，
因此這些位置細胞並非單純受控於外界的視覺線索，而是藉由外界的視覺 線索和其他線索建立空間輿圖 (spatial map) 的關係，一旦關係建立，即使 外界沒有視覺線索存在動物仍可做出適當反應 (McNaughton et al., 1989;
Bird and Burgess, 2008)。
第三節、神經細胞可塑性
1894 年西班牙神經解剖學家 Cajal 提出神經元教條 (neuron doctrine)，
認為神經細胞是大腦送出訊號的基本單位。新的記憶形成則需透過神經細 胞之間的接觸，此種接觸為突觸 (synapse) (Bliss and Collingridge, 1993)。
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突觸如何藉由改變其溝通效率 (synaptic efficiency) 而對學習記憶產生 貢獻 ? 1949 年 Hebb 提出假設如下：記憶存在腦部特定區域，在學習的過 程中由於神經活性增強，使突觸的連結變強，即突觸效率增加，記憶便在 此過程中形成 (Hebb, 1949)。現今，突觸間聯繫效率的改變稱為神經細胞 的可塑性。如何促進神經細胞的可塑性 ? 綜合文獻大致上可經由下列幾種 機制達成：增加突觸後受體的數目、神經傳導物質釋放、改變突觸的結構，
因此，增加每個神經元突觸的數目、增加突觸面積、縮短突觸間隙間的距 離，或是調控基因的表現及蛋白質的合成，都能增加神經傳導物質的傳導 效率 (Schubert, 1991)。而要改變突觸數目或是面積，則要透過細胞與細胞 間或細胞與胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 間黏著力的重組。也就是 透過細胞骨架分子、細胞黏著分子 (cell adhesion molecules) 和細胞外基質 參與神經可塑性的調節 (Lauri et al., 1999; Wright et al., 2002)。肌動蛋白 絲 (actin filament) 在海馬迴 CA1 區域維持長期增益現象 (Krucker et al., 2000) 。文獻指出，利用 Latrunculin A 細胞骨架抑制劑可抑制晚期長期增 益現象的形成 (Fukazawa et al., 2003)。此外，RDG peptide 可專一性辨認 整合蛋白與細胞外基質結合位置的序列，加入 RDG peptide 至海馬迴切片 以高頻刺激，可抑制海馬迴 CA1 區域之長期增益現象 (Staubli et al., 1998)。除此之外，基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 是可 分解細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 的蛋白酵素，文獻指出 MMP-3
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與 MMP-9 參與空間記憶的形成，利用 MPP 抑制劑 (FN-439) 則會抑制空間 記憶的形成 (Meighan et al., 2006)。
第四節、層黏蛋白 (Laminin，LN)家族 一、層黏蛋白的種類
層黏蛋白最早是 1979 年從小鼠的 EHS (Engelbreth-Holm -Swarm) 腫 瘤中發現並命名，層黏蛋白是細胞外基質中一種重要的細胞黏附分子，而 這些細胞外基質會圍繞在表皮、肌肉細胞、許旺細胞 (Schwann cells) 以及 周邊神經以維持組織的完整性。構成細胞外基質的大分子種類繁多，大致 可 歸 納 為 五 大 類 ︰ Ⅳ 型 膠 原 蛋 白 (collagen type Ⅳ) 、 非 膠 原 糖 蛋 白 (entactin) 、 氨 基 聚 糖 (heparan sulfated proteoglycans) 與 蛋 白 聚 糖 (glycoprotein)、以及纖維網狀蛋白 (fibronectin) (Timpl et al., 1979)。層黏 蛋白為一種大型的醣蛋白，並由三種型態 (α、β、γ) 肽鏈所組成，α 鏈的 C 端具有五個球狀結構稱為 G domain (LG1-LG5)，α 鏈的分子量大約 400 kDa，β 鏈與 γ 鏈的分子量大約 200 kDa (附錄一)，這些層黏蛋白經由選擇 性剪切 (alternative spliced) 產生不同基因產物，目前已知存在 5 種 α 鏈 (α1-5)、3 種 β 鏈 (β1-3)、3 種 γ 鏈 (γ1-3) 不同的次單元 (Miner et al., 1997;
Tunggal et al., 2000)，可組成超過 16 種以上的層黏蛋白 (Burgeson et al., 1994; Parsons et al., 2002) (附錄二)。然而不同的次單元在不同組織的表 現量以及功能都不盡相同，如 α1 鏈參與早期胚胎的表皮基底膜的形成；α5
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鏈則在晚期胚胎發育的表皮基底膜、以及骨骼肌和平滑肌中大量表現；β1 鏈 則 在 海 馬 迴(hippocampus) 、 紋 狀 體 (striatum) 以 及 內 嗅 皮 質 層 (entorhinal cortex) 中表現量最多 (Sharif et al., 2004a)。
層黏蛋白除了是細胞外基質的重要結構分子外，同時它也提供了黏附的 位置與細胞表面的受體結合 (Yurchenco and Cheng, 1994)，這些受體包括 整合素 (integrin)、dystroglycan、Lutheran blood group glycoprotein (Henry and Campbell, 1996) 。此外，層黏蛋白也是一種訊息傳遞分子，能透過與 受 體 結 合 進 而 調 控 細 胞 的 增 生(proliferation) 、 移 動 (migration) 、 分 化 (differentiation) 和形態 (morphology) (Calof et al., 1994; Delwel et al., 1996)。所有的層黏蛋白都具有 N 端分泌訊號可使層黏蛋白黏附在內質網 上，使層黏蛋白被醣基化 (glycosylation)，此時層黏蛋白會由內部內質網沿 著分泌傳遞路徑到細胞外，再透過與特定的受體結合產生訊息傳遞至細胞 內。
二、層黏蛋白在神經系統中的表現及其功能
文獻指出，層黏蛋白在中樞神經系統的神經和神經膠細胞 (glial cell) 皆 大量表現 (Liesi et al., 1983; Liesi et al., 2001; Wiksten et al., 2004b;
Wiksten et al., 2004a)。於神經系統中，層黏蛋白參與在神經突的生長 (neurite outgrowth)、神經退化 (neurodegeneration)、神經存活、突觸形成 以及神經重組的歷程中 (Cheng et al., 1997)。在周邊神經系統，神經膠細
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胞及許旺細胞 (Schwann cells) 皆會產生層黏蛋白，而層黏蛋白被認為在許 旺細胞進行分化時扮演重要角色 (Patton, 2000)。利用 laminin gene trap mice，證實層黏蛋白的確會在基底膜細胞間質以外的組織中累積，目前已 知 β、γ 鏈皆會在成鼠大腦中表現 (Yin et al., 2003) 。若是突變 laminin 基 因則會影響神經系統，如突變 LAMA2 基因除了會造成肌肉纖維死亡，導致 肌肉無力的現象外 (Sunada et al., 1994)，中樞神經和周邊神經髓鞘也有不 正常的現象 (Chun et al., 2003) ；此外，小鼠若缺乏 laminin β2 則會影響視 網膜的型態 (Libby et al., 1999)；laminin γ1 存在於許多基底膜，如皮膚、
肺部，突變此基因會影響基底膜導致神經不正常的移動。
三、層黏蛋白與記憶之間的關係
Indyk 提出在海馬迴中大量表現的是 laminin-10 (α5β1γ1) (Indyk et al., 2003)。文獻指出，laminin γ1 鏈會與接受體 PrPc 結合且透過活化 PKA (cAMP-dependent protein kinase A) 和 ERK1/2 (extracellular regulated kinase) 參與恐懼記憶的穩固 (Coitinho et al., 2006)。若加入 laminin-1 (α1β1γ1) 的抗體至海馬迴組織切片則會抑制長期增益現象發生 (Nakagami et al., 2000)。此外，laminin β1 啟動子/βgal 報導基因轉殖鼠顯示 laminin β1 表現在成鼠的海馬迴、下視丘以及大腦皮質，特別是海馬迴中CA1、CA2、
CA3 三個區域，而海馬迴正是參與空間學習記憶的重要地方 (Sharif et al., 2004a)。文獻指出 laminin β1 會使軸突產生髓鞘，以穩定神經膠細胞與軸
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突之間的連結，進而促進紋狀體 (striatum) 突觸的可塑性 (Adriani et al., 2006)，因此我們想進一步探討 laminin β1 是否參與大白鼠空間記憶的形成 以及透過調控下游哪些訊息傳遞訊號分子參與記憶形成過程。
第 五 節 、 血 清 及 糖 皮 質 激 素 誘 導 激 酶 (serum and glucocorticoid -inducible kinase, SGK)
一、血清及糖皮質素誘導激酶的表現及其異構型
血清及糖皮質激素誘導激酶 (SGK) 最早是從大白鼠乳腺腫瘤細胞 (mammary adenocarcinoma) 選殖 (clone) 出來，全長 1.3kb，分子量為 49 KDa 的蛋白質，為絲/酥胺酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶族群成員之一 (Webster et al., 1993b)。不同於其他的蛋白激酶，當細胞受到外在環境的刺激時，會透 過細胞表面的接受體以及細胞核接受體和細胞壓力的訊息傳遞路徑，快速 地增加 SGK 蛋白質表現量，進而調控細胞存活 (survival)、分化、 增生以 及細胞滲透壓平衡 (osmoregulation) 等生理與病理反應 (Firestone et al., 2003)。由於 sgk 的基因表現可在短時間內被誘發表現，因此被稱為一種立 即反應基因 (immediate responsive gene) (Webster et al., 1993a)。
目前已知可誘導 SGK 表現的刺激，包括血清、糖皮質素 (Webster et al., 1993b)、礦物皮質固醇 (mineralocorticoid) (Chen et al., 1999)、濾泡刺激 素 (follicle-stimulating hormone, FSH) (Richards et al., 1995)、p53 腫瘤抑 制蛋白質 (p53 tumor suppressor protein) (Maiyar et al., 1996) 及乙型轉形
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生長因子 (transforming growth factor-β, TGF-β) (Waldegger et al., 1999) 等。這些不同的刺激於適當的時機下調節細胞的反應，所以當細胞受到刺 激時，SGK 表現增加的時間點也有所不同。猶如 Leong 等人研究指出，當 細胞受到紫外線、氧化壓力 (過氧化氫, hydrogen peroxide, H2O2) 或是合成 的糖皮質素 (dexamethasone) 刺激一小時後，即會增加 SGK 蛋白質的表 現；但是當細胞於高滲透壓環境八小時才會增加 SGK 蛋白質的表現 (Leong et al., 2003) 。
後來，於人類表現序列標示 (expressed sequence tag, EST) 中找到兩 個與sgk 相似的片段，其胺基酸序列有 80 %的相似性，在 C 端也具有 44~68
%的相似度，故後人將此兩種基因稱為 sgk2 與 sgk3，而原本的 sgk 則稱為 sgk1 (Kobayashi et al., 1999)。在大部分組織都可偵測到 sgk1 mRNA 與 sgk3 mRNA 的存在，然而 sgk2 mRNA 卻只在肝臟、胰臟及腎臟中表現，
極少部分表現於腦中 (Kobayashi and Cohen, 1999)。雖然此三種 SGK 異 構型在某些特性及功能上相似，但是對於刺激的反應卻不盡相同，例如：
類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF) 增加 SGK1 活性的程度 相較於 SGK2 或 SGK3 明顯 ；血清及糖皮質素會增加 sgk1 mRNA 的表現，
而對於H4IIE 細胞的 sgk2 mRNA 及大鼠纖維母細胞的 sgk3 mRNA 卻沒有 太大的影響 (Kobayashi et al., 1999)。然而，目前對於 sgk 異構物及其在生 理上所扮演的角色仍有待未來釐清。
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二、血清及糖皮質素誘導激酶基因表現的調控機制
sgk 去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 上的啟動子具有糖皮
質素反應子 (glucocorticoid responsive element, GRE) 及 p53 腫瘤抑制蛋 白質的結合位置存在，當接受體結合了糖皮質素或是礦物質皮質固醇後便 能與 GRE 結合，進而調控 sgk 的轉錄 (Webster et al., 1993b)。p53 的刺 激則能促使 sgk 表現量增加 (Maiyar et al., 1996) 。雖然糖皮質素和 p53 對 於 sgk 的表現皆具有貢獻，但是當兩者共存時，卻呈現相反的結果，即 sgk 的表現被抑制了 (Maiyar et al., 1997) 。
MAPK 家族成員中的 ERK 及 p38MAPK 也是調控 sgk 轉錄的重要分 子。在 NIH-3T3 細胞中給予生長因子 [如：platelet-derived growth factor (PDGF) 或 fibroblast growth factor (FGF)] 刺激所增加的 sgk 表現會受到 U0126 (MEK 抑制劑) 的抑制，因此顯示這些生長因子會透過 ERK1/2 的訊 息傳遞路徑增加 sgk 的表現 (Mizuno and Nishida, 2001)。當細胞受到高滲 透壓 [如：sorbitol 或氯化鈉(NaCl)] 、42℃熱休克 (heat shock) 、紫外線及 氧化壓力等的環境壓力刺激時，會經由p38MAPK 的訊息傳遞路徑增加 sgk 的表現，而此作用也會因為 p38MAPK 抑制劑的處理或轉染 p38MAPK 上 游之 MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3) 的突變型而被抑制 (Bell et al., 2000; Waldegger et al., 2000; Leong et al., 2003)。
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三、血清及糖皮質素誘導激酶訊息傳遞路徑的調控
SGK 為 AGC 蛋白激酶族群 [蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA) 、依 賴 cGMP 的蛋白激酶 (cGMP-dependent protein kinase) 、蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC) ] 成員之一。AGC 蛋白激酶族群除上述三種蛋白激 酶之外，也包含 protein kinase B (PKB)、p90 ribosomal S6 kinase (RSK)、
mitogen and stress-activated protein kinase (MSK) 及 p70 ribosomal S6 kinase (S6K) 等。此族群成員能傳遞有關細胞生長、分化和細胞存活的訊
mitogen and stress-activated protein kinase (MSK) 及 p70 ribosomal S6 kinase (S6K) 等。此族群成員能傳遞有關細胞生長、分化和細胞存活的訊