Laminin B1抑制ERK1/2及SGK1的活化進而抑制大白鼠空間記憶的形成 - 政大學術集成

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(1)國立政治大學生命科學研究所碩士論文. Laminin β1 抑制 ERK1/2 及 SGK1 治的活化進而抑制大白鼠空. 立. 政. 大. 間記憶的形成. ‧. ‧ 國. 學 sit. y. Nat. Laminin β1 impairs spatial memory formation in rats. n. al. er. io. through inhibition of ERK1/2 and SGK1 activity. Ch. engchi. i Un. v. 研究生：劉文婷撰指導教授：李小媛博士. 中華民國 98 年 11 月 27 日.

(2) 誌謝能夠順利地完成我的碩士生涯，最要感謝李小媛老師在這段期間給我的指導，讓我在碩士班可以向一群優秀的學長姐們學習，無論在研究上或是做人處事上，使我不必花太多時間在迷網或是摸索。其次，感謝陳景宗老師及楊瀅臻老師對論文中的缺失與問題給予寶貴的建議，使本論文更加完善。. 政治大. 回想起剛進實驗室的日子，從來沒看過這麼多老鼠的我確實感到害怕，. 立. 但在學長姐不厭其煩地教導鼓勵下，慢慢地適應調整自己。謝謝瀅臻、馨. ‧ 國. 學. 瑩學姊一步一步地帶我做實驗，解答我對課業、實驗上的疑惑，謝謝瑞徵、. ‧. 大倫、正雄學長以及馬哥在實驗上的協助與指導，在我遇到困難時總是伸. Nat. io. sit. y. 出援手幫助我，此外，也謝謝定佑、彥呈、紹宇、于姐以及學弟妹們的協. er. 助與幫忙，多虧了你們的協助與照顧才能如此順利完成實驗。. al. n. iv n C hengchi U 最後感謝我的家人，包容我、給予我最大的支持與鼓勵，讓我在面對挫. 折時，仍能不斷向前邁進。一直覺得自己很幸運，能夠遇到這樣幫助我的老師和夥伴，謹以此論文獻給我敬愛的師長、摯愛的家人以及陪伴我、關心我的朋友們。. I .

(3) 中文摘要層黏蛋白 (laminin) 是基底膜內主要的糖蛋白，屬於細胞外基質。研究指出層黏蛋白在學習與記憶扮演重要角色，且內生性 laminin β1 表現於海馬迴神經，但是目前對於層黏蛋白在中樞神經的瞭解仍不是很清楚。因此，本實驗室利用水迷津學習實驗探討 laminin β1 對大白鼠空間學習與記憶的影響，實驗結果發現，經過學習試驗後的大白鼠，其海馬迴 CA1 區域的. 立. 政治大. laminin β1 mRNA 和蛋白質表現量明顯地減少，laminin β2 的表現則不受到. ‧ 國. 學. 影響。為瞭解 laminin β1 在空間學習與記憶力程中扮演的角色及其下游的. ‧. 訊息傳遞路徑，我們轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會促進大白. Nat. io. sit. y. 鼠在水迷津空間學習與記憶的能力，由西方墨點法也觀察到抑制海馬迴中. er. laminin β1 的表現量會促進 SGK Ser422 及 ERK1/2 的磷酸化，但是 AKT. al. n. iv n C h e n g c h i U laminin β1 至 CA1 區域， Ser473 的磷酸化則無顯著差異。當轉染質體基因. 則會抑制大白鼠水迷津空間學習與記憶的能力，同時也抑制 SGK Ser422 及 ERK1/2 的磷酸化。由於過去證實 SGK1 於大白鼠空間學習記憶歷程中扮演重要角色，我們推測 laminin β1 與 SGK Ser422 的磷酸化有關，為確認 laminin β1 與 SGK1 之間的關係，我們同時轉染 laminin β1 siRNA 和 SGK siRNA 至海馬迴 CA1 區域，原先 laminin β1 促進大白鼠在水迷津空間學習與記憶的能力反而受到抑制。由於許多文獻指出 mitogen-activated protein II .

(4) kinase /extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) 能整合不同訊息傳遞路徑進而調控基因的表現，對神經突觸的可塑性及記憶的形成是個重要分子，我們進一步探討 laminin β1 是否透過 ERK1/2 調控下游的 SGK1 進而影響大白鼠的空間記憶與學習。因此我們先轉染 laminin β1 siRNA， 48 小時後再給予 U0126 (MEK 抑制劑) 以抑制 MAPK/ERK 的活性。結果顯示 U0126 會阻斷 laminin β1 所引起 SGK ser422 的磷酸化。本篇研究提出 laminin β1 會參與哺乳類動物學習記憶的形成，同時也證實 laminin β1. 立. 政治大. 會經由抑制 ERK1/2 及 SGK1 的活化進而抑制大白鼠空間學習與記憶的形. ‧. ‧ 國. 學. 成。. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. III . i Un. v.

(5) Abstract Laminins are the major glycoproteins present in basement membrane, a type of extracellular matrix. Several reports indicated that laminins play a role in learning and memory, and the endogenous laminin β1 protein signal was often associated with the hippocampal neurons, however, the significance of laminin is still not clear. Our laboratory has. 政治大 rats under spatial. found that the level of expression on laminin β1 in hippocampal CA1 area. 立. has been reduced in adult. training, the level of. ‧ 國. 學. expression on laminin β2 did not affect. However, the molecular mechanism involved in laminin β1-mediated memory formation is yet to. ‧. be explored. In order to confirm the role of laminin β1 involved in spatial. sit. y. Nat. learning and memory, transfection of laminin β1 siRNA was used to. er. io. knockdown the expression of laminin β1 in rat hippocampal CA1 region.. n. v laminin β1 siRNA Results from Western ablot l analysis revealed i that Un. C. engchi significantly increased SGK h phosphorylation at Ser422 and ERK1/2 phosphorylation, but it did not affect Akt phosphorylation at Ser473. In contrast, transfection of the wild-type laminin β1 DNA plasmid to the CA1 area impaired water maze performance in rats and decreased SGK phosphorylation at this residue. In a present study, we have found that SGK1 also plays an important role in spatial memory formation in rats. To confirm the interaction between laminin β1 and SGK1, we co-transfection of laminin β1 and SGK1 siRNA in rat hippocampal CA1 area. The memory-facilitating effect of laminin β1 siRNA was blocked by IV .

(6) co-transfection of the SGK1 siRNA. The mitogen-activated protein kinase/ extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) also plays an important role in synaptic plasticity and memory formation. Therefore, we examined whether both SGK1 is a downstream target of the MAPK ⁄ ERK signaling cascade and laminin β1 signaling to SGK1 mediates spatial memory formation in rats. Results revealed that inhibition of MEK by U0126 not only decreased SGK phosphorylation at Ser422 but also antagonized laminin β1-induced SGK phosphorylation at these sites in rat hippocampus. To be conclusion , we have demonstrated that a novel role. 治政大 for the laminin β1 gene and the molecular mechanism underlying laminin 立. β1-mediated memory facilitation is through ERK1/2 to regulate SGK. ‧ 國. 學. phosphorylation at Ser 422 in spatial learning and memory in rats.. ‧. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. V . i Un. v.

(7) 目錄謝 ........................................................................................................... I. 致. 中文摘要 ...................................................................................................... II 英文摘要 .......................................................................................................IV 目. 錄 ...........................................................................................................VI. 圖. 次 ............................................................................................................X. 縮寫全名對照表.............................................................................................XI 第一章緒論 ................................................................................................. 1. 政治大. 第一節、學習與記憶.....................................................................................2. 立. 一、學習與記憶的定義 .............................................................................2. ‧ 國. 學. 二、學習與記憶的種類 .............................................................................2. ‧. 三、記憶形成之歷程 .................................................................................3. y. Nat. 四、參與學習與記憶的腦區 ......................................................................4. er. io. sit. 第二節、空間學習記憶與海馬迴組織............................................................5 一、海馬迴的構造與投射路徑...................................................................5 a. n. iv l C n 二、海馬迴相關的動物行為模式 h ...............................................................7 engchi U. 第三節、神經細胞可塑性 .............................................................................8 第四節、層黏蛋白家族 ...............................................................................10 一、層黏蛋白的種類 ...............................................................................10 二、層黏蛋白在神經系統中的表現及其功能 ........................................... 11 三、層黏蛋白與記憶之間的關係 .............................................................12 第五節、血清及糖皮質激素誘導激酶 ........................................................13 一、血清及糖皮質素誘導激酶的表現及其異構型 ....................................13 二、血清及糖皮質素誘導激酶基因表現的調控機制 ................................15 VI .

(8) 三、血清及糖皮質素誘導激酶訊息傳遞路徑的調控 ................................16 四、血清及糖皮質素誘導激酶參與學習與記憶形成的過程......................18 第六節、細胞外信號調節激酶 MAPK/ERK.................................................20 一、細胞外信號調節激酶的家族及其異構型 ...........................................20 二、ERK1/2 與學習記憶的關係 ..............................................................22 第七節、本論文之研究目的與策略 .............................................................24 第二章. 實驗材料與方法研究 ...................................................................... 26. 第一節實驗動物 ........................................................................................27 第二節水迷津學習試驗..............................................................................27. 政治大. 一、實驗儀器..........................................................................................27. 立. 二、隱藏式平台 ......................................................................................27. ‧ 國. 學. 三、可見式平台 ......................................................................................29. ‧. 四、組織解剖..........................................................................................29. y. Nat. 第三節海馬迴 CA1 區域內基因轉染作用 ...................................................29. er. io. sit. 一、立體定位手術...................................................................................29 二、Laminin β1 質體製備a.......................................................................30. n. iv l C n 三、Laminin β1 siRNA 與 SGKhsiRNA e n g 的製備........................................31 chi U. 四、質體基因與聚乙烯亞胺 (PEI) 混合物的製備 ...................................31 五、藥物的製備 ......................................................................................32 六、海馬迴 CA1 區域注射 ......................................................................33 第四節西方墨點法.....................................................................................33 一、蛋白質萃取 ......................................................................................33 二、蛋白質濃度測定法 ...........................................................................34 三、免疫沉澱..........................................................................................34 四、西方墨點法 ......................................................................................35 VII .

(9) 第五節即時定量聚合酶連鎖反應 ...............................................................36 第六節免疫組織化學染色 ..........................................................................37 一、組織切片的製備 ...............................................................................37 二、免疫組織化學染色 ...........................................................................38 第七節統計分析 ........................................................................................38 第三章. 實驗結果 ........................................................................................ 40. 第一節水迷津試驗降低海馬迴 CA1 區域 Laminin β1 mRNA 及蛋白質的表現............................................................................................................41 第二節抑制海馬迴 CA1 區域 Laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成. 政治大. ...............................................................................................................46. 立. 第三節轉染野生型 Laminin β1 質體海馬迴 CA1 區域會抑制水迷津空間記. ‧ 國. 學. 憶的形成 .................................................................................................51. ‧. 第四節抑制海馬迴 CA1 區域 Laminin β1 的表現會增加 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化 ....................................................................................55. y. Nat. io. sit. 第五節轉染野生型 Laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制 ERK1/2 及. n. al. er. SGK Ser422 的磷酸化 ............................................................................57. iv. CSGK1 第六節抑制海馬迴 CA1 區域 U n Laminin β1 下降所造成 h 的表現會回復 engchi. 空間記憶促進的能力 ...............................................................................59 第七節抑制海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化會回復 Laminin β1 siRNA 所促進空間學習記憶的形成，同時阻斷 Laminin β1 將訊息傳遞至 SGK1 ...............................................................................................................64 第四章. 討論 ............................................................................................... 69. 第五章. 結論 ............................................................................................... 81. 第六章. 參考資料 ........................................................................................ 83. 第七章. 附錄 ............................................................................................... 97. 附錄一 ........................................................................................................98 VIII .

(10) 附錄二 ........................................................................................................99 附錄三 ......................................................................................................100 附錄四 ......................................................................................................103 附錄五 ......................................................................................................104 附錄六 ......................................................................................................105 附錄七 ......................................................................................................106. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. al. er. io. sit. y. Nat. . Ch. engchi. IX . i Un. v.

(11) 圖次圖 1、水迷津訓練使大鼠海馬迴 CA1 區域 laminin β1 mRNA 的表現量減少. ...............................................................................................................43 圖 2、水迷津訓練使大鼠海馬迴 CA1 區域 laminin β1 蛋白質表現量減少. ...............................................................................................................44 圖 3、空間學習試驗的環境刺激下不會影響紋狀體及杏仁核內 laminin β1 的. 表現 ........................................................................................................45 圖 4、抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成 ..48 圖 5、轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會抑制 laminin β1 蛋白質. 政治大. 表現量.....................................................................................................49. 立. 圖 6、利用組織切片確認 laminin β1 siRNA 是否正確轉染至海馬迴 CA1 區. ‧ 國. 學. 域............................................................................................................50. ‧. 圖 7、轉染野生型 laminin β1 質體至大鼠海馬迴 CA1 區域會抑制水迷津空. y. Nat. 間記憶的形成..........................................................................................53. er. io. sit. 圖 8、偵測 laminin β1 質體轉染至海馬迴 CA1 區域的位置及其表現量 ..54 圖 9、轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會增加 SGK 及 ERK1/2. al. n. iv n C 的磷酸化 .................................................................................................56 hengchi U. 圖 10、轉染 laminin β1 質體至大鼠海馬迴 CA1 區域會減少 ERK1/2 及 SGK. Ser422 的磷酸化 ....................................................................................58 圖 11、抑制海馬迴 CA1 區域 SGK1 的表現會回復 laminin β1 減少所造成之. 促進空間記憶的能力 ...............................................................................61 圖 12、轉染 SGK1 siRNA 至大鼠海馬迴 CA1 區域會抑制 laminin β1 siRNA. 所誘導之 SGK Ser422 的磷酸化.............................................................63 圖 13、MEK 抑制劑 (U0126) 會阻斷 laminin β1 siRNA 所促成空間記憶之. 形成 ........................................................................................................66 X .

(12) 縮寫全名對照表 Ala (A)：alanin ANOVA：analysis of variance Asp (D)：Aspartic acid BSA：bovine serum albumin CA1：cornu ammonis 1 area cAMP：cyclic AMP. 立. 學. ‧ 國. CMV：cytomegalovirus. 政治大. CNS：central nervous system. ‧. CREB：cyclic-AMP-responsive element. Nat. er. n. al. ECM：extracellular matrix. Ch. engchi. EGF：Epidermal growth factor ERK：extracellular signal- regulated kinase EST：expressed sequence tag FGF：fibroblast growth factor FITC：fluorescein isothiocyanate FSH：follicle-stimulating hormone XI . sit. io. DNA：deoxyribonucleic acid. y. DMEM：Dulbecco’s modified Eagle medium. i Un. v.

(13) GEF：guanine nucleotide exchange factor GRE：glucocorticoid responsive element H2O2：hydrogen peroxide HA：hemagglutinin A IGF-1：insulin growth factor-1 IP：immunoprecipitation JNK：c-Jun N-terminal kinase. 立. kDa：kilodalton. 政治大. ‧ 國. 學. LB1：laminin β1. ‧. MAPK：mitogen-activated protein kinase. Nat. io. n. al. er. MKK3：mitogen-activated protein kinase kinase 3 mRNA：messenger RNA. sit. y. MEK：mitogen extracellular regulating kinase. Ch. engchi. i Un. v. MSK1：mitogen-and stress-activated protein kinase1 PBS：phosphate buffered saline PCR：polymerase chain reaction PDGF：platelet-derived growth factor PDK1：phosphoinositide dependent kinase1 PEI：polyethylenimine XII .

(14) PH：pleckstrin homology PIF：PDK1-interacting fragment PIP3：phosphoinositol 3,4,5-phosphate PKA：protein kinase A PKB：protein kinase B PKC：protein kinase C PVDF：polyvinylidene difluoride. 立. 學. ‧ 國. S6K：ribosomal S6 kinase. 政治大. SDS：sodium dodecyl sulfate. n. siRNA. al. er. io. SH2：src-homology2. C ：small interfering RNAh. engchi. Thr：Threonine Tyr：Tyrosine. XIII . sit. Nat. SGK：serum and glucocorticoid- inducible kinase. y. ‧. SDS-PAGE：SDS polyacrylamide gel electrophoresis. i Un. v.

(15) 政治大. ‧. ‧ 國. 學. 第一章緒論. 立. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 1. i Un. v.

(16) 緒論第一節、學習與記憶一、學習與記憶的定義神經系統中最重要的功能之一就是學習 (learning) 與記憶 (memory)。學習是神經系統接受感官傳來的訊息 (information)，而記憶是將這訊息儲存或再回憶 (recall) 的機制。這項重要的心智過程，促使生物體累積經驗，以. 政治大. 應付外界環境的改變，「學習」為隨著經驗的累積而逐漸改變行為的反應，. 立. 而「記憶」則是保留學習的成果，並在面對相同經驗下做出相對的反應，. ‧ 國. 學. 因此，兩者關係十分密切。隨著分子生物學的快速發展，科學家們嘗試進. ‧. 一步探討細胞內訊息與基因表現如何參與記憶歷程之機轉。. sit. y. Nat. 二、學習與記憶的種類. er. io. n. al 1924 年心理學家 McDougal 提出，記憶功能可分成許多形式，分別為 iv Ch. n engchi U. 外顯 (explicit) 或內隱 (implicit) 的記憶；近年來，Larry Squire 將記憶分為陳述性 (declarative) 和非陳述性記憶 (non-declarative)。陳述性記憶為有意識的去回憶過去發生的事，屬於事實、念頭與事件的記憶，和海馬迴 (hippocampus) 腦區有關。非陳述性記憶為自動化和反射反應，無法清楚的以語言陳述，而是以行為的表達來顯示其記憶，包含 (1) 技術性記憶：指學習一項技能，重複的學習並修正姿勢，一旦學會了卻難以描述的記憶，如：騎腳踏車、游泳的記憶；(2) 促發 (priming)：經過提示的記憶，給予文字的 2.

(17) 字首即能拼出完整的字(Warrington and Weiskrantz, 1968)；(3) 古典制約 (classical conditioning)：指動物學習到當有某個特定刺激發生後，接著將會發生某特定事件，因而有所反應。透過臨床和實驗的觀察，記憶亦可依據儲存在大腦的時間長短來分類，區分為立即記憶 (immediate memory)、短期記憶 (short-term memory) 和長期記憶 (long-term memory)。短期記憶可以維持幾分鐘至幾小時，透過細胞內原有的一些蛋白質活化，進而在短. 政治大. 時間內改變細胞生理以及細胞間的交互作用；長期記憶則可以持續幾小. 立. 時、幾天、甚至終其一生，此種記憶形成的機制需要神經元基因的表現、. ‧ 國. 學. 蛋白質的合成以及突觸結構的重組 (remodeling) (Goelet et al., 1986)。從. ‧. 短期記憶到長期記憶需要經過記憶穩固的歷程 (memory consolidation)，也. Nat. io. sit. y. 就是記憶形成的過程 (memory formation)，這是指記憶會由一個短暫，容. n. al. er. 易受到干擾的形式，轉換成為一個較持久且穩固的記憶。. 三、記憶形成之歷程. Ch. engchi. i Un. v. 記憶形成的過程包含四個階段：編譯 (encoding)、儲存 (storage)、鞏固 (consolidation) 和提取 (retrieval)。各種不同的訊息經由眼睛、耳朵傳至大腦，而大腦將這些訊息轉成特殊的編譯。為了處理或儲存需要，將記憶作各種不同的轉錄改變其型態，儲存至記憶系統，在下次面對相同經驗時，被重新提取，這些環節中的任何一個出問題，都會造成遺忘。由行為實驗中發現，短期記憶變成長期記憶需要一段時間來穩定，而這段時間稱為記 3.

(18) 憶的鞏固 (Bovet et al., 1968)。文獻指出，老鼠在學習前注射蛋白質合成抑制劑，例如：cycloheximide、anisomycin 或 mRNA 合成抑制劑：actinomycin D，會破壞老鼠長期記憶的形成 (Davis et al., 1976; Davis et al., 1984)。因此，記憶穩固的過程需要基因表現和新蛋白質合成以形成長期記憶。記憶提取主要是回憶 (recall) 或再認 (recognition) 的方式為主。回憶的方式分為 (1) 線索回憶 (cued recall)：提供部分事實作為回憶的線索，結合回憶與再認。(2) 序列回憶 (serial recall)：給予一連串的項目，要求重複原先順序來. 立. 政治大. 回憶。(3) 自由回憶 (free recall)：給予一連串的項目，以任何順序來回憶。. ‧ 國. 學. (4) 配對聯結回憶 (paired-association recall)：給予配對的項目，以其中一. ‧. 個項目作為線索，要求回憶配對中的另一項目。. sit. y. Nat. 四、參與學習與記憶的腦區. er. io. n. al 特定的記憶有特定的腦區負責，最確切的證據來自於 1957 年一位失憶 iv Ch. n engchi U. 症病人 H.M.的臨床報告 (Scoville and Milner, 1957)，病患因接受癲癇的治療而切除大腦兩邊的顳葉內側 (包括海馬迴、杏仁核和部分嗅覺皮質區)，但卻因此產生嚴重的失憶症 (amnesia)，特別是對手術後新的人、事、物無法產生長期記憶，首度證實海馬迴參與記憶穩固的過程。而患者依然記得童年的許多事情，且保有技術性的學習能力和記憶，顯示：第一、顳葉內側和海馬迴不是長期記憶的唯一儲存的位置，因 H.M.可以記得童年往事。第二、顳葉內側對立即的記憶是不必要的，因 H.M.病患在學習後的短時間 4.

(19) 內是有記憶的。第三、H.M.病患可保有技術性學習的記憶，且其表現會隨練習次數而變好，顯示記憶不只存在一種形式，而且不同記憶形式可能經由不同腦區域負責處理。利用功能性核磁共振，得知有關技能性之學習與記憶，需要紋狀體 (striatum) [ 包含尾狀核 (caudate nucleus) 和殼核 (putamen)] 的參與 (Lacourse et al., 2005) ，這也解釋巴金森氏症 (Parkinson’s disease) 病患由於紋狀體退化，技能性的記憶較差 (Sarazin et al., 2002)。藉由燈光為食物線索的八臂迷宮 (radial-arm maze) 習慣性學習. 立. 政治大. 試驗，可以辨別動物因為尾狀核遭受破壞，無法進行習慣性的學習 (Packard. ‧ 國. 學. et al., 1989)。有關內隱式情緒性記憶 (如：恐懼制約學習, fear-conditioning. ‧. learning) 的記憶則是仰賴杏仁核 (amygdala)，但是杏仁核並非只有參與在. Nat. io. sit. y. 內隱式情緒性記憶，此區域也會影響其他的記憶形成，例如：陳述性記憶，. er. 當意識形式的記憶受到情緒影響時會加強記憶的形成 (McGaugh et al.,. al. n. iv n C h e則參與兔子閉眼運動反應之古典制約學習 1996)。另外，小腦 (cerebellum) ngchi U. (Thompson and Krupa, 1994)；而新皮質區 (neocortex) 負責促發作用 (priming) (Milner et al., 1998)。. 第二節、空間學習記憶與海馬迴組織一、海馬迴的構造與投射路徑在大腦神經系統中，海馬迴是空間學習與記憶形成的區域，由於海馬迴的特殊結構及錯綜複雜的神經迴路，各種感覺透過神經傳入海馬迴，在此 5.

(20) 經過處理後再傳至不同的腦區儲存，因此海馬迴具有將短期記憶轉換為長期記憶的功能，在學習與記憶的形成過程扮演重要角色。海馬迴 (hippocampus) 在胎兒腦部發育是經由顳葉內側區域向頂葉擴展而成，位在大腦顳葉 (temporal lobe) 屬於邊緣系統 (limbic system) 的一部分，存在於側腦室的內後方，為左右半腦對稱的構造，海馬迴於冠狀切面下呈現 C 字型，外型上像公羊的角，又稱做 Ammon 氏角 (Ammon’s horn ； cornu ammonis) 。哺乳動物邊緣系統中之海馬迴結構由海馬. 立. 政治大. (hippocampus)、齒狀迴 (dentate gyrus) 與海馬旁迴 (parahippocampal. ‧ 國. 學. gyrus) 所組成。海馬迴的皮質組織可分為三層：分子層 (molecular layer)、. ‧. 錐狀細胞層 (pyramidal cell layer)、多形細胞層 (polymorphic layer)。其中，. Nat. io. sit. y. 神經細胞層是由大型錐狀神經細胞所組成，此部分為海馬迴的主要細胞. er. (Ishizuka et al., 1995)。此外，齒狀迴也是三層構造，但與海馬迴的細胞構. al. n. iv n C h e n g c h i U (granule cell layer) 所取造不完全相似，相異點是錐狀細胞層被顆粒細胞層. 代。海馬迴隨著錐狀神經細胞 (pyramidal cell) 的型態及接受投射纖維的不同區分為 CA1 (CA 即是 cornu ammonis 的縮寫)、CA2、CA3 三個區域。海馬迴神經訊息傳遞主要由三條神經路徑進出海馬迴：第一，貫通纖維 (perforant fiber pathway) 通路由是由內嗅皮質 (entorhinal cortex) 發出訊息傳到海馬迴中齒狀迴 (dentate gyrus) 的顆粒細胞 (granule cell)；第二，苔狀纖維 (mossy fiber pathway) 通路是由齒狀迴的顆粒細胞 (granule cell) 6.

(21) 傳遞到 CA3 區域的錐狀細胞 (pyramidal cell)；第三，Schaffer collateral 通路是由 CA3 區域的錐狀細胞傳至海馬迴 CA1 區域的錐狀細胞，CA1 區域再經由窟窿 (fornix) 將訊息輸出海馬迴。經過海馬迴處理後的訊息會藉由輸出神經將訊息傳遞至大腦皮質層、內鼻皮質層或下皮質層區。輸出神經以兩條路徑為主，(1) 經由下腳 (subiculum) 傳遞到內鼻皮質層再到大腦皮質層；(2) 直接或是間接地傳遞到下皮質層區域 (Amaral and Witter, 1989; Burwell et al., 1995)。. 立. 政治大. ‧ 國. 學. 二、海馬迴相關的動物行為模式. 海馬迴對於記憶的影響，除了藉由臨床病例的研究之外，學者們也採用. ‧. 動物行為模式進行觀察，常用的模式有：(1) 莫氏水迷津試驗 (Morris water. sit. y. Nat. maze learning task)：是將老鼠放在不透明的水池中，並於水面下放置一平. er. io. n. al 台，老鼠需藉由空間環境中的線索 (cue) 尋找隱藏於水面下的平台，當其尋 iv Ch. n engchi U. 找到平台所在的位置，即可獲得休息獎賞。因此，可藉由測量老鼠找到平台所需的時間，得知其學習記憶的結果(Morris, 1984)。(2) 情境式制約學習 (contextual fear-conditioning learning) ：將一個中性制約因子 (情境) 與一個厭惡性的制約因子 (電擊刺激) 進行制約配對，這使得動物在中性制約因子呈現時，可立即預知電擊的來臨。於是當中性制約因子再度出現時，若動物記得先前的經驗，則會有恐懼的行為反應，例如：大鼠會表現靜止不動 (freezing) 甚至顫抖 (Atkins et al., 1998) ，藉由靜止不動的時間可得知 7.

(22) 老鼠記憶的程度。 (3) 單項抑制性躲避學習試驗 (one-way inhibitory avoidance learning task) ：將老鼠放在一個具有明亮區及黑暗區的行為箱中，由於老鼠天性喜至黑暗處，當其進入黑暗區時，同時給予電擊，下回老鼠再被放入行為箱時，若是記得曾被電擊，則停留於明亮區的時間較長 (Kesner and Hardy, 1983) 。1971 年 O’Keefe 將記錄電極放入大鼠的海馬迴區域，發現海馬迴內的神經細胞對特定的空間位置會有動作電位的產生，因此稱之為位置細胞 (place cells)，推測海馬迴內存在對空間位置有偏. 立. 政治大. 好的細胞 (O'Keefe and Dostrovsky, 1971)。而這些位置細胞對空間的辨認. ‧ 國. 學. 非常依賴視覺線索 (visual cues)，所以改變視覺線索會影響這些細胞的活. ‧. 動。在黑暗環境下，這些位置細胞並沒有任何反應，但是當燈亮後細胞的. Nat. io. sit. y. 偏好性又馬上出現，若是忽然將燈熄滅，這些位置細胞的偏好性仍然存在，. er. 因此這些位置細胞並非單純受控於外界的視覺線索，而是藉由外界的視覺. al. n. iv n C U h e n gmap) 線索和其他線索建立空間輿圖 (spatial c h i 的關係，一旦關係建立，即使. 外界沒有視覺線索存在動物仍可做出適當反應 (McNaughton et al., 1989; Bird and Burgess, 2008)。. 第三節、神經細胞可塑性 1894 年西班牙神經解剖學家 Cajal 提出神經元教條 (neuron doctrine)，認為神經細胞是大腦送出訊號的基本單位。新的記憶形成則需透過神經細胞之間的接觸，此種接觸為突觸 (synapse) (Bliss and Collingridge, 1993)。 8.

(23) 突觸如何藉由改變其溝通效率 (synaptic efficiency) 而對學習記憶產生貢獻 ? 1949 年 Hebb 提出假設如下：記憶存在腦部特定區域，在學習的過程中由於神經活性增強，使突觸的連結變強，即突觸效率增加，記憶便在此過程中形成 (Hebb, 1949)。現今，突觸間聯繫效率的改變稱為神經細胞的可塑性。如何促進神經細胞的可塑性 ? 綜合文獻大致上可經由下列幾種機制達成：增加突觸後受體的數目、神經傳導物質釋放、改變突觸的結構，. 政治大. 因此，增加每個神經元突觸的數目、增加突觸面積、縮短突觸間隙間的距. 立. 離，或是調控基因的表現及蛋白質的合成，都能增加神經傳導物質的傳導. ‧ 國. 學. 效率 (Schubert, 1991)。而要改變突觸數目或是面積，則要透過細胞與細胞. ‧. 間或細胞與胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 間黏著力的重組。也就是. Nat. io. sit. y. 透過細胞骨架分子、細胞黏著分子 (cell adhesion molecules) 和細胞外基質. er. 參與神經可塑性的調節 (Lauri et al., 1999; Wright et al., 2002)。肌動蛋白. al. n. iv n C h e 區域維持長期增益現象在海馬迴 CA1 ngchi U. 絲 (actin filament). (Krucker et al.,. 2000) 。文獻指出，利用 Latrunculin A 細胞骨架抑制劑可抑制晚期長期增益現象的形成 (Fukazawa et al., 2003)。此外，RDG peptide 可專一性辨認整合蛋白與細胞外基質結合位置的序列，加入 RDG peptide 至海馬迴切片以高頻刺激，可抑制海馬迴 CA1 區域之長期增益現象 (Staubli et al., 1998)。除此之外，基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 是可分解細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 的蛋白酵素，文獻指出 MMP-3 9.

(24) 與 MMP-9 參與空間記憶的形成，利用 MPP 抑制劑 (FN-439) 則會抑制空間記憶的形成 (Meighan et al., 2006)。. 第四節、層黏蛋白 (Laminin，LN)家族一、層黏蛋白的種類層黏蛋白最早是 1979 年從小鼠的 EHS (Engelbreth-Holm -Swarm) 腫瘤中發現並命名，層黏蛋白是細胞外基質中一種重要的細胞黏附分子，而. 政治大. 這些細胞外基質會圍繞在表皮、肌肉細胞、許旺細胞 (Schwann cells) 以及. 立. ‧ 國. 學. 周邊神經以維持組織的完整性。構成細胞外基質的大分子種類繁多，大致可歸納為五大類︰ Ⅳ 型膠原蛋白 (collagen type Ⅳ) 、非膠原糖蛋白. ‧. (entactin) 、氨基聚糖 (heparan sulfated proteoglycans) 與蛋白聚糖. sit. y. Nat. (glycoprotein)、以及纖維網狀蛋白 (fibronectin) (Timpl et al., 1979)。層黏. er. io. n. al 蛋白為一種大型的醣蛋白，並由三種型態 (α、β、γ) i v 肽鏈所組成，α 鏈的 C Ch. n engchi U. 端具有五個球狀結構稱為 G domain (LG1-LG5)，α 鏈的分子量大約 400 kDa，β 鏈與 γ 鏈的分子量大約 200 kDa (附錄一)，這些層黏蛋白經由選擇性剪切 (alternative spliced) 產生不同基因產物，目前已知存在 5 種 α 鏈 (α1-5)、3 種 β 鏈 (β1-3)、3 種 γ 鏈 (γ1-3) 不同的次單元 (Miner et al., 1997; Tunggal et al., 2000)，可組成超過 16 種以上的層黏蛋白 (Burgeson et al., 1994; Parsons et al., 2002) (附錄二)。然而不同的次單元在不同組織的表現量以及功能都不盡相同，如 α1 鏈參與早期胚胎的表皮基底膜的形成；α5 10.

(25) 鏈則在晚期胚胎發育的表皮基底膜、以及骨骼肌和平滑肌中大量表現；β1 鏈則在海馬迴 (hippocampus) 、紋狀體 (striatum) 以及內嗅皮質層 (entorhinal cortex) 中表現量最多 (Sharif et al., 2004a)。層黏蛋白除了是細胞外基質的重要結構分子外，同時它也提供了黏附的位置與細胞表面的受體結合 (Yurchenco and Cheng, 1994)，這些受體包括整合素 (integrin)、dystroglycan、Lutheran blood group glycoprotein (Henry and Campbell, 1996) 。此外，層黏蛋白也是一種訊息傳遞分子，能透過與. 立. 政治大. 受體結合進而調控細胞的增生 (proliferation) 、移動 (migration) 、分化. ‧ 國. 學. (differentiation) 和形態 (morphology) (Calof et al., 1994; Delwel et al.,. ‧. 1996)。所有的層黏蛋白都具有 N 端分泌訊號可使層黏蛋白黏附在內質網. Nat. io. sit. y. 上，使層黏蛋白被醣基化 (glycosylation)，此時層黏蛋白會由內部內質網沿. n. al. er. 著分泌傳遞路徑到細胞外，再透過與特定的受體結合產生訊息傳遞至細胞內。. Ch. engchi. i Un. v. 二、層黏蛋白在神經系統中的表現及其功能文獻指出，層黏蛋白在中樞神經系統的神經和神經膠細胞 (glial cell) 皆大量表現 (Liesi et al., 1983; Liesi et al., 2001; Wiksten et al., 2004b; Wiksten et al., 2004a)。於神經系統中，層黏蛋白參與在神經突的生長 (neurite outgrowth)、神經退化 (neurodegeneration)、神經存活、突觸形成以及神經重組的歷程中 (Cheng et al., 1997)。在周邊神經系統，神經膠細 11.

(26) 胞及許旺細胞 (Schwann cells) 皆會產生層黏蛋白，而層黏蛋白被認為在許旺細胞進行分化時扮演重要角色 (Patton, 2000)。利用 laminin gene trap mice，證實層黏蛋白的確會在基底膜細胞間質以外的組織中累積，目前已知 β、γ 鏈皆會在成鼠大腦中表現 (Yin et al., 2003) 。若是突變 laminin 基因則會影響神經系統，如突變 LAMA2 基因除了會造成肌肉纖維死亡，導致肌肉無力的現象外 (Sunada et al., 1994)，中樞神經和周邊神經髓鞘也有不正常的現象 (Chun et al., 2003) ；此外，小鼠若缺乏 laminin β2 則會影響視. 立. 政治大. 網膜的型態 (Libby et al., 1999)；laminin γ1 存在於許多基底膜，如皮膚、. ‧ 國. 學. 肺部，突變此基因會影響基底膜導致神經不正常的移動。. ‧. 三、層黏蛋白與記憶之間的關係. sit. y. Nat. Indyk 提出在海馬迴中大量表現的是 laminin-10 (α5β1γ1) (Indyk et al.,. er. io. n. a l γ1 鏈會與接受體 PrPc 2003)。文獻指出，laminin i v 結合且透過活化 PKA Ch. n engchi U. (cAMP-dependent protein kinase A) 和 ERK1/2 (extracellular regulated kinase) 參與恐懼記憶的穩固 (Coitinho et al., 2006)。若加入 laminin-1 (α1β1γ1) 的抗體至海馬迴組織切片則會抑制長期增益現象發生 (Nakagami et al., 2000)。此外，laminin β1 啟動子/βgal 報導基因轉殖鼠顯示 laminin β1 表現在成鼠的海馬迴、下視丘以及大腦皮質，特別是海馬迴中 CA1、CA2、 CA3 三個區域，而海馬迴正是參與空間學習記憶的重要地方 (Sharif et al., 2004a)。文獻指出 laminin β1 會使軸突產生髓鞘，以穩定神經膠細胞與軸 12.

(27) 突之間的連結，進而促進紋狀體 (striatum) 突觸的可塑性 (Adriani et al., 2006)，因此我們想進一步探討 laminin β1 是否參與大白鼠空間記憶的形成以及透過調控下游哪些訊息傳遞訊號分子參與記憶形成過程。. 第五節、血清及糖皮質激素誘導激酶 (serum and glucocorticoid -inducible kinase, SGK) 一、血清及糖皮質素誘導激酶的表現及其異構型血清及糖皮質激素誘導激酶 (SGK) 最早是從大白鼠乳腺腫瘤細胞. 立. 政治大. (mammary adenocarcinoma) 選殖 (clone) 出來，全長 1.3kb，分子量為 49. ‧ 國. 學. KDa 的蛋白質，為絲/酥胺酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶族群成員之一 (Webster et. ‧. al., 1993b)。不同於其他的蛋白激酶，當細胞受到外在環境的刺激時，會透. Nat. io. sit. y. 過細胞表面的接受體以及細胞核接受體和細胞壓力的訊息傳遞路徑，快速. er. 地增加 SGK 蛋白質表現量，進而調控細胞存活 (survival)、分化、增生以. al. n. iv n C h e n g等生理與病理反應 (osmoregulation) chi U. 及細胞滲透壓平衡. (Firestone et al.,. 2003)。由於 sgk 的基因表現可在短時間內被誘發表現，因此被稱為一種立即反應基因 (immediate responsive gene) (Webster et al., 1993a)。目前已知可誘導 SGK 表現的刺激，包括血清、糖皮質素 (Webster et al., 1993b)、礦物皮質固醇 (mineralocorticoid) (Chen et al., 1999)、濾泡刺激素 (follicle-stimulating hormone, FSH) (Richards et al., 1995)、p53 腫瘤抑制蛋白質 (p53 tumor suppressor protein) (Maiyar et al., 1996) 及乙型轉形 13.

(28) 生長因子 (transforming growth factor-β, TGF-β) (Waldegger et al., 1999) 等。這些不同的刺激於適當的時機下調節細胞的反應，所以當細胞受到刺激時，SGK 表現增加的時間點也有所不同。猶如 Leong 等人研究指出，當細胞受到紫外線、氧化壓力 (過氧化氫, hydrogen peroxide, H2O2) 或是合成的糖皮質素 (dexamethasone) 刺激一小時後，即會增加 SGK 蛋白質的表現；但是當細胞於高滲透壓環境八小時才會增加 SGK 蛋白質的表現 (Leong et al., 2003) 。. 立. 政治大. 後來，於人類表現序列標示 (expressed sequence tag, EST) 中找到兩. ‧ 國. 學. 個與 sgk 相似的片段，其胺基酸序列有 80 %的相似性，在 C 端也具有 44~68. ‧. %的相似度，故後人將此兩種基因稱為 sgk2 與 sgk3，而原本的 sgk 則稱為. Nat. io. sit. y. sgk1 (Kobayashi et al., 1999)。在大部分組織都可偵測到 sgk1 mRNA 與. er. sgk3 mRNA 的存在，然而 sgk2 mRNA 卻只在肝臟、胰臟及腎臟中表現，. al. n. iv n C h eand 極少部分表現於腦中 (Kobayashi n gCohen, c h i U1999)。雖然此三種 SGK 異構型在某些特性及功能上相似，但是對於刺激的反應卻不盡相同，例如：類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF) 增加 SGK1 活性的程度相較於 SGK2 或 SGK3 明顯；血清及糖皮質素會增加 sgk1 mRNA 的表現，而對於 H4IIE 細胞的 sgk2 mRNA 及大鼠纖維母細胞的 sgk3 mRNA 卻沒有太大的影響 (Kobayashi et al., 1999)。然而，目前對於 sgk 異構物及其在生理上所扮演的角色仍有待未來釐清。 14.

(29) 二、血清及糖皮質素誘導激酶基因表現的調控機制 sgk 去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 上的啟動子具有糖皮質素反應子 (glucocorticoid responsive element, GRE) 及 p53 腫瘤抑制蛋白質的結合位置存在，當接受體結合了糖皮質素或是礦物質皮質固醇後便能與 GRE 結合，進而調控 sgk 的轉錄 (Webster et al., 1993b)。p53 的刺激則能促使 sgk 表現量增加 (Maiyar et al., 1996) 。雖然糖皮質素和 p53 對. 立. 政治大. 的表現被抑制了 (Maiyar et al., 1997) 。. 學. ‧ 國. 於 sgk 的表現皆具有貢獻，但是當兩者共存時，卻呈現相反的結果，即 sgk. ‧. MAPK 家族成員中的 ERK 及 p38MAPK 也是調控 sgk 轉錄的重要分. Nat. io. sit. y. 子。在 NIH-3T3 細胞中給予生長因子 [如：platelet-derived growth factor. er. (PDGF) 或 fibroblast growth factor (FGF)] 刺激所增加的 sgk 表現會受到. al. n. iv n C hengchi U U0126 (MEK 抑制劑) 的抑制，因此顯示這些生長因子會透過 ERK1/2 的訊. 息傳遞路徑增加 sgk 的表現 (Mizuno and Nishida, 2001)。當細胞受到高滲透壓 [如：sorbitol 或氯化鈉(NaCl)] 、42℃熱休克 (heat shock) 、紫外線及氧化壓力等的環境壓力刺激時，會經由 p38MAPK 的訊息傳遞路徑增加 sgk 的表現，而此作用也會因為 p38MAPK 抑制劑的處理或轉染 p38MAPK 上游之 MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3) 的突變型而被抑制 (Bell et al., 2000; Waldegger et al., 2000; Leong et al., 2003)。 15.

(30) 三、血清及糖皮質素誘導激酶訊息傳遞路徑的調控 SGK 為 AGC 蛋白激酶族群 [蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA) 、依賴 cGMP 的蛋白激酶 (cGMP-dependent protein kinase) 、蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC) ] 成員之一。AGC 蛋白激酶族群除上述三種蛋白激酶之外，也包含 protein kinase B (PKB)、p90 ribosomal S6 kinase (RSK)、 mitogen and stress-activated protein kinase (MSK) 及 p70 ribosomal S6 kinase (S6K) 等。此族群成員能傳遞有關細胞生長、分化和細胞存活的訊. 立. 政治大. 息傳遞路徑，在演化過程中有很高的保留度 (highly conserved) 。SGK 與. ‧ 國. 學. 其他 AGC 族群成員蛋白質的催化序列 (catalytic domain) 相比較有 45~55. ‧. %的相似度，其中與 AKT 相似度最高 (55 %) (Webster et al., 1993b; Lang. Nat. io. sit. y. and Cohen, 2001)。由於 SGK 與 AKT 在催化序列有很高的相似度，而 AKT. n. al. er. 的訊息路徑已被普遍瞭解，因此將以 AKT 作為研究 SGK 訊息傳遞路徑的參考。. Ch. engchi. i Un. v. 已知 phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) 及其下游 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (PDK1) 能調控 AGC 族群成員的活化，因此 PI3K-PDK-SGK 這條訊息傳遞路徑已被確認出來。過去研究顯示，當 HEK293 細胞受到胰島素 (insulin)、類胰島素生長因子-1 (insulin-like growth factor, IGF-1) 或是 H2O2 刺激時，若是將 SGK 序列上似 Thr256 (相對於 AKT Thr308) 及 Ser422 (相對於 AKT Ser473) 突變成為丙胺酸 (Alanin, 16.

(31) Ala, A) 時，SGK 的活性會受到抑制；反之，若是將 SGK Ser422 突變為天冬胺酸 (Aspartic acid, Asp, D) 時，則形成永久活化的形式，明顯增強 SGK 的活性 (Kobayashi et al., 1999; Park et al., 1999)。有趣的是，SGK 雖然在催化序列上與 AKT 相似，但是在 N 端序列上並不一致，這使得兩者蛋白激酶被磷酸化的過程有所不同。AKT 與 PDK1 皆具 PH (pleckstrin homology) 序列，當 PI3K 將細胞膜上的磷脂質 PIP2 催化成 PIP3 (phosphatidylinositol 3,4,5-phosphate) 時，會吸引具有 PH 序列的 PDK1 和 AKT 結合在細胞膜. 立. 政治大. 上的 PIP3，此時 PDK1 會磷酸化 AKT Thr308 的位置。但是 SGK 並不具有. ‧ 國. 學. PH 序列又如何受到 PDK 磷酸化的調控呢 ? 經由 knock-in mutation of. ‧. PDK1 上的 PIF (PDK1-interacting fragment) 序列至胚胎幹細胞時，顯示. Nat. io. sit. y. AKT 仍然會正常地活化，而 SGK 卻沒辦法被活化，這證實了雖然 SGK 不. er. 具有 PH 序列，但是依然能受到 PDK1 的調控，更顯示出 PDK1 其 PIF 序. al. n. iv n C U h，e當nSGK 列對於 SGK 活化的重要性。此外被 PDK1 磷酸化之前， g c h的i Thr256. SGK Ser422 的位置須先被磷酸化，PDK1 的 PIF 就能辨認此位置，接著使位在活化序列 (activation loop) 上 Thr 256 的位置被磷酸化。目前發現 SGK1 蛋白質會直接磷酸化 STAT1 蛋白質酪胺酸 701、絲胺酸 727 的位置，並間接磷酸化 STAT2 酪胺酸 690 的位置，促使 STAT1 和 STAT2 蛋白質結合形成異雙具體，由細胞質位移至細胞核內，啟動 Mcl-1 基因的表現，調控細胞的存活 (Hsu et al., 2009)。此外，在離體環境下 SGK 17.

(32) 能直接磷酸化 CREB Ser133，當細胞大量表現 PDK1 時，能透過 SGK 使 CREB 磷酸化 (David and Kalb, 2005)。SGK 的活化尚參與許多生理功能，例如：SGK 會藉著磷酸化 Nedd4-2，進而防止上皮細胞鈉離子通道與 Nedd4-2 結合，而促使蛋白質被降解 (Debonneville et al., 2001; Zhou and Snyder, 2005)。此外，GSK-3β 過度活化時會損害大白鼠的空間記憶形成 (Liu et al., 2003)，當 SGK 磷酸化 GSK-3β，則有助於降低 GSK-3β 活性 (Kobayashi and Cohen, 1999)。SGK1 也會經由直接磷酸化 IκB kinase α. 立. 政治大. (IKKα) Thr23 以及間接磷酸化 IKKα Ser180 活化 IKKα 並進而提升 nuclear. ‧ 國. 學. factor κB (NF-κB) 的活性，促使 NR2A 及 NR2B 的基因表現增加並促進長. ‧. 期記憶的形成 (Tai et al., 2009)。. sit. y. Nat. 四、血清及糖皮質素誘導激酶參與學習與記憶形成的過程. er. io. n. al 許多年來學者透過動物行為實驗早已證實，適度的壓力有助於學習記 iv Ch. n engchi U. 憶。當動物面臨壓力時，腎上腺皮質會合成並且釋放糖皮質素 (glucocorticoid)，此時糖皮質素若是與腦部 (如：海馬迴、杏仁核) 的糖皮質素接受體作用時，便會促進學習與記憶的形成。此外，腎上腺切除的動物，由於糖皮質素無法合成及分泌，會損害水迷津學習試驗的記憶穩固作用；假若給予合成的糖皮質素，則可以改善其記憶上的缺陷 (Roozendaal et al., 1996) 。另外，當小鼠的糖皮質素接受體造成點突變 (point mutation) 或以接受體反義寡核苷酸 (antisense oligonucleotides) 或是接受體基因剔 18.

(33) 除 (gene knockout) 的處理後，則有明顯的學習與記憶能力受損 (Rousse et al., 1997; Oitzl et al., 2001) ，顯示糖皮質素在學習記憶形成過程中的重要性。以莫氏水迷津學習試驗 (Morris water maze learning task) 測試大白鼠的空間學習記憶能力，發現學習能力較佳的大白鼠，其海馬迴 CA1區域 SGK1的傳訊核醣核酸表現量較學習能力差的大白鼠為高 (Tsai et al., 2002)。此外，將SGK1的顯著抑制型突變種 (dominant negative mutant) -SGK S422A質體轉染至海馬迴CA1區域48小時後，會顯著降低大白鼠在水. 立. 政治大. 迷津試驗中的學習記憶能力；反之，將野生型的SGK質體基因轉染至海馬. ‧ 國. 學. 迴CA1區域後，則會顯著提升大白鼠的學習記憶能力 (Tsai et al., 2002)。. ‧. 這些研究結果顯示SGK1的基因表現與蛋白質活化可能參與空間記憶形成. Nat. io. sit. y. 的過程。此外，在電生理實驗也顯示SGK S422A質體基因會抑制大白鼠海. er. 馬迴CA1區域的長期增益現象 (long-term potentiation) 的維持期，顯示. al. n. iv n C h e n g c h i U(Ma et al., 2006)。此外，許 SGK1可能參與神經細胞長期增益現象的機制. 多動物行為實驗也證實，豐富的環境 (environmental enrichment) 刺激有助於加強學習與記憶的能力。文獻指出，豐富的環境刺激能加強大白鼠於水迷津學習表現、新物體辨識試驗 (novel object recognition test) 及情境式制約試驗 (contextual fear-conditioning learning) 的記憶表現，同時增加sgk 訊息核醣核酸苷的表現；若是轉染突變型SGK1 S422A質體至海馬迴CA1區域則會抑制豐富環境所誘發的促進記憶的效果 (Lee et al., 2003)。同時，也 19.

(34) 發現大白鼠經過水迷津學習試驗後，其海馬迴CA1區域ERK1/2的活性會增加，活化後的ERK1/2蛋白質會直接磷酸化 SGK1 Ser78，並間接地磷酸化 SGK1 Thr256及SGK1 Ser422，進而促進大白鼠空間記憶的形成 (Lee et al., 2006) 。另外，大白鼠在經過水迷津學習試驗後，會促進海馬迴CA1區域 SGK1 Ser422的活化，進而促進SRF (serum response factor) Ser99及 CREB1 (cyclic AMP response element-binding protein) Ser133位置的磷酸化，使zif268基因表現促進大白鼠空間記憶的形成 (Tyan et al., 2008)。. 立. 政治大. 如前文所述，糖皮質素以及SGK1在學習記憶中扮演重要角色，而且糖皮質. ‧ 國. 學. 素促使SGK1的表現量增加，這說明了糖皮質素極可能是透過活化SGK1的. ‧. 表現，進而促進學習記憶的形成。. sit. y. Nat. 第六節、細胞外信號調節激酶 MAPK/ERK (extracellular signal-. er. io. regulated protein kinase, a ERK). n. iv l C n hengchi U 一、細胞外信號調節激酶的家族及其異構型. ERK 是一種絲胺酸 / 酥胺酸蛋白激酶 (serine/threonine protein kinase)，屬於分裂活性蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 家族中的一員，廣泛地存在於真核細胞中 (Boulton et al., 1991)。MAPK 的家族成員主要包括：ERK、c-Jun N 端蛋白質激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38MAPK 以及 ERK5/BMK1，其中 ERK 主要又包含了 p44/p42 MAPK (ERK1/2) 兩種異構型 (Arbabi and Maier, 2002)。 20.

(35) ERK1/2 媒介許多生長因子的活化，例如：IGF-1 (insulin-like growth factor-1)、PDGF (platelet-derived growth factor) 及 EGF (epidermal growth factor) 等。當生長因子與接受體結合時，接受體會形成雙聚體，接受體位於細胞質端處酪氨酸的位置會發生磷酸化，接著吸引小轉接蛋白質 (small adaptor protein) 靠近細胞膜，並且透過 SH2 (src-homology2) 的序列與接受體結合。鳥糞嘌呤核甘酸交換因子 (guanine nucleotide exchange factor, GEF) 藉由 SH3 與小轉接蛋白結合，此 GEF 會使 Ras-GDP 成為有活性的. 立. 政治大. Ras-GTP，進而活化 MAPKKK (如：Raf)，接著磷酸化 MEK。活化的 MEK. ‧ 國. 學. 再進一步磷酸化 ERK1/2 的 Tyr204 及 Thr202 位置 (Grewal et al., 1999;. ‧. Adams and Sweatt, 2002; Arbabi and Maier, 2002) 。ERK1/2 參與許多細. Nat. sit er. io. 的可塑性。. y. 胞生理的調控，包括刺激細胞增生、分化、增加細胞存活及誘發神經細胞. al. n. iv n C h eMAPK 雖然 ERK1 與 ERK2 皆屬於 hi U n g c家族成員中的兩種異構型，而且目. 前並沒有專一性 ERK1 或 ERK2 的抑制劑，因此許多文獻並沒有進一步特別區分兩者間的差異。儘管如此，從過去的一些研究，不難觀察出 ERK2 相較於 ERK1，其對於神經細胞可塑性及學習與記憶的過程更為重要。兩者在中樞神經系統分布的區域如下敘述：erk1 mRNA 分佈於皮質、嗅球、部分的海馬迴、杏仁核、黑質、部分下視丘、小腦以及脊髓 (Thomas and Hunt, 1993)。雖然 erk1 mRNA 及 erk2 mRNA 在腦部的分布區域大致相似，但是 21.

(36) erk1 mRNA 在海馬迴 CA1 區域的表現量較少；而 erk2 mRNA 則表現量較多 (Thomas and Hunt, 1993)。除此之外，erk1 mRNA 較多分布於膠質細胞；而 erk2 mRNA 則主要分布在神經細胞 (Hollister et al., 1997)。如前述提及的研究指出，動物進行情境式制約訓練或是聲音提示制約後，ERK2 增加程度較 ERK1 顯著 (Atkins et al., 1998)。另外，Mazzucchelli 等人發現 ERK1 基因剔除鼠在躲避學習試驗中的記憶較野生鼠佳，同時大腦皮質及紋狀體之 ERK2 磷酸化的表現量也較多。推測可能是 ERK1 缺乏時，ERK2. 立. 政治大. 與 MEK 的交互作用增強，進而促進 ERK2 的訊息傳遞路徑 (Mazzucchelli et. ‧ 國. 學. al., 2002)。然而這些證據依舊不足，ERK1 與 ERK2 在神經細胞突觸可塑. ‧. 性及學習與記憶之形成過程中所扮演的角色，仍需進一步釐清。. sit. y. Nat. 二、ERK1/2 與學習記憶的關係. er. io. n. al ERK1/2 最早被認為調控細胞增生與分化，然而發現 ERK1/2 在成熟的 iv Ch. n engchi U. 哺乳類動物中樞神經系統 (central nervous system, CNS) 中大量表現，顯示 ERK1/2 可能在腦中扮演重要角色。English 和 Sweatt 於 1997 年首先証實高頻電刺激誘發的長期增益效應，會促使海馬迴組織 ERK1/2 磷酸化增加，此結果會受到 MEK 抑制劑 PD98059 (Lopez-Colome and Ortega, 1997; Coogan et al., 1999)、SL327 (Atkins et al., 1998) 、U0126 (Ying et al., 2002; Selcher et al., 2003) 之前處理而顯著地降低，並且認為 MEK 抑制劑對於早期或晚期長期增益效應都有抑制作用。Blum 等人也證實經過水迷津 22.

(37) 學習試驗的大白鼠，其海馬迴背側 (dorsal hippocampus) CA1/CA2 區域的 ERK1/2 磷酸化會明顯地增加 (Blum et al., 1999) ，同樣受到 MEK 抑制劑前處理而明顯抑制大白鼠在水迷津的空間學習與記憶表現 (Blum et al., 1999; Selcher et al., 1999) 。然而，對於已學會並記得水迷津空間環境的動物再給予 MEK 抑制劑，則不會影響已形成之記憶 (Selcher et al., 1999) ，這現象說明 ERK1/2 參與學習與記憶的形成過程，當記憶一旦穩固後，則不再需要 ERK1/2 的存在，這可能是因為 ERK1/2 早已完成訊息傳遞，. 立. 政治大. 進而改變基因表現，同時也穩固記憶。目前已知 ERK1/2 調控的下游分子. ‧ 國. 學. 包括轉錄因子 [(如：Elk-1、c-Fos、c-Jun、CREB (cyclic-AMP responsive. ‧. element)]，結構性蛋白 (如：MAP-2、Tau)，以及蛋白激酶 [如：mitogen-and. Nat. io. sit. y. stress-activated protein kinase1 (MSK1) 、 ribosomal S6 kinase 1/2. er. (RSK1/2)] ，而這些蛋白都被證實參與學習與記憶的形成。我們實驗室更證. al. n. iv n C h e n g會促進動物於水迷津空間學習試驗的實，透過 ERK1/2 活化 SGK Ser422 chi U 學習 (Lee et al., 2006) 並參與在長期增益現象中。. 23.

(38) 第七節本論文之研究目的與策略由於已知 laminin β1 會在海馬迴中表現，然而至今尚不清楚其在學習記憶中所扮演的角色及是否還透過其他下游訊息傳遞分子調控學習記憶的形成。近來 SGK 在學習記憶中的研究逐漸萌芽，回顧實驗室先前的研究結果顯示在水迷津試驗中學習較佳的大白鼠 SGK1 的表現較多，若是轉染突變型 SGK S422A 質體則顯著地抑制大白鼠的空間學習記憶。此外，若是缺少 ERK1/2 不只會影響長期增益效應；更顯著地影響動物於水迷津空間學. 立. 政治大. 習試驗。本實驗室也證實 ERK1/2-SGK 的訊息傳遞路徑參與了大白鼠的空. ‧ 國. 學. 間記憶學習，但是 laminin β1 是否會經由 ERK1/2-SGK 進而影響學習記憶. ‧. 仍不清楚。因此，我們想確認 laminin β1 是否參與空間學習記憶的形成及. Nat. sit. er. io. 要研究的內容如下：. y. 其是否透過 ERK1/2-SGK1 的訊息傳遞路徑進而影響空間記憶的形成。主. al. n. iv n C h e n glaminin 一、確認空間記憶的形成是否會影響 β1 的表現量。 chi U 二、探討抑制大白鼠海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現是否影響水迷津試驗學習的能力。三、若是轉染 laminin β1 質體至大白鼠海馬迴 CA1 區域是否也會影響大白鼠的空間學習記憶。四、如果 laminin β1 參與空間記憶的形成，那麼抑制或是促進 laminin β1 的表現可能會活化哪些分子。 24.

(39) 五、若是 ERK1/2 及 SGK1 會受到 laminin β1 的表現影響，那麼抑制大白鼠海馬迴 CA1 區域 SGK1 的活化，是否會阻斷 laminin β1 的訊息傳遞進而影響空間記憶的形成。六、為了確認 laminin β1 是否會透過 ERK1/2 影響 SGK1 的磷酸化，利用 MEK 抑制劑抑制大白鼠海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化，確認是否會阻斷 laminin β1 將訊息傳遞至 SGK1 進而影響空間記憶的形成。. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 25. i Un. v.

(40) 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. 第二章實驗材料與方法研究 n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 26. i Un. v.

(41) 實驗材料與方法研究第一節實驗動物本論文選用 Spraque-Dawley 品系之雄性大白鼠 (購自樂斯科, Bio LASCO Taiwan Co., Ltd)，年齡約八週大，體重介於 250~400 克之間。由中央研究院生物醫學研究所動物房飼養與管理。動物房之室內溫度維持在 25±1 ℃，晝夜循環的設定為 12/12 小時，早上 8 時到下午 8 時為白晝。手術後，將大白鼠飼養於籠中，充分給予飼料與飲水。實驗人員的操作遵照 (中. 政治大. 立. 央研究院生物醫學研究所實驗動物手冊) 之規定進行。. ‧ 國. 學. 第二節水迷津學習試驗 (Morris water maze learning). ‧. 一、實驗儀器. sit. y. Nat. 水迷津學習試驗使用直徑 2 公尺、高 0.6 公尺的塑膠製圓形水池，池內. er. io. n. al 注入約 20 公分高的水，水溫控制在 25±2 ℃，在水池邊緣約 30 公分的固 iv Ch. n engchi U. 定處放置一個透明平台 (直徑約 8 公分左右) ，水池內的水加入奶粉使其為白色不透明混濁狀，在實驗進行的房間周圍放置兩個的訊號 (cue)，指引出此訊號與平台間的空間關係。. 二、隱藏式平台 (hidden platform) 隱藏式平台水迷津試驗最早是由 Morris 於 1984 年所提出的。在測試時，將平台固定於水池邊緣 30 公分處，此平台的頂部約低於水面 1.5 公分， 27.

(42) 將大白鼠面向池壁放入水中，允許其在池中自由游動直到找到平台並站立其上為止，大白鼠從放入水池中到站立於平台上的時間記錄為逃離時間 (escape latency) ，逃離時間之上限為 60 秒，若大白鼠無法在 60 秒內找到平台，則由實驗者將大白鼠自水中取出直接放在平台上。不論大白鼠是自行尋獲平台或是被實驗者置於平台上，均在平台上停留 20 秒，如此構成一個學習嘗試 (trial)。每三個學習嘗試為一個學習區段 (session)，每日進行一. 政治大. 個學習區段，在此三個學習嘗試中，大白鼠每次入水的位置都在不同的象. 立. 限中，並以隨機方式決定入水位置之象限順序。大白鼠在被放入有平台的. ‧ 國. 學. 水池中進行訓練嘗試，記錄大白鼠逃離到平台的時間，以作為學習記憶好. ‧. 壞的指標，若大白鼠對平台位置之空間學習記憶愈好，則將會愈快找到平. Nat. io. sit. y. 台，逃離時間因而愈短。在連續四天的學習嘗試之後，於第五天進行探測. er. 試驗 (probe trial) ，將水池內的平台取出，保留原本牆壁上的空間線索，將. al. n. iv n C hengchi U 大白鼠放入池中游泳 60 秒，並利用攝影機連接行為測試軟體，記錄大白鼠的游泳軌跡、速度、穿越平台的次數和停留在平台所在象限區域的時間。. 28.

(43) 三、可見式平台 (visible platform) 為了確認所轉染的質體 DNA 或是 siRNA 是否會造成個體動物於視覺區辨能力 (visual discrimination) 和運動協調性 (motor coordination) 上的受損，在測試時，將平台固定於水池邊緣 30 公分處，此平台的頂部高於水面 2.5 公分，並在平台上插上顏色鮮豔的旗子，牆面四周貼上顏色鮮艷及形狀各異的幾何圖案當作尋找平台的線索，大白鼠面向池壁放入水中，允許其. 政治大. 在池中自由游動直到找到平台並站立其上為止，每天進行三個學習嘗試為. 立. 一個學習區段 (session)，連續進行四天，共 12 個學習嘗試，並記錄每個. ‧ 國. 學. 學習嘗試的逃離時間。. ‧. 四、組織解剖. sit. y. Nat. 大白鼠在行為實驗測試後立即斷頭犧牲取出全腦，取出來的腦先浸泡於. er. io. n. 4 ℃的磷酸鹽緩衝液 3 至a l5 分鐘，於冰台上進行解剖。利用腦組織切割器 iv. Ch. n engchi U. (brain slicer) 將腦組織以冠狀切面分割出 6 片，每片腦組織厚度 0.2 mm，再以不鏽鋼管 (外徑 0.63 mm, 內徑 0.33 mm) 取出雙側的海馬迴 CA1 區域、紋狀體 (striatum) 及杏仁核 (amygdala)，取出組織後立即以乾冰冰凍起來，並儲存於-80 ℃冰箱中。. 第三節海馬迴內基因轉染作用一、立體定位手術 29.

(44) 選取約八週大的大白鼠，進行腦部立體定位手術 (stereotaxic surgery)。手術前，先注射麻醉劑巴比妥鹽 (sodium pentobarbital, 50 mg/kg) 至大白鼠腹腔，待全身麻醉 (足部反射動作消失) 。麻醉後，剃去頭部毛髮，將其固定於立體定位儀 (stereotaxic instrument) 上，門牙固定桿 (tooth bar) 標高為 -2.4 mm。以手術刀切開頭皮，使頭骨露出，用生理食鹽水止血、清潔後，以鉛筆定出前囪 (bregma) 的位置。依據大白鼠腦部定位圖譜 (Paxinos et al., 1980)，選擇海馬迴齒狀迴區域的座標。以前囪 (bregma) 為. 立. 政治大. 原點，在其後方 3.5 mm，離中線 2.0 mm 的位置，埋入一根消毒過的不銹. ‧ 國. 學. 鋼鋼管，往下植入 3.5 mm 至齒狀迴顆粒細胞層上。鋼管以三根螺絲釘及牙. ‧. 粉固定於頭蓋骨，再放入等長的細鋼絲於鋼管中避免阻塞。待大白鼠醒來，. Nat. n. al 二、Laminin β1 質體製備. er. io. sit. y. 正常飼養一週後即可進行實驗。. Ch. engchi. i Un. v. 建構 pCMV-Flag-laminin β1 質體基因，使用兩段引子 XhoI-laminin β1-F：5’- CCG CTC GAG CAT GGA AAG GCC CCT CTC CTC TCT CC-3’ 以及 ApaI-laminin β1-R : 5’-GGG GGC CCT TAT AAG CAG GTG CTG TAA ACG GCA AC-3’ 進行聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) ，將大鼠海馬迴 laminin β1 全長 5490 bp 之互補去氧核糖核酸複製出來 (附錄三)。將這 PCR 反應的產物接入含有 XhoI 及 ApaI 切位的 pCMV-Flag 載體上，形成 pCMV-Flag-laminin β1 質體。pCMV-Flag-laminin 30.

(45) β1 質體是由 cytomegalovirus (CMV) 啟動子驅動且能於哺乳類動物細胞表現 (附錄四) 。三、Laminin β1-siRNA 與 SGK1-siRNA 的製備 SGK1-siRNA (Wu et al., 2004) 與 Laminin β1-siRNA 序列由 Ambion 合成，使用兩段引子 sgk-1-F：5’-GUC CCU CUC AAC AAA UCA ATT-3’ 及 sgk-1-R：5’-UUG AUU UGU UGA GAG GGA CTT -3’ (Yang et al., 2006)。Laminin β1-siRNA 序列合成由 laminin β1-F：5’-GCA UUU CUG. 立. 政治大. CCU UGA UCC ATT-3’及 laminin β1-R：5’-UGG AUC AAG GCA GAA AUG. ‧ 國. 學. CTG -3’ (附錄六)。Negative siRNA #1(購自 Ambion) 。利用帶正電聚合物. ‧. jetSITM 10 mM (購自 polyplus transfection, France) 當作轉染載體，由於其. Nat. io. sit. y. 對細胞的傷害性極低，且可將帶負電的 Negative siRNA(8 pmol/μl)、laminin. er. β1-siRNA (8 pmol/μl) 及 SGK1-siRNA (8 pmol/μl) 包裹住轉染至大白鼠海. al. n. iv n C h eμl) 馬迴 CA1 的位置 (兩側各注射 0.7 小時後進行水迷津學習試驗測試。 i U n，g64c h 四、質體基因與聚乙烯亞胺 (PEI) 混合物的製備將質體基因轉染 (transfection) 進入海馬迴 CA1 區域內之前，須先製備質體和 polyethylenimine (簡稱 PEI) 混合物。首先純化大量的 Flag-laminin β1 質體，以 5 % 葡萄糖將濃度稀釋至 2.7 μg/μl 。將 0.45 μl 的 0.1 M PEI 和 0.55 μl laminin β1 質體 (2.7 μg/μl) 相互混合，並連續震盪 15 秒使其均勻混合，於室溫下靜置 15 分鐘後，即可進行海馬迴 CA1 區域注射。動物 31.

(46) 在注射 DNA/PEI 混合物後 64 小時才開始進行水迷津空間學習的行為實驗。. 五、藥物的製備 1、本實驗中所使用的藥物 MEK 的抑制劑 (U0126) 購自 calbiochem (CA) 先以 100 % DMSO 溶解，配成 13.3 μg/μl 的原始濃度，待欲使用前再以生理食鹽水 (0.9 % NaCl) 稀釋成 2 μg/μl (15 % DMSO)。U0126 在配製或是注射入大白鼠海馬迴的過程時，需要注意避光。. 政治大. 2、均質緩衝液 (homogenization buffer) : Tris-HCl (50 mM, PH 8.0)、 NaCl. 立. ‧ 國. 學. (150 mM) 、 EDTA (2 mM)、NP-40 (1 %)、Na3VO4 (1 mM)、NaF (10 mM)、pepstatin A (20 μg/μl)、leupeptin (20 μg/μl)、aprotinin (20 μg/μl). ‧. 與 PMSF (1 mM)。. sit. y. Nat. io. n. bromophenal blue 0.5 a%、glycerol 50 % l. Ch. engchi. er. 3、5X loading dye : Tris-HCL 0.25M (pH 6.8)、DTT 0.5 M、SDS 10 %，. i Un. v. 4、電泳緩衝液 (running buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、0.1% SDS 5、轉漬緩衝液 (transfer buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、15% methanol 6、TBST : Tris-HCl (25 Mm, pH8.0)、NaCl (150 mM)、0.05% Tween-20 7、PBS (phosphate buffered saline) : NaCl (137 mM)、KCl (2.7 mM)、 KH2PO4 (1.8 mM)、Na2HPO4 (10 mM) 調至 Ph 7.4 32.

(47) 六、海馬迴 CA1 區域注射將不鏽鋼管連接聚乙烯管 (PE-20)，聚乙烯管再連接至自動幫浦上的 10 μl 的微量注射筒 (Hamilton syringe)。注射前先以酒精擦拭注射針，然後再將聚乙烯管及注射針充滿蒸餾水，留一個小氣泡於管中後，才將 DNA/PEI 混合物吸入，如此可避免 DNA/PEI 混合物與蒸餾水混合。以每分鐘 0.35 μl 的速度注入，每側 CA1 區域注射 0.7 μl 的 DNA/PEI 混合物。進行水迷津試. 政治大. 立. 驗前 64 小時，先轉染 laminin β1 siRNA，於水迷津試驗進行第二天時，先. ‧ 國. 學. 注射 0.7 μl 的 laminin β1 siRNA 溶液，並讓大鼠休息 30 分鐘後，再注射. ‧. 0.5 μl 的 MEK 抑制劑 (U0126, 2 μg/μl) 至海馬迴 CA1 區域。注射完畢後必. Nat. io. sit. y. 須將不鏽鋼管停留在腦中五分鐘以上，才可將注射針取出，避免 DNA/PEI 混. n. al. er. 合物隨著針頭的拔出而滲出。. Ch. engchi. i Un. v. 第四節西方墨點法 (Western blot) 一、蛋白質萃取. 將均質緩衝液 (homogenization buffer) 加入冷凍的海馬迴 CA1 區域組織、紋狀體及杏仁核，置於冰上 15 分鐘。以超音波震盪器 (Sonifer/cell disruptor，Branson Sonic Power Co, U.S.A.) 打碎細胞，使用小型探針 (micro probe)，輸出強度為第三級，輸出效能為 30 %，震盪 10 次。震碎的細胞再以 14000 rpm 高速離心，於 4 ℃下離心 10 分鐘，以除去細胞殘 33.

(48) 骸與未被震碎的細胞。離心後，取出上清液，此即為組織均質液。二、蛋白質濃度測定法本實驗採用 Bio-Rad 公司出品的 protein assay dye reagent 測量所含蛋白濃度。利用 Brillant Blue G-250 染劑 (Bio-Rad Labtories, USA) 與蛋白質結合後，其最大吸收光譜會從 465 nm 轉移到 595 nm 之特性，然後以光譜儀測定 595 nm 的吸光質。以牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 2、 4、6、8 μg/μl 四種濃度，作為推算樣品濃度的參考曲線。因此將樣品適度. 立. 政治大. 稀釋後，取 1 μl 加至 799 μl 的水中，再加入 200 μl 的染劑，五分鐘後測定. ‧. ‧ 國. 學. 蛋白質濃度。. 三、免疫沉澱 (immunoprecipitation, IP). sit. y. Nat. 大白鼠海馬迴 CA1 組織加入均質緩衝液 (homogenization buffer). er. io. n. al [50mM Tris-HCl (pH7.4)，150 mM NaCl，2 mM i v EDTA，1 % IGEPAL Ch. n engchi U. CA-630，1 mM PMSF， 20 μg/ml leupeptin， 20 μg/ml aprotinin， 50 mM NaF， 1 mM Na3VO4] 於低溫環境下利用超音波震盪器將組織打碎，4 °C 離心 14,000g， 10 分鐘後吸取上清液，將此組織均質液與 20 μl 的 anti-Flag antibody (Sigma) 進行免疫沉澱兩小時，之後離心 1000 ×g 1 分鐘，清除上清液，用 PBS (phosphate buffered saline) 清洗沉澱物，再次 1000 ×g 離心 1 分鐘，移除上清液，重複此步驟兩次，將殘留的 buffer 清除，加入 2X loading dye，於 95 °C 加熱 10 分鐘，利用西方墨點分析。 34.

(49) 四、西方墨點法 (Western blot) 樣本經蛋白質定量後加入 5X loading dye 於 95 ℃加熱 10 分鐘，將含相同濃度蛋白質之樣本以等體積加入 8 % SDS-PAGE 膠片孔中，加入電泳緩衝液 (running buffer) ，電流設定為 25 mA 以便分離分子量大小不同的蛋白質，完成後再利用轉漬槽將蛋白質自電泳膠片轉漬到 PVDF 膜 (polyvinylidene difluoride filter membrane, Millipore, USA) 。首先裁切. 政治大. PVDF 膜至 8.5 cm* 7 cm 規格，將 PVDF 膜浸泡於 100 % 甲醇 (methanol). 立. ‧ 國. 學. 中，於震盪器以 70 rpm 陣搖 20 秒後。以去離子水清洗 2 分鐘，再浸泡於轉漬緩衝液中。在轉漬槽內預舖兩張經轉漬緩衝液浸潤的濾紙，再舖上已. ‧. 預處理完全的 PVDF 膜。之後將跑完電泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，以轉漬. sit. y. Nat. 緩衝液潤濕，平舖於 PVDF 膜上，並趕走氣泡，在凝膠上加舖兩張經轉漬. er. io. n. al 緩衝液浸潤的濾紙。完成裝置後，以 110 V 進行轉漬 i v 70 分鐘。將轉漬後的 Ch. n engchi U. PVDF 膜做免疫染色。轉印完成的 PVDF 膜放入 2 ﹪BSA (溶於 0.05 % TBST)，在室溫下振搖 1 小時，以阻斷非特異性結合。然後將 PVDF 膜浸泡於 0.05% TBST 溶液，加入初級抗體於室溫作用一小時或是 4℃下反應過夜。初級抗體有 rabbit anti-phospho-ERK1/2 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-phospho-AKT473 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-LB1 (1:500, santa cruz, CA)，rabbit anti-phospho-SGK422 (1:1000, santa cruz, CA)，反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘，連續三次， 35.

(50) 再加入 peroxidase-conjugated 二級抗體 (Anti-rabbit IgG, HRP- linked antibody)，室溫下反應 1 小時。反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘， TM. 連續三次。以 ECL. 試劑組呈色，將 PVDF 膜加入混合均勻的 HRP. substrate 混合液，使溶液均勻遍布於 PVDF 膜上，將 PVDF 膜放入富士冷光分析儀，可得曝光後的影像，進一步以 NIH ImageJ 軟體進行量化分析。. 第五節即時定量聚合酶連鎖反應 (quantitative real-time polymerase chain reaction). 立. 政治大. 先取出大鼠的海馬迴 CA1 區域組織，用 RNAspin mini kit. (GE. ‧ 國. 學. Healthcare, UK) 萃取出全部的 RNA，以分光光度計 OD 260 nm 測量取得. ‧. RNA 的濃度，接著再進行反轉錄酵素 (reverse transcriptase) 反應 (利用. io. sit. y. Nat. Promega ImPro – IITM reverse transcriptase)：取 1 μg RNA 加入 2 μg oligo. er. dT (0.5 μg/μl) 並加入 nuclease-free water 使體積達 5 μl，置於 70 ℃反應 5. al. n. iv n C U μl 的反應溶液 (包含 4 μl 5x h e n g c h i 15 分鐘後放置於冰上 5 分鐘使之冷卻，再加入. reaction buffer，2.4 μl MgCl2 (25 mM)，1 μl dNTP (10 mM)，0.5 μl recombinant RNasinR ribonuclease Inhibitor，1 μl ImProm-IITM reverse transcriptase, 6.1 μl nuclease-free water) ，置於 25 ℃反應 5 分鐘，42 ℃ 反應 60 分鐘，70 ℃15 分鐘後，即完成反轉錄酵素反應，此互補去氧核醣核酸 (cDNA) 產物可放置於-20℃冰箱保存或立刻進行即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time PCR) 實驗。在本實驗中使用 SYBR Green 螢光染劑方法， 36.