第二章 實驗材料與方法研究
第七節 統計分析
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%蔗糖 (sucrose) 及含 4 %聚甲醛的 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液，於 4 ℃過夜固 定處理，隨後以冠狀切面的方向切出厚度為 30 μm 的組織切片。
二、免疫組織化學染色
將腦部組織切片於室溫浸潤在 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液 10 分鐘後，再以 預冷的酒精/醋酸 (95 %：5 %) 處理 10 分鐘，接著以 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶 液清洗三次，每次 10 分鐘；再把組織切片浸潤於含有 3 %羊血清 (normal goat serum)、3 %牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 以及 0.2 % Triton X-100 的 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液，於室溫下作用 2 小時；將初級抗體 (mouse monoclonal anti-Flag antibody, 1 ： 1 稀 釋 ， 購 自 Boehringer Mannheim, Germany) 溶於上述的 blocking 溶液中，並加入組織切片於 4℃
過夜反應。隔日以 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液清洗三次，每次 10 分鐘；再將組 織切片和以 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液稀釋的次級抗體 (goat anti-mouse FITC- conjugated IgG antibody, 1：100 稀釋, 購自 Sigma, USA) 於室溫下作用 1 小時，再以 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液清洗三次，每次 10 分鐘，最後以封片膠 (0.22 M DABCO in 90% glycerol/PBS) 封片，置於螢光顯微鏡下觀察並照 相。Laminin β1 siRNA 的 sense 序列在 5’端區域已接上 Cy3 紅色螢光物 質，做完組織切片以封片膠封片，最後再以螢光顯微鏡下觀察並照相。
第七節 統計分析
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水迷津空間學習試驗的行為結果是以雙因子變異分析中的重複測量 (two-way analysis of variance with repeated measure, two-way ANOVA) 進行統計。探測試驗及西方墨點法若僅有實驗組跟對照組兩組別時，均以 Student’s t-test 統計方法分析，統計值以 t 值表示。統計分析結果 p>0.05 表示不具有顯著性的差異，*表示 p<0.05，**表示 p<0.01，兩者皆具有顯著 性的差異。若是有三組別或以上時，則以單因子變異分析(one-way ANOVA) 加上 Newman-Kuels method 事後比較，以 q 值表示，#表示 p<0.05，##
p<0.01。
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第三章
實驗結果
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結果
第一節 水迷津試驗降低海馬迴 CA1 區域 laminin β1 mRNA 及蛋白質的表 現
由於laminin β1 蛋白質大量表現在海馬迴 CA1、CA3 區域 (Sharif et al., 2004b)，然而截至目前其可能扮演的功能仍不清楚，因此本論文擬探討 laminin β1 是否參與大白鼠空間記憶的形成以及下游訊息傳遞路徑。此實驗 將大鼠分為兩組 (1) 水迷津訓練，(2) 只游泳而無空間訊號及平台線索的非 水迷津訓練。前者進行四天水迷津試驗，每天進行三個時段，每一時段進 行一次學習嘗試 (trial) ，逃離時間為 60 秒，後者僅將大白鼠放置於水池中，
在沒有平台及沒有任何空間線索的環境下任其自由游泳。大白鼠在學習試
驗結束之後，立即犧牲並取出海馬迴CA1 區域進行即時定量聚合酶連鎖反
應 (real-time PCR) 分析，結果顯示經過水迷津訓練的大白鼠，其海馬迴 CA1 區域中 laminin β1 mRNA 的表現量會明顯低於未經水迷津試驗訓練的 組別 (t1,18=2.52, p<0.05；圖 1A)，而 laminin β2 mRNA 的表現量卻不受空 間學習試驗的影響 (t1,18=0.97, p>0.05 ；圖 1B)。同時為確認 laminin β1 的
蛋白質表現量是否會受到空間學習的影響，取出另一邊的海馬迴 CA1 區域
進行西方墨點法分析，實驗結果顯示，在空間學習試驗後的大白鼠，其海 馬迴 CA1 區域 laminin β1 的蛋白質表現量有明顯減少的情形 (t1,30=3.74, p<0.01；圖 2A)；laminin β2 的蛋白質表現量則不會受到空間學習試驗的影
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響 (t1,30=0.71, p>0.05；圖 2B)。證實空間學習記憶的形成與海馬迴 CA1 區 域之 laminin β1 表現量有關。
此外，為確認是否只有海馬迴 CA1 區域內之 laminin β1 表現量具有差 異性，另外取出杏仁核 (amygdala) 以及紋狀體 (striatum) 組織進行西方墨 點法分析，結果顯示空間學習試驗並不影響紋狀體 (t1,18=0.72, p>0.05；圖 3A) 及杏仁核中 (t1,18=0.56, p>0.05；圖 3B) laminin β1 的蛋白質表現量。
由上述實驗得知，空間學習試驗會使大白鼠海馬迴CA1 區域 laminin β1 的 表現量減少，其他區域則不會受到影響。
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圖 1、水迷津試驗使大鼠海馬迴 CA1 區域 laminin β1 mRNA 的表現量減 少。將大鼠分為水迷津訓練 (Trained) 與未經水迷津試驗 (Non-trained) 的 大白鼠，後者僅將大白鼠放置於水池中，在沒有平台及沒有任何空間線索 的環境下任其自由游泳，每天進行三次學習嘗試 (trial)，連續四天，逃離時 間為 60 秒。大鼠在學習試驗後，立即犧牲並取出海馬迴 CA1 區域組織，
進行即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time PCR) 分析，經過水迷津訓練後的 大白鼠，其 (A) laminin β1 mRNA 的表現量低於未經過訓練的大白鼠 (p<0.05, Student’s t-test) ，(B) laminin β2 mRNA 表現量則不會受到空間學 習試驗的影響而改變 (p>0.05, Student’s t-test)。實驗結果分別來自 10 隻有 水迷津訓練與 10 隻未經水迷津訓練的大鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；
＊, p<0.05 (Student’s t-test)。LB1：laminin β1, LB2：laminin β2, HPRT：
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 。
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圖 2、水迷津試驗使大鼠海馬迴 CA1 區域的 laminin β1 蛋白質表現量減少。
大鼠在試驗結束後，立即犧牲並取出海馬迴 CA1 區域組織進行 (A) 西方墨 點法分析，laminin β1 蛋白質表現量明顯低於未經過訓練的大白鼠。(B) 量 化 結 果 顯 示 ， 水 迷 津 試 驗 會 使 laminin β1 蛋 白 質 顯 著 下 降 (p<0.01, Student’s t-test)；laminin β2 蛋白質表現量則不會受到空間學習試驗的影響 (p>0.05, Student’s t-test)。實驗結果分別來自 10 隻有水迷津訓練與 10 隻 未 經 水 迷 津 訓 練 的 大 鼠 ， 實 驗 數 值 以 mean±SEM 表示；＊ ＊, p<0.01 (Student’s t-test)。LB1：laminin β1, LB2：laminin β2 。
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圖 3、空間學習試驗的環境刺激下不會影響紋狀體及杏仁核內 laminin β1 的表現。在進行完訓練與未經訓練的水迷津試驗之後，取出大白鼠海馬迴 CA1 區域的組織，(A) 利用西方墨點法分析，發現空間學習試驗並不影響杏 仁核 (Amygdala) 及紋狀體 (Striatum) laminin β1 的蛋白質表現量 (p>0.05, Student’s t-test)。實驗量化結果分別來自 10 隻有水迷津訓練與 10 隻未經 水迷津訓練的大鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示。LB1：laminin β1, LB2：
laminin β2。
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第二節 抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成 水迷津訓練會使大白鼠海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的表現量減少，
我們進一步探討是否 laminin β1 的表現量降低，會促進大白鼠在水迷津空 間的學習能力。將埋管後的大鼠分為兩組，每組各 6 隻，(1) 控制組：轉染 negative siRNA (以 jetSITM 10 mM 配置成 8 pmol/μl)； (2) 實驗組：轉染 laminin β1 siRNA (配置成 8 pmol/μl) ，以微量幫浦注射 0.7 μl 至兩側的海 馬迴 CA1 區域，於轉染 64 小時後進行水迷津試驗。大白鼠進行四天的水
迷津試驗，每天進行三個學習嘗試，經過 12 個嘗試之後，我們發現抑制海
馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現，會顯著地增加大白鼠對於空間學習的能 力 (F1,20=17.663, p<0.05；圖 4A)，第五天將平台移除，進行探測試驗 (probe trial)，並藉由錄影機記錄大白鼠於各象限停留的時間，實驗顯示轉染 laminin β1 siRNA 的大白鼠在放置平台的象限區域停留的時間較長 (t1,20=4.61, p<0.01；圖 4B)。此外，為進一步確認轉染 laminin β1 siRNA 促進空間記
憶學習的結果，並不是因為大白鼠的運動能力及視覺辨識能力受影響所 致，因此接著進行可見式平台的水迷津試驗。我們將平台露出水面並插上 旗子，游泳模式如同隱藏式平台，結果顯示，控制組與轉染 laminin β1 siRNA 間兩者並無顯著差異 (F1,14=0.024, p>0.05；圖 4C)，證實轉染 laminin β1 siRNA 促進大白鼠尋找平台的能力，並不是透過影響大鼠運動能力和視覺 辨識能力所造成的結果。將進行完行為試驗的大白鼠立即斷頭犧牲取出海
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馬迴 CA1 區域，以西方墨點法分析，結果顯示，轉染的 laminin β1 siRNA 的確有效地抑制 laminin β1 的蛋白質表現量 (F1,10=421.45, p＜0.01；圖 5)。
為確認 laminin β1 siRNA 確實正確轉染至海馬迴 CA1 區域並且抑制 laminin β1 的表現，laminin β1 siRNA sense 序列於 5’端接上 Cy3 螢光物 質，我們將水迷津試驗後的大白鼠進行腦組織切片，於螢光顯微鏡下觀察，
轉染laminin β1 siRNA 的大白鼠組織切片可觀察到 CA1 區域有紅色螢光標 示，(圖 6)，螢光結果顯示 laminin β1 siRNA 確實轉染進入海馬迴 CA1 錐 狀神經細胞區域。
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圖 4、抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成。(A) 轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域，會促進大白鼠於水迷津試驗中 的學習 (p<0.05，two-way ANOVA with repeated measure)。(B) 探測試驗 結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 的組別在放置平台的象限區域停留的時 間比較久 (p<0.01, Student’s t-test)。(T：平台象限區域，L：平台左邊象限 區域，R：平台右邊象限區域，O：平台對面的象限區域) (C) 轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域並不會影響大鼠於可見式平台水迷津試驗的學習 (p>0.05，two-way ANOVA with repeated measure) 。實驗結果分別來自 6 隻 negative siRNA 與 6 隻轉染 laminin β1 siRNA 的大鼠，以上實驗數值以 mean±SEM 表示。LB1：laminin β1, Neg：negative。
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圖 5、轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會抑制 laminin β1 蛋白質 的表現量。於水迷津試驗前 64 小時，轉染 laminin β1 siRNA (以 jetSITM 10 mM 配置成 8 pmol /μl ，兩側各注射 0.7 μl) 至海馬迴 CA1 區域，(A) 將大 白鼠海馬迴 CA1 區域取出，進行西方墨點法分析，結果顯示 laminin β1 siRNA 確實會抑制 laminin β1 蛋白質的合成 (p<0.01, Student’s t-test)。實 驗結果分別來自 6 隻 negative siRNA 與 6 隻轉染 laminin β1 siRNA 的大 鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；＊＊, p<0.01 (Student’s t-test)。LB1：
laminin β1, Neg：negative 。
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圖 6、利用組織切片確認 laminin β1 siRNA 是否正確轉染至海馬迴 CA1 區 域。 laminin β1 siRNA sense 序列 於 5’ 端位置接上 Cy3 螢光物質，圖中 顯示的紅色螢光表示 laminin β1 siRNA 確實轉染至海馬迴 CA1 錐狀細胞區 域 (比例尺為 240 μm) 。
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第三節 轉染野生型 laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制水迷津空間 記憶的形成
上述結果顯示，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進大白鼠 的空間學習記憶能力；反之，轉染野生型laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區 域應該會抑制大白鼠的空間學習記憶。動物隨機分為兩組， (1) 控制組：
pCMV-Tag2A 載體 (以 PEI 配製成 1.5 μg/μl) ，n=10， (2) 實驗組 : pCMV-Tag2A- laminin β1 質體 (以 PEI 配製成 1.5 μg/μl) ，n=11。每側海 馬迴 CA1 區域各注射 0.7 μl，於質體 DNA 轉染 64 小時之後進行水迷津學 習試驗。行為結果顯示，轉染野生型laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會 顯著降低大白鼠空間學習的能力 (F1,19=9.456, p＜0.05；圖 7A)。第五天則 進行探測試驗，結果顯示轉染野生型 laminin β1 質體組在平台所在象限搜 尋時間明顯低於控制組 (t1,19=2.86, p＜0.01；圖 8B)。此外，在轉染野生型 laminin β1 後的 48 小時，進行可見式平台水迷津試驗，結果顯示轉染野生 型 laminin β1 和控制組之間並無顯著差異 (F1,11=0.967, p>0.05；圖 7C)。
為確認質體基因是否成功轉染至海馬迴 CA1 區域，我們利用免疫組織
化學染色法，偵測帶有標誌蛋白 Flag 的野生型 laminin β1 蛋白質，如圖 8A 所示，接受野生型 laminin β1 轉染的大鼠，其 CA1 區域有專一性螢光的標 示，顯示野生型 laminin β1 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區域。此外，我們 也利用 Flag 抗體進行免疫沉澱後，再以 laminin β1 抗體進行西方墨點法分
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析，如圖 8B 所示，證實野生型 laminin β1 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區 域使 laminin β1 的表現量增加。
綜合上述結果，海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的表現量會影響空間記
綜合上述結果，海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的表現量會影響空間記