第二章 實驗材料與方法研究
第四節 西方墨點法
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六、海馬迴 CA1 區域注射
將不鏽鋼管連接聚乙烯管 (PE-20)，聚乙烯管再連接至自動幫浦上的 10 μl 的微量注射筒 (Hamilton syringe)。注射前先以酒精擦拭注射針，然後再 將聚乙烯管及注射針充滿蒸餾水，留一個小氣泡於管中後，才將DNA/PEI 混 合物吸入，如此可避免 DNA/PEI 混合物與蒸餾水混合。以每分鐘 0.35 μl 的速度注入，每側 CA1 區域注射 0.7 μl 的 DNA/PEI 混合物。進行水迷津試 驗前 64 小時，先轉染 laminin β1 siRNA，於水迷津試驗進行第二天時，先 注射 0.7 μl 的 laminin β1 siRNA 溶液，並讓大鼠休息 30 分鐘後，再注射 0.5 μl 的 MEK 抑制劑 (U0126, 2 μg/μl) 至海馬迴 CA1 區域。注射完畢後必 須將不鏽鋼管停留在腦中五分鐘以上，才可將注射針取出，避免DNA/PEI 混 合物隨著針頭的拔出而滲出。
第四節 西方墨點法 (Western blot) 一、蛋白質萃取
將均質緩衝液 (homogenization buffer) 加入冷凍的海馬迴 CA1 區域組 織、紋狀體及杏仁核，置於冰上 15 分鐘 。以超音波震盪器 (Sonifer/cell disruptor，Branson Sonic Power Co, U.S.A.) 打碎細胞，使用小型探針 (micro probe)，輸出強度為第三級，輸出效能為 30 %，震盪 10 次。震碎 的細胞再以 14000 rpm 高速離心，於 4 ℃下離心 10 分鐘，以除去細胞殘
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骸與未被震碎的細胞。離心後，取出上清液，此即為組織均質液。
二、蛋白質濃度測定法
本實驗採用 Bio-Rad 公司出品的 protein assay dye reagent 測量所含蛋 白濃度。利用 Brillant Blue G-250 染劑 (Bio-Rad Labtories, USA) 與蛋白質 結合後，其最大吸收光譜會從 465 nm 轉移到 595 nm 之特性，然後以光譜 儀測定 595 nm 的吸光質。以牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 2、
4、6、8 μg/μl 四種濃度，作為推算樣品濃度的參考曲線。因此將樣品適度 稀釋後，取 1 μl 加至 799 μl 的水中，再加入 200 μl 的染劑，五分鐘後測定 蛋白質濃度。
三、免疫沉澱 (immunoprecipitation, IP)
大白鼠海馬迴 CA1 組織加入均質緩衝液 (homogenization buffer) [50mM Tris-HCl (pH7.4)，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 % IGEPAL CA-630，1 mM PMSF， 20 μg/ml leupeptin， 20 μg/ml aprotinin， 50 mM NaF， 1 mM Na3VO4] 於低溫環境下利用超音波震盪器將組織打碎，4 °C 離心 14,000g， 10 分鐘後吸取上清液，將此組織均質液與 20 μl 的 anti-Flag antibody (Sigma) 進行免疫沉澱兩小時，之後離心 1000 ×g 1 分鐘，清除上 清液，用 PBS (phosphate buffered saline) 清洗沉澱物，再次 1000 ×g 離 心 1 分鐘，移除上清液，重複此步驟兩次，將殘留的 buffer 清除，加入 2X loading dye，於 95 °C 加熱 10 分鐘 ，利用西方墨點分析。
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四、西方墨點法 (Western blot)
樣本經蛋白質定量後加入 5X loading dye 於 95 ℃加熱 10 分鐘，將含 相同濃度蛋白質之樣本以等體積加入 8 % SDS-PAGE 膠片孔中，加入電泳 緩衝液 (running buffer) ，電流設定為 25 mA 以便分離分子量大小不同的蛋 白 質 ， 完 成 後 再 利 用 轉 漬 槽 將 蛋 白 質 自 電 泳 膠 片 轉 漬 到 PVDF 膜 (polyvinylidene difluoride filter membrane, Millipore, USA) 。 首 先 裁 切 PVDF 膜至 8.5 cm* 7 cm 規格，將 PVDF 膜浸泡於 100 % 甲醇 (methanol) 中，於震盪器以 70 rpm 陣搖 20 秒後。以去離子水清洗 2 分鐘，再浸泡於 轉漬緩衝液中。在轉漬槽內預舖兩張經轉漬緩衝液浸潤的濾紙，再舖上已 預處理完全的 PVDF 膜。之後將跑完電泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，以轉漬 緩衝液潤濕，平舖於 PVDF 膜上，並趕走氣泡，在凝膠上加舖兩張經轉漬 緩衝液浸潤的濾紙。完成裝置後，以 110 V 進行轉漬 70 分鐘。將轉漬後的 PVDF 膜做免疫染色。轉印完成的 PVDF 膜放入 2 ﹪BSA (溶於 0.05 % TBST)，在室溫下振搖 1 小時，以阻斷非特異性結合。然後將 PVDF 膜浸 泡於 0.05% TBST 溶液，加入初級抗體於室溫作用一小時或是 4℃下反應 過夜。初級抗體有 rabbit anti-phospho-ERK1/2 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-phospho-AKT473 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-LB1 (1:500, santa cruz, CA)，rabbit anti-phospho-SGK422 (1:1000, santa cruz, CA)，反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘，連續三次，
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再加入 peroxidase-conjugated 二級抗體 (Anti-rabbit IgG, HRP- linked antibody)，室溫下反應 1 小時。反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘，
連續三次。以 ECLTM 試劑組呈色，將 PVDF 膜加入混合均勻的 HRP substrate 混合液，使溶液均勻遍布於 PVDF 膜上，將 PVDF 膜放入富士冷 光分析儀，可得曝光後的影像，進一步以 NIH ImageJ 軟體進行量化分析。
第五節 即時定量聚合酶連鎖反應 (quantitative real-time polymerase