第二章 實驗材料與方法研究
第二節 水迷津學習試驗
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實驗材料與方法研究
第一節 實驗動物
本論文選用 Spraque-Dawley 品系之雄性大白鼠 (購自樂斯科, Bio LASCO Taiwan Co., Ltd)，年齡約八週大，體重介於 250~400 克之間。由 中央研究院生物醫學研究所動物房飼養與管理。動物房之室內溫度維持在 25±1 ℃，晝夜循環的設定為 12/12 小時，早上 8 時到下午 8 時為白晝。手 術後，將大白鼠飼養於籠中，充分給予飼料與飲水。實驗人員的操作遵照 (中 央研究院生物醫學研究所實驗動物手冊) 之規定進行。
第二節 水迷津學習試驗 (Morris water maze learning) 一、實驗儀器
水迷津學習試驗使用直徑 2 公尺、高 0.6 公尺的塑膠製圓形水池，池內 注入約 20 公分高的水，水溫控制在 25±2 ℃，在水池邊緣約 30 公分的固 定處放置一個透明平台 (直徑約 8 公分左右) ，水池內的水加入奶粉使其為 白色不透明混濁狀，在實驗進行的房間周圍放置兩個的訊號 (cue)，指引出 此訊號與平台間的空間關係。
二、隱藏式平台 (hidden platform)
隱藏式平台水迷津試驗最早是由 Morris 於 1984 年所提出的。在測試 時，將平台固定於水池邊緣30 公分處，此平台的頂部約低於水面 1.5 公分，
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將大白鼠面向池壁放入水中，允許其在池中自由游動直到找到平台並站立 其上為止，大白鼠從放入水池中到站立於平台上的時間記錄為逃離時間 (escape latency) ，逃離時間之上限為 60 秒，若大白鼠無法在 60 秒內找到 平台，則由實驗者將大白鼠自水中取出直接放在平台上。不論大白鼠是自
行尋獲平台或是被實驗者置於平台上，均在平台上停留 20 秒，如此構成一
個學習嘗試 (trial)。每三個學習嘗試為一個學習區段 (session)，每日進行一 個學習區段，在此三個學習嘗試中，大白鼠每次入水的位置都在不同的象 限中，並以隨機方式決定入水位置之象限順序。大白鼠在被放入有平台的 水池中進行訓練嘗試，記錄大白鼠逃離到平台的時間，以作為學習記憶好 壞的指標，若大白鼠對平台位置之空間學習記憶愈好，則將會愈快找到平 台，逃離時間因而愈短。在連續四天的學習嘗試之後，於第五天進行探測 試驗 (probe trial) ，將水池內的平台取出，保留原本牆壁上的空間線索，將
大白鼠放入池中游泳 60 秒，並利用攝影機連接行為測試軟體，記錄大白鼠
的游泳軌跡、速度、穿越平台的次數和停留在平台所在象限區域的時間。
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三、可見式平台 (visible platform)
為了確認所轉染的質體DNA 或是 siRNA 是否會造成個體動物於視覺區 辨能力 (visual discrimination) 和運動協調性 (motor coordination) 上的受
損，在測試時，將平台固定於水池邊緣 30 公分處，此平台的頂部高於水面
2.5 公分，並在平台上插上顏色鮮豔的旗子，牆面四周貼上顏色鮮艷及形狀 各異的幾何圖案當作尋找平台的線索，大白鼠面向池壁放入水中，允許其 在池中自由游動直到找到平台並站立其上為止，每天進行三個學習嘗試為 一個學習區段 (session)，連續進行四天，共 12 個學習嘗試，並記錄每個 學習嘗試的逃離時間 。
四、組織解剖
大白鼠在行為實驗測試後立即斷頭犧牲取出全腦，取出來的腦先浸泡於 4 ℃的磷酸鹽緩衝液 3 至 5 分鐘，於冰台上進行解剖。利用腦組織切割器 (brain slicer) 將腦組織以冠狀切面分割出 6 片，每片腦組織厚度 0.2 mm，
再以不鏽鋼管 (外徑 0.63 mm, 內徑 0.33 mm) 取出雙側的海馬迴 CA1 區 域、紋狀體 (striatum) 及杏仁核 (amygdala)，取出組織後立即以乾冰冰凍 起來，並儲存於-80 ℃冰箱中。
第三節 海馬迴內基因轉染作用 一、立體定位手術
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選 取 約 八 週 大 的 大 白 鼠 ， 進 行 腦 部 立 體 定 位 手 術(stereotaxic surgery) 。手術前，先注射麻醉劑巴比妥鹽 (sodium pentobarbital, 50 mg/kg) 至大白鼠腹腔，待全身麻醉 (足部反射動作消失) 。麻醉後，剃去頭部毛髮，
將其固定於立體定位儀 (stereotaxic instrument) 上，門牙固定桿 (tooth bar) 標高為 -2.4 mm。以手術刀切開頭皮，使頭骨露出，用生理食鹽水止血、
清潔後，以鉛筆定出前囪 (bregma) 的位置。依據大白鼠腦部定位圖譜 (Paxinos et al., 1980)，選擇海馬迴齒狀迴區域的座標。以前囪 (bregma) 為 原點，在其後方 3.5 mm，離中線 2.0 mm 的位置，埋入一根消毒過的不銹 鋼鋼管，往下植入 3.5 mm 至齒狀迴顆粒細胞層上。鋼管以三根螺絲釘及牙 粉固定於頭蓋骨，再放入等長的細鋼絲於鋼管中避免阻塞。待大白鼠醒來，
正常飼養一週後即可進行實驗。
二、Laminin β1 質體製備
建構 pCMV-Flag-laminin β1 質體基因，使用兩段引子 XhoI-laminin β1-F：5’- CCG CTC GAG CAT GGA AAG GCC CCT CTC CTC TCT CC-3’
以及 ApaI-laminin β1-R : 5’-GGG GGC CCT TAT AAG CAG GTG CTG TAA ACG GCA AC-3’ 進行聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) ，將大鼠海馬迴 laminin β1 全長 5490 bp 之互補去氧核糖核酸複製 出來 (附錄三)。將這 PCR 反應的產物接入含有 XhoI 及 ApaI 切位的 pCMV-Flag 載體上，形成 pCMV-Flag-laminin β1 質體。pCMV-Flag-laminin
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β1 質體是由 cytomegalovirus (CMV) 啟動子驅動且能於哺乳類動物細胞表 現 (附錄四) 。
三、Laminin β1-siRNA 與 SGK1-siRNA 的製備
SGK1-siRNA (Wu et al., 2004) 與 Laminin β1-siRNA 序列由 Ambion 合成，使用兩段引子 sgk-1-F：5’-GUC CCU CUC AAC AAA UCA ATT-3’
及 sgk-1-R：5’-UUG AUU UGU UGA GAG GGA CTT -3’ (Yang et al., 2006)。Laminin β1-siRNA 序列合成由 laminin β1-F：5’-GCA UUU CUG CCU UGA UCC ATT-3’及 laminin β1-R：5’-UGG AUC AAG GCA GAA AUG CTG -3’ (附錄六)。Negative siRNA #1(購自 Ambion) 。利用帶正電聚合物 jetSITM 10 mM (購自 polyplus transfection, France) 當作轉染載體，由於其 對細胞的傷害性極低，且可將帶負電的 Negative siRNA(8 pmol/μl)、laminin β1-siRNA (8 pmol/μl) 及 SGK1-siRNA (8 pmol/μl) 包裹住轉染至大白鼠海 馬迴 CA1 的位置 (兩側各注射 0.7 μl)，64 小時後進行水迷津學習試驗測試。
四、質體基因與聚乙烯亞胺 (PEI) 混合物的製備
將質體基因轉染 (transfection) 進入海馬迴 CA1 區域內之前，須先製備 質體和 polyethylenimine (簡稱 PEI) 混合物。首先純化大量的 Flag-laminin β1 質體，以 5 % 葡萄糖將濃度稀釋至 2.7 μg/μl 。將 0.45 μl 的 0.1 M PEI 和 0.55 μl laminin β1 質體 (2.7 μg/μl) 相互混合，並連續震盪 15 秒使其均 勻混合，於室溫下靜置 15 分鐘後，即可進行海馬迴 CA1 區域注射。動物
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在注射DNA/PEI 混合物後 64 小時才開始進行水迷津空間學習的行為實驗。
五、藥物的製備
1、本實驗中所使用的藥物 MEK 的抑制劑 (U0126) 購自 calbiochem (CA) 先 以100 % DMSO 溶解，配成 13.3 μg/μl 的原始濃度，待欲使用前再以生 理食鹽水 (0.9 % NaCl) 稀釋成 2 μg/μl (15 % DMSO)。U0126 在配製或 是注射入大白鼠海馬迴的過程時，需要注意避光。
2、均質緩衝液 (homogenization buffer) : Tris-HCl (50 mM, PH 8.0)、 NaCl (150 mM) 、 EDTA (2 mM)、NP-40 (1 %)、Na3VO4 (1 mM)、NaF (10 mM)、pepstatin A (20 μg/μl)、leupeptin (20 μg/μl)、aprotinin (20 μg/μl) 與PMSF (1 mM)。
3、5X loading dye : Tris-HCL 0.25M (pH 6.8)、DTT 0.5 M、SDS 10 %，
bromophenal blue 0.5 %、glycerol 50 %
4、電泳緩衝液 (running buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、0.1% SDS
5、轉漬緩衝液 (transfer buffer) : Tris-HCl (25 Mm, pH8.3)、glycin (192 mM)、15% methanol
6、TBST : Tris-HCl (25 Mm, pH8.0)、NaCl (150 mM)、0.05% Tween-20 7、PBS (phosphate buffered saline) : NaCl (137 mM)、KCl (2.7 mM)、
KH2PO4 (1.8 mM)、Na2HPO4 (10 mM) 調至 Ph 7.4
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六、海馬迴 CA1 區域注射
將不鏽鋼管連接聚乙烯管 (PE-20)，聚乙烯管再連接至自動幫浦上的 10 μl 的微量注射筒 (Hamilton syringe)。注射前先以酒精擦拭注射針，然後再 將聚乙烯管及注射針充滿蒸餾水，留一個小氣泡於管中後，才將DNA/PEI 混 合物吸入，如此可避免 DNA/PEI 混合物與蒸餾水混合。以每分鐘 0.35 μl 的速度注入，每側 CA1 區域注射 0.7 μl 的 DNA/PEI 混合物。進行水迷津試 驗前 64 小時，先轉染 laminin β1 siRNA，於水迷津試驗進行第二天時，先 注射 0.7 μl 的 laminin β1 siRNA 溶液，並讓大鼠休息 30 分鐘後，再注射 0.5 μl 的 MEK 抑制劑 (U0126, 2 μg/μl) 至海馬迴 CA1 區域。注射完畢後必 須將不鏽鋼管停留在腦中五分鐘以上，才可將注射針取出，避免DNA/PEI 混 合物隨著針頭的拔出而滲出。
第四節 西方墨點法 (Western blot) 一、蛋白質萃取
將均質緩衝液 (homogenization buffer) 加入冷凍的海馬迴 CA1 區域組 織、紋狀體及杏仁核，置於冰上 15 分鐘 。以超音波震盪器 (Sonifer/cell disruptor，Branson Sonic Power Co, U.S.A.) 打碎細胞，使用小型探針 (micro probe)，輸出強度為第三級，輸出效能為 30 %，震盪 10 次。震碎 的細胞再以 14000 rpm 高速離心，於 4 ℃下離心 10 分鐘，以除去細胞殘
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骸與未被震碎的細胞。離心後，取出上清液，此即為組織均質液。
二、蛋白質濃度測定法
本實驗採用 Bio-Rad 公司出品的 protein assay dye reagent 測量所含蛋 白濃度。利用 Brillant Blue G-250 染劑 (Bio-Rad Labtories, USA) 與蛋白質 結合後，其最大吸收光譜會從 465 nm 轉移到 595 nm 之特性，然後以光譜 儀測定 595 nm 的吸光質。以牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 2、
4、6、8 μg/μl 四種濃度，作為推算樣品濃度的參考曲線。因此將樣品適度 稀釋後，取 1 μl 加至 799 μl 的水中，再加入 200 μl 的染劑，五分鐘後測定 蛋白質濃度。
三、免疫沉澱 (immunoprecipitation, IP)
大白鼠海馬迴 CA1 組織加入均質緩衝液 (homogenization buffer) [50mM Tris-HCl (pH7.4)，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 % IGEPAL CA-630，1 mM PMSF， 20 μg/ml leupeptin， 20 μg/ml aprotinin， 50 mM NaF， 1 mM Na3VO4] 於低溫環境下利用超音波震盪器將組織打碎，4 °C 離心 14,000g， 10 分鐘後吸取上清液，將此組織均質液與 20 μl 的 anti-Flag antibody (Sigma) 進行免疫沉澱兩小時，之後離心 1000 ×g 1 分鐘，清除上 清液，用 PBS (phosphate buffered saline) 清洗沉澱物，再次 1000 ×g 離 心 1 分鐘，移除上清液，重複此步驟兩次，將殘留的 buffer 清除，加入 2X loading dye，於 95 °C 加熱 10 分鐘 ，利用西方墨點分析。
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四、西方墨點法 (Western blot)
樣本經蛋白質定量後加入 5X loading dye 於 95 ℃加熱 10 分鐘，將含 相同濃度蛋白質之樣本以等體積加入 8 % SDS-PAGE 膠片孔中，加入電泳 緩衝液 (running buffer) ，電流設定為 25 mA 以便分離分子量大小不同的蛋 白 質 ， 完 成 後 再 利 用 轉 漬 槽 將 蛋 白 質 自 電 泳 膠 片 轉 漬 到 PVDF 膜 (polyvinylidene difluoride filter membrane, Millipore, USA) 。 首 先 裁 切 PVDF 膜至 8.5 cm* 7 cm 規格，將 PVDF 膜浸泡於 100 % 甲醇 (methanol) 中，於震盪器以 70 rpm 陣搖 20 秒後。以去離子水清洗 2 分鐘，再浸泡於 轉漬緩衝液中。在轉漬槽內預舖兩張經轉漬緩衝液浸潤的濾紙，再舖上已 預處理完全的 PVDF 膜。之後將跑完電泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，以轉漬 緩衝液潤濕，平舖於 PVDF 膜上，並趕走氣泡，在凝膠上加舖兩張經轉漬 緩衝液浸潤的濾紙。完成裝置後，以 110 V 進行轉漬 70 分鐘。將轉漬後的 PVDF 膜做免疫染色。轉印完成的 PVDF 膜放入 2 ﹪BSA (溶於 0.05 % TBST)，在室溫下振搖 1 小時，以阻斷非特異性結合。然後將 PVDF 膜浸 泡於 0.05% TBST 溶液，加入初級抗體於室溫作用一小時或是 4℃下反應 過夜。初級抗體有 rabbit anti-phospho-ERK1/2 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-phospho-AKT473 (1:2000, cell signaling, MA)，rabbit anti-LB1 (1:500, santa cruz, CA)，rabbit anti-phospho-SGK422 (1:1000, santa cruz, CA)，反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘，連續三次，
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再加入 peroxidase-conjugated 二級抗體 (Anti-rabbit IgG, HRP- linked antibody)，室溫下反應 1 小時。反應完後以 0.1 % TBST 溶液清洗 10 分鐘，
連續三次。以 ECLTM 試劑組呈色，將 PVDF 膜加入混合均勻的 HRP substrate 混合液，使溶液均勻遍布於 PVDF 膜上，將 PVDF 膜放入富士冷 光分析儀，可得曝光後的影像，進一步以 NIH ImageJ 軟體進行量化分析。
第五節 即時定量聚合酶連鎖反應 (quantitative real-time polymerase chain reaction)
先取出大鼠的海馬迴 CA1 區域組織，用 RNAspin mini kit (GE Healthcare, UK) 萃取出全部的 RNA，以分光光度計 OD 260 nm 測量取得 RNA 的濃度，接著再進行反轉錄酵素 (reverse transcriptase) 反應 (利用 Promega ImPro – IITM reverse transcriptase)：取 1 μg RNA 加入 2 μg oligo dT (0.5 μg/μl) 並加入 nuclease-free water 使體積達 5 μl，置於 70 ℃反應 5
先取出大鼠的海馬迴 CA1 區域組織，用 RNAspin mini kit (GE Healthcare, UK) 萃取出全部的 RNA，以分光光度計 OD 260 nm 測量取得 RNA 的濃度，接著再進行反轉錄酵素 (reverse transcriptase) 反應 (利用 Promega ImPro – IITM reverse transcriptase)：取 1 μg RNA 加入 2 μg oligo dT (0.5 μg/μl) 並加入 nuclease-free water 使體積達 5 μl，置於 70 ℃反應 5