第三章 實驗結果
第二節 抑制海馬迴 CA1 區域 Laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成
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第二節 抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成 水迷津訓練會使大白鼠海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的表現量減少，
我們進一步探討是否 laminin β1 的表現量降低，會促進大白鼠在水迷津空 間的學習能力。將埋管後的大鼠分為兩組，每組各 6 隻，(1) 控制組：轉染 negative siRNA (以 jetSITM 10 mM 配置成 8 pmol/μl)； (2) 實驗組：轉染 laminin β1 siRNA (配置成 8 pmol/μl) ，以微量幫浦注射 0.7 μl 至兩側的海 馬迴 CA1 區域，於轉染 64 小時後進行水迷津試驗。大白鼠進行四天的水
迷津試驗，每天進行三個學習嘗試，經過 12 個嘗試之後，我們發現抑制海
馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現，會顯著地增加大白鼠對於空間學習的能 力 (F1,20=17.663, p<0.05；圖 4A)，第五天將平台移除，進行探測試驗 (probe trial)，並藉由錄影機記錄大白鼠於各象限停留的時間，實驗顯示轉染 laminin β1 siRNA 的大白鼠在放置平台的象限區域停留的時間較長 (t1,20=4.61, p<0.01；圖 4B)。此外，為進一步確認轉染 laminin β1 siRNA 促進空間記
憶學習的結果，並不是因為大白鼠的運動能力及視覺辨識能力受影響所 致，因此接著進行可見式平台的水迷津試驗。我們將平台露出水面並插上 旗子，游泳模式如同隱藏式平台，結果顯示，控制組與轉染 laminin β1 siRNA 間兩者並無顯著差異 (F1,14=0.024, p>0.05；圖 4C)，證實轉染 laminin β1 siRNA 促進大白鼠尋找平台的能力，並不是透過影響大鼠運動能力和視覺 辨識能力所造成的結果。將進行完行為試驗的大白鼠立即斷頭犧牲取出海
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馬迴 CA1 區域，以西方墨點法分析，結果顯示，轉染的 laminin β1 siRNA 的確有效地抑制 laminin β1 的蛋白質表現量 (F1,10=421.45, p＜0.01；圖 5)。
為確認 laminin β1 siRNA 確實正確轉染至海馬迴 CA1 區域並且抑制 laminin β1 的表現，laminin β1 siRNA sense 序列於 5’端接上 Cy3 螢光物 質，我們將水迷津試驗後的大白鼠進行腦組織切片，於螢光顯微鏡下觀察，
轉染laminin β1 siRNA 的大白鼠組織切片可觀察到 CA1 區域有紅色螢光標 示，(圖 6)，螢光結果顯示 laminin β1 siRNA 確實轉染進入海馬迴 CA1 錐 狀神經細胞區域。
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圖 4、抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進空間記憶的形成。(A) 轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域，會促進大白鼠於水迷津試驗中 的學習 (p<0.05，two-way ANOVA with repeated measure)。(B) 探測試驗 結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 的組別在放置平台的象限區域停留的時 間比較久 (p<0.01, Student’s t-test)。(T：平台象限區域，L：平台左邊象限 區域，R：平台右邊象限區域，O：平台對面的象限區域) (C) 轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域並不會影響大鼠於可見式平台水迷津試驗的學習 (p>0.05，two-way ANOVA with repeated measure) 。實驗結果分別來自 6 隻 negative siRNA 與 6 隻轉染 laminin β1 siRNA 的大鼠，以上實驗數值以 mean±SEM 表示。LB1：laminin β1, Neg：negative。
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圖 5、轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會抑制 laminin β1 蛋白質 的表現量。於水迷津試驗前 64 小時，轉染 laminin β1 siRNA (以 jetSITM 10 mM 配置成 8 pmol /μl ，兩側各注射 0.7 μl) 至海馬迴 CA1 區域，(A) 將大 白鼠海馬迴 CA1 區域取出，進行西方墨點法分析，結果顯示 laminin β1 siRNA 確實會抑制 laminin β1 蛋白質的合成 (p<0.01, Student’s t-test)。實 驗結果分別來自 6 隻 negative siRNA 與 6 隻轉染 laminin β1 siRNA 的大 鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；＊＊, p<0.01 (Student’s t-test)。LB1：
laminin β1, Neg：negative 。
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圖 6、利用組織切片確認 laminin β1 siRNA 是否正確轉染至海馬迴 CA1 區 域。 laminin β1 siRNA sense 序列 於 5’ 端位置接上 Cy3 螢光物質，圖中 顯示的紅色螢光表示 laminin β1 siRNA 確實轉染至海馬迴 CA1 錐狀細胞區 域 (比例尺為 240 μm) 。
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第三節 轉染野生型 laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制水迷津空間 記憶的形成
上述結果顯示，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進大白鼠 的空間學習記憶能力；反之，轉染野生型laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區 域應該會抑制大白鼠的空間學習記憶。動物隨機分為兩組， (1) 控制組：
pCMV-Tag2A 載體 (以 PEI 配製成 1.5 μg/μl) ，n=10， (2) 實驗組 : pCMV-Tag2A- laminin β1 質體 (以 PEI 配製成 1.5 μg/μl) ，n=11。每側海 馬迴 CA1 區域各注射 0.7 μl，於質體 DNA 轉染 64 小時之後進行水迷津學 習試驗。行為結果顯示，轉染野生型laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會 顯著降低大白鼠空間學習的能力 (F1,19=9.456, p＜0.05；圖 7A)。第五天則 進行探測試驗，結果顯示轉染野生型 laminin β1 質體組在平台所在象限搜 尋時間明顯低於控制組 (t1,19=2.86, p＜0.01；圖 8B)。此外，在轉染野生型 laminin β1 後的 48 小時，進行可見式平台水迷津試驗，結果顯示轉染野生 型 laminin β1 和控制組之間並無顯著差異 (F1,11=0.967, p>0.05；圖 7C)。
為確認質體基因是否成功轉染至海馬迴 CA1 區域，我們利用免疫組織
化學染色法，偵測帶有標誌蛋白 Flag 的野生型 laminin β1 蛋白質，如圖 8A 所示，接受野生型 laminin β1 轉染的大鼠，其 CA1 區域有專一性螢光的標 示，顯示野生型 laminin β1 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區域。此外，我們 也利用 Flag 抗體進行免疫沉澱後，再以 laminin β1 抗體進行西方墨點法分
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析，如圖 8B 所示，證實野生型 laminin β1 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區 域使 laminin β1 的表現量增加。
綜合上述結果，海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的表現量會影響空間記 憶的形成，當利用laminin β1 siRNA 抑制海馬迴 CA1 區域內 laminin β1 的 表現時，會明顯促進空間記憶的學習；反之，過度表現野生型 laminin β1 時，則會損害空間記憶的形成，顯示 laminin β1 在學習與記憶中扮演相當 重要的角色。我們將進一步探討 laminin β1 是透過哪些訊息傳遞路徑來影 響空間記憶的形成。
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圖 7、轉染野生型 laminin β1 質體至大鼠海馬迴 CA1 區域會抑制水迷津空 間記憶的形成。(A) 於水迷津試驗前 64 小時，暫時性轉染 laminin β1 質體 (1.5 μg/μl, 兩側各注射 0.7 μl) 至海馬迴 CA1 區域，會顯著降低大白鼠在水 迷津試驗的學習能力 (p<0.05，two-way ANOVA with repeated measure)。
(B) 第五天進行探測試驗，結果顯示轉染 laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區 域，會降低大白鼠的空間記憶形成，導致大鼠停留於平台象限區域的時間 較短 (＊＊, p<0.01, Student’s t-test)。(T：平台象限區域，L：平台左邊象限 區域，R：平台右邊象限區域，O：平台對面的象限區域) (C) 轉染 laminin β1
質體至海馬迴 CA1 區域並不會影響大鼠於可見式平台的水迷津試驗
(p>0.05，two-way ANOVA with repeated measure)。實驗結果分別來自 10 隻轉染 Flag 載體與 11 隻轉染 laminin β1 質體的大鼠，以上實驗數值以 mean±SEM 表示。LB1：laminin β1 。
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圖 8、偵測 laminin β1 質體 DNA 轉染至海馬迴 CA1 區域的位置及其表現 量。(A) 利用免疫組織化學染色法偵測質體基因 laminin β1，二級抗體接上 FITC。上述箭頭所指處為 CA1 區域，綠色螢光代表野生型 laminin β1 質體 確實已轉染至海馬迴 CA1 區域 (比例尺為 240 μm)。(B) 利用 Flag 抗體進 行免疫沉澱法後，再以 laminin β1 抗體進行西方墨點法分析，結果顯示 laminin β1 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區域，使大白鼠 CA1 區域的組織 laminin β1 蛋 白 質 大 量 表 現 。 WB： western blot, 西 方 墨 點 法 ； IP：
immunoprecipitation, 免疫沉澱法；LB1：laminin β1；FITC： Fluorescein
isothiocyanate 。
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第四節 抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會增加 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化
過去研究顯示 ERK1/2, SGK 參與在海馬迴水迷津空間學習與記憶形成 過程，由上述實驗得知，當轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域時，
會促進大白鼠空間學習記憶的能力。為了瞭解轉染 laminin β1 siRNA 促進 空間學習記憶的能力是否透過影響 SGK 及 ERK1/2 的磷酸化，我們在進行
完隱藏式水迷津空間學習試驗後，取出海馬迴CA1 區域的組織，進行西方
墨點法分析。由實驗結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 會明顯地促進 ERK1 (t1,14=6.4, p<0.05；圖 9B)、ERK2 (t1,14=70.72, p<0.01；圖 9C) 及 SGK Ser422 (t1,14=46.86, p<0.01；圖 9D) 的磷酸化，但不影響 AKT Ser473 磷 酸化的改變 (t1,14=0.063, p>0.05, 圖 9E)。由此可知，海馬迴 CA1 區域內的 laminin β1 表現量受到抑制時，促進空間學習與記憶的能力可能與 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化增加有關。
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圖 9、轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域會增加 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化。在進行完水迷津試驗之後，取出海馬迴 CA1 區域的組 織，(A) 西方墨點法實驗結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 與 Negative siRNA 其海馬迴 CA1 區域 SGK 與 ERK 磷酸化的變化情形。當抑制 laminin β1 的表現時，會明顯地增加 (B) ERK1 (p<0.05, Student’s t-test) (C) ERK2 (p<0.01, Student’s t-test) 及 (D) SGK Ser422 的磷酸化 (p<0.01, Student’s t-test)，而不會改變(E) AKT Ser473 的磷酸化 (p>0.05, Student’s t-test) 。 每組各使用6 隻大鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；＊, p<0.05；＊＊, p<0.01 (Student’s t-test)。LB1：laminin β1, Neg：negative。
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第五節 轉染野生型 laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制 ERK1/2 及SGK Ser422 的磷酸化
由先前實驗結果顯示，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現所促進 學習記憶的能力和 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化有密切的關係。反之，
使海馬迴CA1 區域 laminin β1 的表現量增加而損害空間記憶的形成是否會 抑制 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化 ? 因此，將行為實驗後的大白鼠犧 牲，取出海馬迴 CA1 區域，進行西方墨點法分析，由實驗結果顯示 ERK1 (t1,10=6.7, p<0.05；圖 10B)、ERK2 (t1,10= 182.56, p<0.01；圖 10C) 及 SGK Ser422 (t1,10=10, p<0.01；圖 10D) 的磷酸化顯著地減少，但不影響 AKT Ser473 磷酸化的改變 (t1,10=1.28, p> 0.05；圖 10D)。
由以上結果得知，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，進而促進空間學習記憶的形成；反之，
增加海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現則會抑制 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，導致空間學習與記憶無法形成。
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圖10、轉染 laminin β1 質體至大鼠海馬迴 CA1 區域會減少 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化。暫時性轉染 laminin β1 質體 (1.5 μg/μL, 每側各注射 0.7 μl) 至海馬迴 CA1 區域，(A) 由西方墨點法的結果顯示，經過空間學習試驗 後的大鼠，SGK Ser422 位置的磷酸化有顯著減少的現象(p<0.01, Student’s t-test)。(B) ERK1 (p<0.05, Student’s t-test) 和 (C) ERK2 (p<0.05, Student’s t-test) 的磷酸化在同樣的訓練過程後，也有明顯減少的情形。實驗結果分別
來自 10 隻轉染 Flag 載體與 11 隻轉染 laminin β1 質體的大鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；＊, p<0.05；＊＊, p<0.01 (Student’s t-test) 。 LB1：laminin
β1 。
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第六節 抑制海馬迴 CA1 區域 SGK1 的表現會回復 laminin β1 下降所造成 空間記憶促進的能力
上述結果證明，轉染 laminin β1 siRNA 會促進 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，進而促進大白鼠空間學習記憶的形成。我們接著想知道，當同 時轉染 SGK1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域抑制 SGK1 的表現時，是否會抑制 laminin β1 的減少所導致空間記憶的促進作用。將埋管後的大鼠分成三組，
每組各 7 隻，(1) 控制組：轉染 negative siRNA (以 jetSITM 10mM 配置成 8 pmol/μl)，(2) 轉染 laminin β1 siRNA 組 (8 pmol/μl)，(3) 轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 組 。我們利用微量幫浦於海馬迴 CA1 區域兩側各 注射 0.7 μl siRNA 混合物，轉染 64 小時之後，進行隱藏式平台水迷津試驗，
結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 會促進大鼠於水迷津試驗中空間學習與 記憶的能力，轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 則會明顯損害大白鼠 空間記憶的形成 (F2,18=13.65, p<0.01, 與控制組相比較；q=6.8, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；圖 11A)。於第五天進行探測試驗，並將
結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 會促進大鼠於水迷津試驗中空間學習與 記憶的能力，轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 則會明顯損害大白鼠 空間記憶的形成 (F2,18=13.65, p<0.01, 與控制組相比較；q=6.8, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；圖 11A)。於第五天進行探測試驗，並將