第三章 實驗結果
第五節 轉染野生型 Laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制 ERK1/2 及
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第五節 轉染野生型 laminin β1 質體至海馬迴 CA1 區域會抑制 ERK1/2 及SGK Ser422 的磷酸化
由先前實驗結果顯示，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現所促進 學習記憶的能力和 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化有密切的關係。反之，
使海馬迴CA1 區域 laminin β1 的表現量增加而損害空間記憶的形成是否會 抑制 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化 ? 因此，將行為實驗後的大白鼠犧 牲，取出海馬迴 CA1 區域，進行西方墨點法分析，由實驗結果顯示 ERK1 (t1,10=6.7, p<0.05；圖 10B)、ERK2 (t1,10= 182.56, p<0.01；圖 10C) 及 SGK Ser422 (t1,10=10, p<0.01；圖 10D) 的磷酸化顯著地減少，但不影響 AKT Ser473 磷酸化的改變 (t1,10=1.28, p> 0.05；圖 10D)。
由以上結果得知，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現會促進 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，進而促進空間學習記憶的形成；反之，
增加海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現則會抑制 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，導致空間學習與記憶無法形成。
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圖10、轉染 laminin β1 質體至大鼠海馬迴 CA1 區域會減少 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化。暫時性轉染 laminin β1 質體 (1.5 μg/μL, 每側各注射 0.7 μl) 至海馬迴 CA1 區域，(A) 由西方墨點法的結果顯示，經過空間學習試驗 後的大鼠，SGK Ser422 位置的磷酸化有顯著減少的現象(p<0.01, Student’s t-test)。(B) ERK1 (p<0.05, Student’s t-test) 和 (C) ERK2 (p<0.05, Student’s t-test) 的磷酸化在同樣的訓練過程後，也有明顯減少的情形。實驗結果分別
來自 10 隻轉染 Flag 載體與 11 隻轉染 laminin β1 質體的大鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；＊, p<0.05；＊＊, p<0.01 (Student’s t-test) 。 LB1：laminin
β1 。
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第六節 抑制海馬迴 CA1 區域 SGK1 的表現會回復 laminin β1 下降所造成 空間記憶促進的能力
上述結果證明，轉染 laminin β1 siRNA 會促進 ERK1/2 及 SGK Ser422 的磷酸化，進而促進大白鼠空間學習記憶的形成。我們接著想知道，當同 時轉染 SGK1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域抑制 SGK1 的表現時，是否會抑制 laminin β1 的減少所導致空間記憶的促進作用。將埋管後的大鼠分成三組，
每組各 7 隻，(1) 控制組：轉染 negative siRNA (以 jetSITM 10mM 配置成 8 pmol/μl)，(2) 轉染 laminin β1 siRNA 組 (8 pmol/μl)，(3) 轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 組 。我們利用微量幫浦於海馬迴 CA1 區域兩側各 注射 0.7 μl siRNA 混合物，轉染 64 小時之後，進行隱藏式平台水迷津試驗，
結果顯示，轉染 laminin β1 siRNA 會促進大鼠於水迷津試驗中空間學習與 記憶的能力，轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 則會明顯損害大白鼠 空間記憶的形成 (F2,18=13.65, p<0.01, 與控制組相比較；q=6.8, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；圖 11A)。於第五天進行探測試驗，並將 平台移除，轉染 laminin β1 siRNA 的大白鼠在放置平台的象限區域停留的 時間比控制組久(F2,18=1.4, p<0.01；圖 11B)；而轉染 (laminin β1 siRNA＋
SGK1 siRNA) 組的大白鼠尋找平台所在象限區域的時間明顯低於轉染 laminin β1 siRNA 組別，但和控制組沒有差異 (q=10.55, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較)。
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為確認轉染 laminin β1 siRNA 與 SGK1 siRNA 並不影響大白鼠的運動 及視覺辨識能力，我們進行可見式平台水迷津試驗，轉染 (laminin β1 siRNA
＋SGK1 siRNA) 其行為試驗結果與控制組並無顯著差異(F2,24=0.0443, p>0.05；圖 11C)。此外，我們將行為試驗後的大鼠犧牲，取出海馬迴 CA1
區域進行西方墨點法分析。如圖 12A 所示，當轉染 laminin β1 siRNA 抑制 laminin β1 的表現時，會使 ERK1/2 及 SGK Ser422 磷酸化增加，促進空 間學習與記憶的形成。然而，轉染 (laminin β1 siRNA＋SGK1 siRNA) 抑制 laminin β1 及 SGK1 的表現時，SGK Ser422 的磷酸化則明顯地減少 (t2,18=38.17, p<0.01；q=10.9, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；
圖 12F)，而 ERK1 與 ERK2 磷酸化則與轉染 laminin β1 siRNA 組沒有明顯 差異 (q=1.2, p>0.05；圖 12D, q=3.929, p> 0.05；圖 12E)。由行為試驗與 西方墨點法的結果得知，SGK1 可以回復 laminin β1 減少所促進空間學習 與記憶的形成，顯示 laminin β1 透過抑制 SGK1 造成空間記憶的喪失。
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圖 11、抑制海馬迴 CA1 區域 SGK1 的表現會回復 laminin β1 減少所造成之 促進空間記憶的能力。(A)水迷津實驗前 64 小時轉染 laminin β1 siRNA 會 明顯促進大鼠空間學習的能力，然而當轉染 SGK1 siRNA 至海馬迴 CA1 區 域，則會回復 laminin β1 siRNA 所誘發的反應，進而降低大鼠於水迷津試 驗中的學習能力 (p<0.01, two-way ANOVA with repeated measure)。(B) 第 五天進行探測試驗，轉染 (laminin β1 siRNA+SGK1 siRNA) 至海馬迴 CA1 區域會抑制大鼠空間記憶的形成，使大鼠於平台象限停留的時間較短 (＊, p<0.05, one-way ANOVA followed by Newman-Kuels method)。(T：平台
象限區域，L：平台左邊象限區域，R：平台右邊象限區域，O：平台對面 的象限區域) (C) 轉染 (laminin β1 siRNA + SGK1 siRNA) 至海馬迴 CA1 區 域並不會影響大鼠於可見式平台的水迷津試驗 (p>0.01, two-way ANOVA with repeated measure) 。LB1：laminin β1, Neg：negative。
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(A)
(E) (C)
(D) (B)
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續前頁
圖 12、轉染 SGK1 siRNA 會抑制 laminin β1 siRNA 所誘導之 SGK Ser422 磷酸化的增加。於水迷津試驗進行完畢後， (A) 將大白鼠海馬迴 CA1 區域 取出，進行西方墨點法分析，轉染 laminin β1 siRNA 明顯地增加 SGK Ser422 的磷酸化，若是轉染 SGK1 siRNA 則會阻斷 SGK Ser422 磷酸化的 作用。由量化結果得知 (B) laminin β1 (p<0.01) 和 (C) SGK1 蛋白質表現量 明顯地受到抑制 (p<0.01)，(D) 轉染 laminin β1 siRNA 會促進 ERK1 磷酸 化增加 (p<0.01)，而轉染 SGK1 siRNA 組與轉染 laminin β1 siRNA 組其 ERK1、(E) ERK2 的磷酸化無顯著差異 (p>0.05)。實驗數值以 mean± SEM 表示；＊＊, p<0.01 (one-way ANOVA followed by Newman-Kuels method) 。 LB1：laminin β1, Neg：negative。
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第七節 抑制海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化會回復 laminin β1