第三章 實驗結果
第七節 抑制海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化會回復 Laminin β1 siRNA
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第七節 抑制海馬迴 CA1 區域 MAPK/ERK 的活化會回復 laminin β1 siRNA 所促進空間學習與記憶的形成，同時阻斷 laminin β1 將訊息傳遞至 SGK1
當抑制 laminin β1 的表現時，ERK1/2 及 SGK1 的磷酸化會增加，促使 空間記憶的形成，我們想進一步了解是否抑制海馬迴 CA1 區域 ERK1/2 (MEK 抑制劑, U0126) 的活性會阻斷 laminin β1 將訊息傳遞至 SGK1，同時 降低因為學習試驗所引起的 ERK1/2 及 SGK1 磷酸化。我們將大鼠隨機分 為三組，包含 (1) 控制組：轉染 (negative siRNA＋15 % DMSO)，(2)實驗 組：轉染 (laminin β1 siRNA ＋15 % DMSO)，(3)實驗組：轉染 (laminin β1 siRNA＋U0126) (2 μg/μl U0126 於 15 % DMSO, 於每天進行水迷津試驗之 前，先於兩側海馬迴 CA1 區域各注射 0.5 μl U0126)。行為試驗前 64 小時 及水迷津試驗進行的第2 天，以微量幫浦於兩側海馬迴 CA1 區域各注射 0.7 μl 的 siRNA，之後於每天進行水迷津試驗之前給予一劑 U0126，注射完 30 分鐘後，再進行行為試驗。
大白鼠進行水迷津試驗四天，每天三個學習嘗試，逃離時間為 60 秒，實驗
結果顯示，轉染 (laminin β1 siRNA＋U0126) 組的大鼠，在水迷津空間學習 試驗中明顯需要花費較長的時間才能尋找到平台 (q=6.41, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；圖 13A)。第五天將平台移除進行探測試 驗，結果顯示 (laminin β1 siRNA＋U0126) 組的大鼠尋找平台放置區域所花 費的時間較長 (q=4.354, p<0.01, 與 laminin β1 siRNA 實驗組相比較；圖
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13B)。此外，為確定 U0126 並不會影響運動能力，我們接著進行可見式平 台水迷津試驗，證實每天給予的 U0126 並不會影響大鼠的視覺辨認及運動 行為能力 (F2,21=0.441, p>0.05；圖 13C)。行為實驗結束之後，立即犧牲大 白鼠，取出海馬迴 CA1 區域組織，藉由西方墨點法觀察 laminin β1、SGK1、
ERK1/2 以及 AKT 磷酸化的情形，如圖 14A 所示，統計結果顯示轉染 laminin β1 siRNA 至海馬迴 CA1 區域，確實會抑制 (laminin β1 siRNA ＋15 % DMSO 組) 與 (laminin β1 siRNA＋U0126 組) 的 laminin β1 蛋白質表現量 (F2,21=20.017, p<0.01, q=8.035 與 7.412, p<0.01；圖 14B)。與控制組比較，
轉染 laminin β1 siRNA ＋15 % DMSO 組其 SGK Ser422 (F2,21= 24.958, q=8.998, p<0.01；圖 14C) 、ERK1 (F2,21=30.629, q=7.879, p<0.01；圖 14D)、ERK2 (F2,21=14.203, q=7.249, p<0.01；圖 14E) 的磷酸化皆會增加；
而在水迷津學習試驗後， laminin β1 siRNA＋U0126 組與 laminin β1 siRNA
＋15 % DMSO 組相比較，其 SGK Ser422 (F2,21= 24.958, q=8.26, p<0.01；
圖 14C) 、 ERK1 (F2,21=30.629, q=10.672, p<0.01 ； 圖 14D) 、 ERK2 (F2,21=14.203, q=5.412, p<0.01；圖 14E) 的磷酸化明顯低於只轉染 laminin β1 siRNA＋15 % DMSO 的組別，而 AKT Ser473 的磷酸化則沒有差異 (F2,21=0.0283, p>0.05；圖 14F )。這些結果顯示，MEK 抑制劑 (U0126) 會 回復laminin β1 siRNA 所增加海馬迴 CA1 區域 SGK1 及 ERK1/2 的磷酸化 情形 ，進而抑制大鼠空間學習與記憶的形成。
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(B)
圖 13、 MEK 抑制劑 (U0126) 會阻斷 laminin β1 siRNA 所促成空間記憶之形成。
(A) 進行水迷津實驗前 64 小時轉染 laminin β1 siRNA，並於每天進行水迷津試驗 前 30 分鐘，施打一次 MEK 抑制劑 (U0126，2 μg/μl，兩側海馬迴 CA1 區域各注 射 0.5 μl)，明顯呈現空間記憶能力變差 (p<0.05, two-way ANOVA with repeated measure)。(B) U0126 處理的大鼠在探測試驗中會降低空間記憶的形成 (＊＊, p<0.01, one-way ANOVA followed by Newman-Kuels method)。(T：平台象限區
域，L：平台左邊象限區域，R：平台右邊象限區域，O：平台對面的象限區域) (C) 轉染laminin β1 siRNA 與 ERK 抑制劑至海馬迴 CA1 區域並不會影響大鼠於可見 式平台的水迷津試驗 (p>0.05, two-way ANOVA with repeated measure)。實驗數 值以 mean±SEM 表示。LB1：laminin β1, Neg：negative。
(A)
(C)
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(A)
(B) (C)
(E) (D)
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續前頁
圖 14、抑制 MAPK/ERK 的活化，同時會阻斷 laminin β1 siRNA 所誘導 SGK Ser422 磷酸化的增加。每天於水迷津試驗前 30 分鐘，施打一劑 MEK 抑制劑 (U0126，2 μg/μl，兩側海馬迴 CA1 區域各注射 0.7 μl)，再進行行為試驗。(A)
大鼠於水迷津空間訓練後，將海馬迴CA1 區域取出，以西方墨點法進行分析，
實驗結果呈現顯示 laminin β1 siRNA 與 MEK 抑制劑處理後對於 SGK Ser422 及 ERK1/2 磷酸化蛋白質表現量的影響。由量化結果得知 (B) laminin β1 的蛋 白質表現明顯受到 laminin β1 siRNA 抑制 (p<0.01)，前處理 MEK 抑制劑則會 降低 (C) SGK Ser422 (p<0.01)、(D) ERK1 的磷酸化 (p<0.01) 及 (E) ERK2 的 磷酸化 (p<0.01) 。 (F) AKT Ser473 位置的磷酸化則不會受到前處理 MEK 抑制 劑而有所改變 (p>0.05)。實驗數值以 mean±SEM 表示；＊, p<0.05 ；＊＊, p<0.01, 實驗組與控制組比較; #, p<0.05； ##, p<0.01；為 LB1 siRNA 實驗組與 LB1 siRNA+U0126 實驗組相比較(one-way ANOVA followed by Newman-Kuels method) 。LB1：laminin β1, Neg：negative 。
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第四章
討 論
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討論
長久以來，科學家對於 laminin 的瞭解僅在於周邊神經系統及表皮細胞 中，對於它在中樞神經可塑性與學習、記憶上扮演的角色十分不清楚。
laminin 具有組織特異性，且目前發現具有 15 種以上的 laminin，不同的 α、
β、γ 鏈表現的時間、位置都不盡相同，laminin β1 為 laminin β 家族的成員 之一，目前發現laminin β1 蛋白質會在海馬迴及紋狀體中表現，但是 laminin β1 是否會參與學習記憶的形成以及下游的訊息傳遞路徑還有待釐清。文獻 指出laminin 與神經發育、存活、神經再生有關，當小鼠海馬迴細胞暴露在 細胞外毒性時，神經細胞會與laminin-10 (α5β1γ1) 結合使細胞存活，以抵 抗外來毒性的攻擊 (Chen et al., 2003)。因此，在外在環境的刺激下，laminin β1 在中樞神經系統扮演的角色為何，尤其在學習與記憶相關的研究領域，
目前尚未有相關的文獻報導，值得我們進一步探討。
本論文證實水迷津試驗會降低大鼠海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表 現，但是在杏仁核及紋狀體的表現並無明顯差異，由於海馬迴特殊的結構 與複雜的神經迴路，周圍環境的刺激經由海馬迴投射至大腦皮層，同時將 短期記憶轉換成長期記憶，顯示出 laminin β1 在空間記憶形成過程中扮演
重要的角色，其改變只發生在海馬迴CA1 區域，具有組織特異性，而海馬
迴CA1 區域已知是參與空間記憶重要的腦區 (Moser et al., 1995) 。先前的 研究發現環境的刺激會有效地促進突觸的可塑性。為了更進一步了解
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laminin β1 基因在空間學習的角色，本論文使用 laminin β1-siRNA 與
Flag-laminin β1 質體基因轉染至海馬迴 CA1 區域，結果顯示減少 laminin β1 會促使 SGK Ser422 及 ERK1/2 的磷酸化增加，進而促進大白鼠於水迷津 試驗的空間學習能力；反之，海馬迴CA1 區域內 laminin β1 的表現量增加 時，SGK Ser422 及 ERK1/2 的磷酸化則會明顯減少，進而抑制水迷津空間 記憶的形成。此外，轉染SGK1-siRNA 會阻斷 laminin β1-siRNA 促進大白 鼠空間記憶學習的能力，SGK Ser422 磷酸化也有減少的現象，但不影響 ERK1/2 的磷酸化，因此我們認為 laminin β1 會抑制 SGK Ser422 磷酸化 進，而影響大白鼠空間記憶的形成。利用 U0126 (MEK 抑制劑) 抑制 ERK1/2 的活性能顯著抑制 laminin β1 –SGK1 這條訊息傳遞路徑，進而抑制大鼠空 間學習與記憶的形成，再次證實，ERK1/2 為活化 SGK1 之上游訊息分子。
實驗結果發現 laminin β1 參與大白鼠於水迷津空間學習記憶的形成，而 laminin β2 的表現並不會受到水迷津試驗的影響而有所改變。由於 laminin β2 目前發現主要和神經肌肉接合點 (neuromuscular junction) 及腎臟絲球 體 (kidney glomerulus) 基底膜有關，laminin β2 表現在骨骼肌細胞以 laminin-11 (α5β2γ1)、laminin-9 (α4β2γ1)、laminin-4 (α2β2γ1) 的形式存在 神經肌肉接合點的位置，laminin β2 基因剔除小鼠會產生突觸前後分化不正 常的現象，且於出生三週即會死亡，造成神經肌肉突觸及腎臟絲球體缺陷 (Durbeej, 2009)，而這些不正常的現象可經由骨骼肌細胞專一性的表現
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laminin β2 cDNA 而回復，證實 laminin β2 與運動神經末梢的分化相關 (Miner, 2008)。在神經肌肉接合點處 laminin β2 會與鈣離子通道結合以幫 助運動神經末梢釋放神經傳導物質，使受體聚集進而促進突觸前的分化。
而人類 laminin β2 基因突變則會造成 Pierson syndrome，一種先天性腎臟 病，會形成腎膈硬化 (mesangium sclerosis) (Gubler, 2008)。很顯然 laminin β2 雖 然 在 大 腦 及 海 馬 迴 皆 有 表 現 ， 但 是 主 要 功 能 與 神 經 肌 肉 接 合 (neuromuscular junction) 及腎臟絲球體較有關聯 (Durbeej, 2009)，和本論 文証實 laminin β2 並不會參與大白鼠於水迷津空間記憶的形成相符合。
另一方面，抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 的表現量會促進空間記憶 的形成，當 laminin β1 表現量減少時，是否會使其他層黏蛋白次單元的表 現量產生代償的現象進而促進記憶的形成? 文獻指出，laminin β2 基因剔除 小鼠，其laminin β1 會補償 laminin β2 的缺失，因此所觀察到的症狀沒有 預期中的嚴重 (Noakes et al., 1995)。然而，本實驗並未發現 laminin β2 的 表現量有受到影響，可能原因是表現在大白鼠海馬迴的主要層黏蛋白為 Laminin-10 (α5β1γ1)，而並非 laminin-11 (α5β2γ1)、laminin-9 (α4β2γ1)、
laminin-4 (α2β2γ1) (Patton et al., 1997)。此外，laminin β1 的減少是否也 會影響 α5、γ1 次單元的表現量，仍待進一步證實。
然而 laminin β1 是如何傳遞訊息至 ERK1/2? 許多研究指出整合蛋白 (integrin) 為 laminin 的接受體，且整合蛋白也已證實參與在海馬迴突觸的可
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塑性與空間記憶的形成 (Chan et al., 2003)，當整合蛋白受到細胞外基質的 訊息活化後，會活化下游 FAK 與 Src 家族的蛋白質酪胺酸激酶，FAK 被磷 酸化後，SRC 會產生一個結合位置給 GRB2 進而活化 Ras-MAPK 這條訊 息傳遞路徑。 (Schlaepfer and Hunter, 1998)，一旦阻斷整合蛋白功能時，
就會破壞長期增益現象的穩固及大白鼠記憶的穩固過程 (Bahr et al., 1997)。整合蛋白是由 α、β 次單元共同組成的雙聚體穿膜蛋白。若 β1 整合 蛋白在大白鼠前腦 (forebrain) 有缺失的現象，則會抑制海馬迴長期增益現 象發生(Chan et al., 2006; Huang et al., 2006)。α3 整合蛋白於前腦剔除的 小鼠，不只海馬迴長期增益現象受到抑制，並且工作記憶 (working memory) 的形成也受到影響 (Chan et al., 2007)。然而 laminin β1 是否會透過整合蛋 白傳遞訊號至細胞內，進而影響神經可塑性及記憶的形成 ? 可利用 α3 整合 蛋白受體功能阻斷性抗體 (function blocking α3-integrin antibody) (Kramar et al., 2002) 阻斷細胞外基質 laminin β1 與 α3 整合蛋白受體作用，若是下 游訊息 ERK-SGK 受到抑制，即可證明 laminin β1 是否透過 α3 整合蛋白而 影響空間記憶的形成。
本實驗採用 U0126 (MEK 抑制劑) 抑制 ERK1/2 的活性，由於 U0126 可同時抑制 MEK1 與 MEK2，而 PD98059 會選擇性抑制 MEK1；就抑制 MEK1 而言，U0126 比 PD98059 具有更高的親和力 (Favata et al., 1998)。
此外，使用 U0126 除了影響 SGK 的轉譯後修飾 (磷酸化) ，對於 SGK 的轉
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錄也有調控作用，文獻指出，U0126 (MEK 抑制劑) 處理 15 分鐘，會降低 經由生長因子刺激細胞時，所增加的 sgk mRNA 表現 (Mizuno and Nishida, 2001)。但本實驗 U0126 只處理 30 分鐘，因此應不至於影響 SGK 蛋白質 表現。
除了整合蛋白，目前也發現層黏蛋白其他受體可能參與記憶的形成，例 如：dystroglycans、syndecans 及細胞黏附分子 (cell adhesion molecule)。
Dystroglycans 由於轉錄後修飾可產生兩種產物分別為 α-dystroglycan 與 β-dystroglycan，而 α1、α2 層黏蛋白的 C 端 G 次單元的部分會與 dystroglycan 結合 (Talts et al., 1999)，dystroglycan 除了會在肌肉細胞表 現，也會在海馬迴突觸區域表現 (Zaccaria et al., 2001)，將 α-dystroglycan 與 β-dystroglycan 在大腦局部性剔除，可發現層黏蛋白與 dystroglycan 親 和力下降，且海馬迴內長期增益現象也受到抑制 (Moore et al., 2002)。
Syndecan 是細胞表面上的一種穿膜蛋白多醣，含有大量的硫酸乙醯肝素 (heparan sulfate)，藉由硫酸乙醯肝素與細胞間基質或生長因子結合調節下 游的訊息路徑。目前在脊椎動物中發現四種 syndecan，分別為 syndecan-1 到 syndecan-4。syndecan-3 表現在海馬迴錐狀神經元內，且會調控神經突
Syndecan 是細胞表面上的一種穿膜蛋白多醣，含有大量的硫酸乙醯肝素 (heparan sulfate)，藉由硫酸乙醯肝素與細胞間基質或生長因子結合調節下 游的訊息路徑。目前在脊椎動物中發現四種 syndecan，分別為 syndecan-1 到 syndecan-4。syndecan-3 表現在海馬迴錐狀神經元內，且會調控神經突