引子

本研究所使用的引子為委託生技公司合成(基龍米克斯，台灣)。詳細序列整理於表 三。

二 、實驗方法 1. 表現載體之建構

1.1 質體抽取

將攜帶質體p0390-sdi1-ORFM 的大腸桿菌菌株於含有 50 μg/ml kanamycin 之 3 mL LB 中 37^oC 隔夜培養後，使用 Miniprep plasmid extraction kit (Genemark，台灣) 抽取質體。

1.2 聚合酶鏈鎖反應

將稀釋至適當濃度之質體pHi-hyg-egfpS 作為模版，並且使用引子組 (AseI-HiGPD-F / XmaI-Nos-R)擴增出目標片段(AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI)，PCR 之反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、0.1 μM dNTP、1.5 μL 10x Pfu buffer、0.075 μL Pfu DNA polymerase (5 U/μL)、7.225 μL ddH2O，總體積為 15 μL。

反應條件見表四。反應完之產物使用洋菜膠體進行電泳確認產物大小。

1.3 洋菜膠體電泳

將DNA 與 6x 追蹤染劑混合後，以 1%洋菜膠體進行電泳，於 0.5x TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0)以電壓 140 伏特進行電泳 20 分鐘。經 ethidium bromide 外染 10 ~ 15 分鐘後，在 UV box 上照相、觀察結果。

1.4 限制酶截切

將質體p0390-sdi1-ORFM 與 PCR 產物 AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI 分別使用 限制酶AseI 與 XmaI 於 37^oC 反應兩個小時。反應後溶液使用 DNA clean up kit (Genemark，台灣)進行純化。

1.5 質體黏合與轉形

確認純化後DNA 濃度與大小，以莫耳數比 vector：insert = 3：1 的條件，加 入1 μL T4 接合酶、10x 緩衝液 A、10 x 緩衝液 B (益生，台灣)以及無菌水使最終 體積為10 μL，於 4^oC 反應隔夜。反應後溶液使用 heat-shock 轉形法將 DNA 送入

大腸桿菌DH5α 勝任細胞中，於含 50 μg/ml kanamycin 之 LB 固態平板培養基上培 養16 ~ 18 小時。各質體建構流程如圖六所示。

1.6 大腸桿菌轉形株篩選

以牙籤挑取上一步驟之大腸桿菌菌落，加入專一性引子與試劑進行菌落聚合 酶連鎖反應(Colony PCR)，PCR 反應條件見表四。反應完成後以洋菜膠體電泳分析，

確認目標產物大小無誤後，抽取質體進行限制酶截切確認並將正確質體進行核酸 定序(基龍米克斯，台灣)。

2. 農桿菌媒介轉形法

2.1 農桿菌勝任細胞製備

挑取農桿菌單一菌落至3 mL LB broth，在 28^oC，250 rpm 下振盪培養 48 小時，

使OD600吸光值達到1.0-1.5 之後，稀釋菌液 100 倍以 100 mL LB broth 大量培養 18 小時，使 OD600吸光值達到1.5-2.0。將菌液以 4^oC，3000 g 離心十分鐘，去除 上清液後以等體積的冰鎮無菌水將菌體懸浮，如此重複五次，最後一次以400 μL 冰鎮的10%無菌甘油將菌體懸浮，以每管 40 μL 分裝至微量離心管，置於 -80^oC 保存。

2.2 以電穿孔法將表現載體移入農桿菌

將2 μL 已構築好之表現載體加入 40 μL 農桿菌勝任細胞，均勻混合並於冰上 放置2 分鐘，加入電穿孔石英管中，將管壁之水分以拭鏡紙擦乾，以 1.25 kV 進行 電穿孔(Chamber gap : BTX disposable cuvette P/N 610 (1 mm gap)，field strength : 12.5 kV/cm，capacitance : 25 F，resistance : 200 ohms，pulse Length : 5.0 msec)。

操作完成後於無菌操作台內加入400 μL LB broth，混勻後全數吸到微量離心管中，

於室溫靜置培養2.5 小時。取 25 ~ 50 μL 菌液均勻塗抹在含有 50 μg /mL kanamycin 之LB 固態平板培養基上，以 28^oC 培養兩天。

2.3 農桿菌轉形株篩選

以牙籤挑出上一步驟之農桿菌菌落，加入專一性引子與試劑進行菌落聚合酶 連鎖反應(Colony PCR)，反應條件見表四。反應完成後以洋菜膠體電泳分析，確認 目標產物大小。 

2.4 農桿菌培養

將農桿菌轉形株於3 mL 含 50 μg/ml kanamycin 之 LB broth，以 28^oC、250 rpm 振盪培養48 小時。接著取 50 μL 菌液至 50 mL 含 50 μg/ml kanamycin 之 LB broth，

以28^oC、250 rpm 振盪培養 12 ~ 16 小時。以 4^oC，4,000 g 之條件離心十分鐘後將 菌體以含有200 μM 誘導物 acetosyringone (AS)之 IM broth 懸浮均勻使菌液 OD600 = 1，並準備與美白菇菌絲塊共培養。IM 培養基依表五配製而得。

2.5 真菌與農桿菌共培養

以打孔器將生長於MYGpA 之美白菇菌絲，打成數個直徑約 0.5 mm 的顆粒菌 絲塊(Modified mycelial pellets, MMP)，菌絲塊加入以 IM broth 懸浮後之農桿菌菌液 並靜置培養4 ~ 6 小時，接著將菌絲塊置於含有誘導物 AS 之 IM 平板培養基上，

共培養三到六天。

2.6 農桿菌之去除

共培養完成後，以含有200 μM cefotaxime 的無菌水洗滌五次並以滅菌後的擦 手紙吸乾殘留液體，將農桿菌從菌絲塊中去除。

2.7 轉形株篩選

將農桿菌去除後之菌絲塊置於選擇性培養基進行篩選。使用含有200 μM cefotaxime 以及 7.5 μg/ml hygromycin B 的 MYGP 培養基確認表現潮黴素抗性基因 之p0390-AH-Aiegfp 轉形株；使用含有 200 μM cefotaxime 以及 3 μg/ml carboxin 的 MYGP 培養基確認表現萎銹靈抗性基因之 p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株。以上皆於 23^oC 靜置培養。

3. 農桿菌媒介重複轉形法

p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株經過至少二次繼代後對該轉形株再次進行農桿菌媒

介轉形，即稱作農桿菌媒介重複轉形法或是重複轉形。重複轉形分為兩種策略，

一是雙質體轉形策略(two-vector transformation)，另一種稱為單質體轉形策略 (one-vector transformation)。

3.1 雙質體轉形策略

雙質體轉形策略係利用帶有表現載體p0390-AH-Aiegfp 之農桿菌對 p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株再次進行農桿菌媒介轉形，轉形後使用含有 200 μM cefotaxime、3 μg/ml carboxin 以及 3 μg/ml hygromycin B 的 MYGP 培養基進行篩選，

即可得到雙重抗藥性之二次轉形株。

3.2 單質體轉形策略

單質體轉形策略係利用帶有表現載體p0390-Cbx-Hiegfp 之農桿菌再次對 p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株再次進行農桿菌媒介轉形法，便可取得單一抗藥性之二次 加入500 μL CTAB buffer，並以組織研磨棒研磨，研磨後加入 3 μL 2-mercaptoethanol，

混合均勻後於65^oC 放置 30 分鐘。接著加入 500 μL CI (chloroform : isoamylalcohol =

最後加入100 μL ddH2O 將其回溶。CTAB buffer 與 wash buffer 如表六配置。

4.2 聚合酶連鎖反應

將轉形株和野生株的染色體 DNA 稀釋至適當倍數，取 5 μL 當做模版，PCR 之反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、0.1 μM dNTP、1.5 μL 10x Taq buffer、0.075 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL)、7.225 μL ddH2O，總體積為 15 μL。

所用引子以及反應條件見表四。反應產物使用洋菜膠體進行電泳確認產物大小。

4.3 螢光顯微鏡觀察

利用螢光顯微鏡Eclipse E600 (Nikon, Kanagawa, Japan)觀察菌絲，以藍光(395 nm)激發下散發出綠色螢光(509 nm)之菌絲即為成功表現綠色螢光蛋白質之轉形株。

螢光視野下的相機曝光時間皆為4 秒。

4.4 蛋白質粗萃取

收取液態培養的菌絲體，將之冷凍乾燥後使用液態氮研磨成粉末，每50 mg

菌粉加入1 mL 蛋白質萃取液(300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100, pH 7.4)，使用超音波機(Sonics & Materials Inc., USA)進行均質化，

於冰上放置一小時後，以4^oC，13,000 g 的條件離心 30 分鐘，收取上清液，接著 再使用相同條件離心一次並收取上清液，於 -80^oC 保存。

4.5 蛋白質定量

使用bicinchoninic acid (BCA)法進行可溶性總蛋白質定量。使用 bovine serum albumin (Sigma, Germany)配置 0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/ml 共八種濃度之標準品，將10 μL 標準品或待測蛋白質萃取液加至 96 孔微量滴定盤，

再加入 200 μL BCA working reagent (Pierce, Rockford, IL, Reagent A:B, 50:1, v/v)於 37^oC 避光呈色 30 分鐘後偵測 562 nm 之吸光值。將標準品測得之吸光值製作蛋白 質含量校正曲線，以換算粗萃液的可溶性總蛋白質含量。

4.6 酵素免疫分析法

酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)依目的分為多種

類型，本研究使用間接型酵素免疫分析法(Indirect sandwich ELISA)定量轉形株之綠 色螢光蛋白質。先以coating buffer 將 mouse anti-GFP 單株抗體(ab1218, Abcam, UK)稀釋 6,000 倍，加 100 μL 於 ELISA 專用 96 孔微量滴定盤中，於 23^oC 靜置 16 小時後以200 μL PBST buffer 清洗三次後，加入 300 μL gelatin-NET 於 37^oC 下靜置 2 小時後去除多餘液體備用。以 EGFP (BioVision, USA)當作標準品，以 gelatin-NET 稀釋成6、5、4、3、2、1、0.5 以及 0 ng/ml 共八種濃度標準品，將 100 μL 標準品 溶液和轉形株粗萃取液加至96 孔微量離心盤，於 37^oC 靜置 1 小時，再以 PBST 清洗四次後，加入100 μL 以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 rabbit anti-GFP 多株抗體 (ab6556, Abcam, UK)於 37^oC 靜置 1 小時，以 PBST 清洗五次後，加入 100 μL 以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 goat anti-rabbit IgG HRP conjugate (PerkinElmer, USA) 於37^oC 靜置 1 小時，以 PBST 清洗六次後，加入 100 μL 3,3’,5’5-tetramethylbenzidine 基質溶液(TMB One Component HRP Microwell Substrate, BioFX, USA)避光呈色 30 分鐘後，以2 N H2SO4終止反應，偵測450 nm 之吸光值。將標準品測得之吸光值

Polyvinylidendifluroid (PVDF) membrane 浸泡於 100%甲醇中 10 分鐘，再以半乾式 電泳轉印槽(Genmedika Biotechnology，台灣)，依序放置以轉印緩衝液浸濕之濾紙 兩片、電泳膠片、PVDF 膜、轉印緩衝液浸濕之濾紙兩片，使用 60 mA，30 分鐘 之條件將蛋白質轉印至PVDF 膜上。取出轉印後 PVDF 膜以 gelatin-NET 室溫振盪 浸洗1.5 小時，倒去 gelatin-NET 後加入以 gelatin-NET 稀釋 6,000 倍之 mouse anti-GFP 一次抗體(Living colors A.v. Monoclonal [JL-8], USA)室溫振盪浸洗 1 小時，

再以PBST buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。加入以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 goat anti-mouse IgG AP conjugate 二次抗體(PerkinElmer, USA)室溫振盪浸洗 1 小時，再

以PBST buffer 清洗四次，每次 10 分鐘。最後使用 NBT/BCIP 基質液避光呈色，

直至紫色條帶出現後以清水漂洗終止反應。上述所用之試劑配方如表八。

4.8 即時定量聚合酶鏈鎖反應

利用即時定量聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)測定一次轉形株母體與二次轉形 株之外源基因拷貝數，目標基因為egfp，所用之引子對為 egfp362-F 與 egfp468-R，

參考基因為GAPDH，所用之引子對為 HmGPD-F 與 HmGPD-R。取 5 μl 轉形株 DNA 為模版，其餘反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、4.2μl ddH2O 與 10 μl GM SYBR qPCR Mix (Genemark，台灣)，總體積為 20 μl，反應條件為 94^oC，

3 min 後接著進行 35 次循環的 94^oC，15 sec 與 60^oC，31 sec。計算方法使用比較性 Ct 法(Comparative Ct method)，ΔCt 代表 egfp 之 Ct 值減去 GAPDH 之 Ct 值，ΔΔCt 代表二次轉形株的ΔCt 減去一次轉形株的 ΔCt，最後以 2^-ΔΔCt表示差距倍數。

第三章 結果

一 、表現載體建構 1. 重組質體確認

1.1 p0390-Cbx-Hiegfp

將質體p0390-sdi1-ORFM 與 PCR 產物 AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI 進行接合 反應並將反應後的質體送入大腸桿菌DH5α 勝任細胞，接著以引子對 egfp-F/egfp-R 進行colony PCR，挑取帶有目標質體的菌落，將質體抽出後以限制酶 BglII 與 AseI 進行截切，可得到1.2 kb、2.2 kb 以及 7.6 kb 的預期片段，如圖七。將質體

p0390-Cbx-Hiegfp 進行定序以確認序列無誤，如圖八。

二 、農桿菌媒介轉形法 1. 表現載體轉入農桿菌

將表現載體p0390-Cbx-Hiegfp 與 p0390-AH-Aiegfp 分別以電穿孔法送入農桿 菌GV3101 勝任細胞，接著以引子對 egfp-F/egfp-R 進行 colony PCR，順利轉形者 可於洋菜膠體電泳後，得到0.7 kb 的片段，如圖九。表現載體 p0390-Cbx-Hiegfp 與p0390-AH-Aiegfp 亦送入農桿菌 LBA4404 勝任細胞，並以引子對 egfp-F/egfp-R 進行colony PCR，結果如圖十。

2. 美白菇與農桿菌共培養

2.1 共培養過程

將野生型美白菇菌絲塊(Modified mycelial pellets, MMP)與帶有表現載體的農

桿菌轉形株進行共培養，於IM 平板培養基上共培養的情況如圖十一。

2.2 篩選轉形株

將共培養後的菌絲塊去除農桿菌並轉移至選擇性培養基上進行轉形株篩選。

p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株於含有 200 μM cefotaxime 與 3 μg/ml carboxin 的選擇性培

養基進行篩選，如圖十二。p0390-AH-Aiegfp 轉形株於含有 200 μM cefotaxime 與 7.5 μg/ml hygromycin B 的選擇性培養基進行篩選，如圖十三。

上述轉形株於選擇性培養基上生長一定大小後，挑取外緣之新生菌絲轉移至 新的選擇性培養基上繼續培養，以排除偽陽性的情況，如圖十四。

三 、農桿菌媒介重複轉形法

三 、農桿菌媒介重複轉形法