一 、表現載體建構 1. 重組質體確認
1.1 p0390-Cbx-Hiegfp
將質體p0390-sdi1-ORFM 與 PCR 產物 AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI 進行接合 反應並將反應後的質體送入大腸桿菌DH5α 勝任細胞，接著以引子對 egfp-F/egfp-R 進行colony PCR，挑取帶有目標質體的菌落，將質體抽出後以限制酶 BglII 與 AseI 進行截切，可得到1.2 kb、2.2 kb 以及 7.6 kb 的預期片段，如圖七。將質體
p0390-Cbx-Hiegfp 進行定序以確認序列無誤，如圖八。
二 、農桿菌媒介轉形法 1. 表現載體轉入農桿菌
將表現載體p0390-Cbx-Hiegfp 與 p0390-AH-Aiegfp 分別以電穿孔法送入農桿 菌GV3101 勝任細胞，接著以引子對 egfp-F/egfp-R 進行 colony PCR，順利轉形者 可於洋菜膠體電泳後，得到0.7 kb 的片段，如圖九。表現載體 p0390-Cbx-Hiegfp 與p0390-AH-Aiegfp 亦送入農桿菌 LBA4404 勝任細胞，並以引子對 egfp-F/egfp-R 進行colony PCR，結果如圖十。
2. 美白菇與農桿菌共培養
2.1 共培養過程
將野生型美白菇菌絲塊(Modified mycelial pellets, MMP)與帶有表現載體的農
桿菌轉形株進行共培養，於IM 平板培養基上共培養的情況如圖十一。
2.2 篩選轉形株
將共培養後的菌絲塊去除農桿菌並轉移至選擇性培養基上進行轉形株篩選。
p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株於含有 200 μM cefotaxime 與 3 μg/ml carboxin 的選擇性培
養基進行篩選，如圖十二。p0390-AH-Aiegfp 轉形株於含有 200 μM cefotaxime 與 7.5 μg/ml hygromycin B 的選擇性培養基進行篩選，如圖十三。
上述轉形株於選擇性培養基上生長一定大小後，挑取外緣之新生菌絲轉移至 新的選擇性培養基上繼續培養，以排除偽陽性的情況，如圖十四。
三 、農桿菌媒介重複轉形法 1. 二次轉形株篩選
進行雙質體轉形策略之重複轉形後，使用同時含有3 μg/ml carboxin、3 μg/ml hygromycin B 以及 200 μM cefotaxime 之選擇性培養以篩選出二次轉形株。結果顯 示p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株與 p0390-AH-Aiegfp 轉形株無法於該培養基上生長，
如圖十五(A)與圖十五(B)。二次轉形株則是能夠生長於雙重抗生素的選擇性培養基，
如圖十五(C)。藉由表現兩種抗生素抗性，可證實重複轉形之可行性。
四 、轉形株分析 1. 轉形株 DNA 分析
1.1 一次轉形株聚合酶連鎖反應檢測
將p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株與 p0390-AH-Aiegfp 轉形株之染色體 DNA 抽出後，
分別以引子對egfp-F/egfp-R 以及 ApGPD-F/hph-R 進行聚合酶連鎖反應，以確認外 源基因是否送入轉形株。p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株的檢測，如圖十六(A)所示，染 色體DNA 可以擴增出預期的 0.7 kb 片段，p0390-AH-Aiegfp 轉形株的檢測，如圖 十六(B)所示，染色體 DNA 可以擴增出預期的 1.3 kb 片段。以上結果皆顯示外源 基因順利送入轉形株。
1.2 二次轉形株聚合酶連鎖反應檢測
藉由雙質體轉形策略重複轉形所得到的二次轉形株，抽出染色體DNA 後，以
引子對ApGPD-F/hph-R 進行聚合酶連鎖反應，以確認 p0390-AH-Aiegfp 之 T-DNA 確實送入二次轉形株之中。結果如圖十七所示，染色體DNA 可以擴增出預期的 1.3 kb 片段，證實第二次轉形成功把外源基因送入宿主。
2. 轉形株蛋白質分析
2.1 螢光顯微鏡觀察
利用螢光顯微鏡觀觀察野生型美白菇菌絲與轉形株菌絲是否可以散發出綠色 螢光。如圖十八所示，在藍光激發下，轉形株可以發出綠色螢光，但是各轉形株 的綠色螢光強度普遍不強，因此難以藉由螢光顯微鏡來區別一次轉形株與二次轉 形株，僅可確認綠色螢光蛋白質之生成。
2.2 酵素免疫分析法
轉形株經過粗萃取法取得總可溶性蛋白質後，以ELISA 分析其綠色螢光蛋白
質含量，結果如圖十九與表九，一次轉形株母體測得綠色螢光蛋白質為每克總可 溶蛋白質含有75.47 ng，而雙質體轉形策略之二次轉形株最高可測得每克總可溶蛋 白質含有418.83 ng，是一次轉形株母體的 5.5 倍，而單質體轉形策略之二次轉形 株最高可測得每克總可溶蛋白質含有319.58 ng 的綠色螢光蛋白質，是一次轉形株 母體的4.25 倍，顯示兩種重複轉形策略皆可提升綠色螢光蛋白質的表現量。
2.3 西方墨點法
將轉形株蛋白質粗萃液進行西方墨點法分析，確認轉形株綠色螢光蛋白質大 小之正確性。結果如圖二十，蛋白質粗萃液中可測得約27 kDa 的綠色螢光蛋白質。
2.4 即時定量聚合酶鏈鎖反應
利用即時定量聚合酶鏈鎖反應相對定量測定轉形株之egfp 拷貝數，進而確認
二次轉形株之外源基因拷貝數是否有所提升。圖二十一(A)，雙質體轉形策略之二 次轉形株egfp 拷貝數較一次轉形株母體提升了 1.5 至 2 倍，而在單質體轉形策略 之二次轉形株，egfp 拷貝數平均而言較一次轉形株母體提升了 1.5 倍左右，如圖二 十一(B)與表九。