第一章 前言
2. 轉形策略
基因轉形方法可分為兩類：非載體媒介轉形法(vector-free gene transfer)或是載 體媒介轉形法(vector-mediated gene transfer)。常用於菇類轉形研究的非載體媒介轉 形法包括電穿孔法(electroporation)、Polyethylene glycol (PEG)媒介轉形法與限制酶 媒介插入法(restriction enzyme-mediated integration, REMI)法；常用於菇類轉形研究 的載體媒介轉形法則是農桿菌媒介轉形法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)。
PEG 是極具親水力的分子，高濃度 PEG 可聚集原生質體(protoplast)並使之融 合，亦可促使細胞產生胞飲作用攝入DNA。大多數 PEG 媒介轉形法需要以原生質 體為材料，但菇類的原生質體製備過程繁複且不易再生，使得轉形率偏低，同時
也有外源基因穩定性不高的缺點，使得PEG 媒介轉形法在菇類轉形發展受到限 制。
2.3 限制酶媒介插入法
限制酶媒介插入法的操作與PEG 媒介轉形法類似，但多了限制酶酵素處理，
限制酶酵素可進入原生質體的細胞核，對表達宿主染色體進行截切，宿主在修復
染色體的過程便有機會與表現載體進行黏合。與PEG 媒介轉形法相比，限制酶媒
介插入法可提升轉形率10 倍之多，同時也具有較佳的外源基因穩定性[62]。
2.4 農桿菌媒介轉形法
腫瘤農桿菌(A. tumefaciens)是一種存在於土壤中的革蘭氏陰性菌(Gram
negative)，可藉由傷口感染植物，促使植物形成冠狀腫瘤(crown gall tumor)。腫瘤 農桿菌可將自身基因嵌入受感染宿主染色體，利用腫瘤農桿菌將欲表現之基因送 入表達宿主，稱作農桿菌媒介轉形法。早期農桿菌媒介轉形法僅應用於植物，但 近年來發現酵母菌、絲狀真菌甚至哺乳類細胞都可以藉由農桿菌媒介轉形法進行 基因表達[63, 64, 65]。目前已有許多農桿菌媒介轉形法成功應用於菇類轉形之例子，
相較於其他的轉形方法，農桿菌媒介轉形法之優點為不需製備原生質體，操作簡 單、轉形率以及外源基因穩定性高，顯示農桿菌媒介轉形法於菇類轉形系統研究 深具發展潛力。圖二為真菌於農桿菌媒介轉形之操作模式。
然而以農桿菌媒介轉形法應用於菇類異源基因表現時面臨之問題是異源蛋白 質表現量不高，以金針菇為表達宿主的異源表達研究顯示綠色螢光蛋白質含量佔 全部可溶性蛋白質(total soluble protein, TSP)的比例低於 0.01% [66]。可能是因為農 桿菌的T-DNA 大多是以單一拷貝數(copy number)隨機插入，低基因拷貝數使得蛋
白質表現量偏低。目前菇類轉形研究顯示T-DNA 插入拷貝數介於一至四個之間，
但以單一拷貝數居多[67]，如何提升異源蛋白質表現量是目前菇類轉形系統重要的 課題。
六 、農桿菌轉形機制 1. Ti 質體簡介
腫瘤農桿菌其致病過程主要由腫瘤引發質體(Tumor-inducing plasmid, Ti
plasmid)所調控。腫瘤引發質體為一環狀雙股 DNA 分子，可概分為：Transferred DNA (T-DNA)區域以及毒性蛋白質基因群(vir genes)。T-DNA 區域由兩段約 25 bp 的序 列Right border (RB)與 Left border (LB)所夾帶，該序列會於農桿菌感染宿主時送入
宿主染色體，原生型的腫瘤引發質體其T-DNA 區域內具有可誘使植物宿主產生激
素的基因，進而造成異常分裂增生的腫瘤[68, 69]。
2. 毒性蛋白質活化
圖三為農桿菌感染植物細胞之過程。植物受傷部位釋出的胺基酸、有機酸與 醣類吸引農桿菌附著，同時植物受傷部位釋出的酚類化合物活化農桿菌VirA/VirG。
VirA/VirG 為二元調節系統(two-component signal-transduction system)，當 VirA 與酚 類化合物結合會促使VirA 發生自體磷酸化(autophosphorylation)，並進一步促使 VirG 發生磷酸化，磷酸化的 VirG 將作為轉錄活化子(transcriptional activator)調控其 他毒性蛋白質基因之表現。毒性蛋白質表現後，具有內切酶(endonuclease)活性的 VirD1 及 VirD2 辨認 RB 與 LB 序列並切下 T-DNA，被切下的 T-DNA 則與 VirD2 形成未成熟T-DNA 複合體(immature T-complex)，以避免被分解[70]。
3. T-DNA 傳送
農桿菌VirB/D4 複合體於自身與受感染細胞之間形成第四型分泌系統(Type IV secretion system, T4SS)以傳送 T-DNA，形成之第四型分泌系統可將未成熟 T-DNA 複合體與 VirE2 以及 VirF 等毒性蛋白質一併送入宿主細胞，在宿主細胞中 未成熟T-DNA 複合體與 VirE2 結合成為成熟 T-DNA 複合體[68, 71]。
4. T-DNA 嵌入
T-DNA 複合體上的 VirD2 與 VirE2 都有核酸定位訊號(nuclear localization signal, NLS)序列，當 T-DNA 複合體進入宿主細胞後，VirD2 與 VirE2 可分別藉由 轉運蛋白質(importin-α family)以及 VirE2 交互作用蛋白質 1 及 2 (VirE2 interacting
protein 1, VIP1 and 2, VIP2)的幫助，促使 T-DNA 進入細胞核[72]。農桿菌 T-DNA 進入細胞核後，將以隨機的方式嵌入宿主染色體，嵌入的詳細機制至今尚無定論，
推測是於染色體雙股螺旋斷裂(Double-strand break)之處嵌入。在釀酒酵母的農桿菌 媒介轉形研究，發現T-DNA 可藉由同源重組(homologous recombination, HR)或是 非同源末端接合(nonhomologous end joining, NHEJ)嵌入，並且發現嵌入的模式與宿 主的因子有密切相關。若將參與同源重組的因子剔除，酵母菌會使用非同源末端 接合嵌入T-DNA，反之亦然[63]，而在植物的系統 T-DNA 主要是以非同源性末端 接合進行嵌入。目前推測T-DNA 複合體會利用宿主本身的蛋白質幫助 T-DNA 嵌 入，T-DNA 複合體中的 VirD2 與 VirE2 功用可能是吸引相關蛋白質至雙股螺旋斷 裂處參與反應[73]。
七 、研究動機與目的
菇類轉形系統的開發與食用菇類分子農場的發展息息相關，本實驗室先前已 建立菇類電穿孔轉形系統，然而電穿孔法基因穩定性低，不利於菇類異源表達系 統的應用。為改善基因穩定性的問題，本實驗室轉而發展菇類農桿菌媒介轉形法，
並於金針菇、美白菇以及鮑魚菇成功地進行異源表達，但也面臨異源蛋白質表現 量不高的問題。本研究將利用美白菇之農桿菌媒介轉形系統進行重複轉形，藉由 多次轉形以增加送入宿主的外源基因拷貝數，進而提高異源蛋白質表現量。為達 成此目的所需完成的目標包括：
1. 建構美白菇異源表現載體
建構具有美白菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子、萎銹靈抗藥性基因以及報 導基因egfp 的表現載體。
2. 進行農桿菌媒介重複轉形法 2.1 將表現載體轉入農桿菌株。
2.2 以美白菇菌絲塊作為轉形材料進行農桿菌媒介轉形。
2.3 篩選轉形株。
2.4 對轉形株再次進行農桿菌媒介轉形。
3. 轉形株分析
3.1 利用聚合酶連鎖反應(PCR)確認外源基因插入與否。
3.2 利用西方墨點法(western blotting)和酵素免疫分析法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)進行蛋白質定性與定量分析。
3.3 以即時定量聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)測定外源基因拷貝數。
3.4 以螢光顯微鏡觀察表現EGFP 之轉形株。
本論文的研究架構如圖四所示。
第二章 材料與方法
一 、實驗材料 1. 實驗菌株
1.1 真菌
本研究所使用之菌種為美白菇(Hypsizygus marumoreus)，於台北頂好市場購入 後分離出菌絲進行培養。美白菇菌種保存於Potato dextrose agar (PDA)斜面培養基，
培養溫度為14oC。一般培養在固態 MYGPA 平板培養基(1% malt extract, 1% yeast extract, 0.5% glucose, 0.3% peptone, 1.5% agar)或 MYGP 液態培養基，培養溫度為 23oC。
1.2 細菌
大腸桿菌Escherichia coli DH5α 作為基因轉殖及序列保存之宿主細胞，一般培 養於固態平板培養基Luria-Bertani (LB)或於液態培養基 LB broth 在 37oC 下以 250 rpm 振盪培養。長期保存則使用含 15%甘油之 LB broth，於 -80oC 下保存。
農桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 和 GV-3101，作為農桿菌轉形媒介，
一般培養於固態平板培養基LB 或於液態培養基 LB broth 在 28oC，250 rpm 振盪培 養。長期保存則使用含25%甘油之 LB broth，於 -80oC 下保存。
2. 質體
本研究使用的質體是以pCAMBIA0390 為骨架進行建構或農桿菌媒介轉形法。
p0390-AH-Aiegfp、pHi-hyg-egfpS、p0390-sdi1-ORFM、為本實驗室前人[57, 66]所 建構，p0390-Cbx-Hiegfp 於本研究完成。質體詳細內容如下：
2.1 pCAMBIA-0390
pCAMBIA-0390 質體大小為 6.8 kb，主要應用於農桿菌媒介轉形系統。是一種 雙偶型載體(binary vector)，帶有 NOS 3’UTR poly A 終結子、left border (LB)、right
border (RB)序列、pUC9 載體多限制酶切位及卡那黴素抗藥性基因(kanamycin resistance gene)。
2.2 pHi-hyg-egfpS
pHi-hyg-egfpS 質體大小為 7.1 kb，此質體以 yT&A 質體作為骨架進行構築， 帶 egfp 與潮黴素抗性基因(hygromycin phosphotransferase, hph)，兩者皆以美白菇 gpd 啟動子啟動。
2.3 p0390-AH-Aiegfp
p0390-AH-Aiegfp 質體大小為 9.4 kb，此質體以 pCAMBIA-0390 做為骨架進 行建構，egfp 基因為報導基因以及 hph 為篩選標記，兩者皆以洋菇 gpd 啟動子啟 動。
2.4 p0390-sdi1-ORFM
p0390-sdi1-ORFM 質體大小為 8.8 kb，此質體以 pCAMBIA-0390 做為骨架進 行建構，萎銹靈抗性基因(carboxin resistance gene , cbxr)為篩選標記，此基因以美白 菇sdi1 啟動子啟動。
2.5 p0390-Cbx-Hiegfp
p0390-Cbx-Hiegfp 質體大小為 11.1 kb，此質體以 pCAMBIA-0390 做為骨架進 行建構，egfp 基因為報導基因與 cbxr為篩選標記，egfp 基因以美白菇 gpd 啟動子 啟動，萎銹靈抗性基因以美白菇sdi1 啟動子啟動。
上述質體之圖譜如圖五所示。
3. 引子
本研究所使用的引子為委託生技公司合成(基龍米克斯，台灣)。詳細序列整理於表 三。
二 、實驗方法 1. 表現載體之建構
1.1 質體抽取
將攜帶質體p0390-sdi1-ORFM 的大腸桿菌菌株於含有 50 μg/ml kanamycin 之 3 mL LB 中 37oC 隔夜培養後，使用 Miniprep plasmid extraction kit (Genemark，台灣) 抽取質體。
1.2 聚合酶鏈鎖反應
將稀釋至適當濃度之質體pHi-hyg-egfpS 作為模版，並且使用引子組 (AseI-HiGPD-F / XmaI-Nos-R)擴增出目標片段(AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI)，PCR 之反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、0.1 μM dNTP、1.5 μL 10x Pfu buffer、0.075 μL Pfu DNA polymerase (5 U/μL)、7.225 μL ddH2O，總體積為 15 μL。
反應條件見表四。反應完之產物使用洋菜膠體進行電泳確認產物大小。
1.3 洋菜膠體電泳
將DNA 與 6x 追蹤染劑混合後，以 1%洋菜膠體進行電泳，於 0.5x TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0)以電壓 140 伏特進行電泳 20 分鐘。經 ethidium bromide 外染 10 ~ 15 分鐘後，在 UV box 上照相、觀察結果。
1.4 限制酶截切
將質體p0390-sdi1-ORFM 與 PCR 產物 AseI-HiGPD-egfp-NOS- XmaI 分別使用 限制酶AseI 與 XmaI 於 37oC 反應兩個小時。反應後溶液使用 DNA clean up kit (Genemark，台灣)進行純化。
1.5 質體黏合與轉形
確認純化後DNA 濃度與大小，以莫耳數比 vector：insert = 3：1 的條件，加 入1 μL T4 接合酶、10x 緩衝液 A、10 x 緩衝液 B (益生，台灣)以及無菌水使最終 體積為10 μL，於 4oC 反應隔夜。反應後溶液使用 heat-shock 轉形法將 DNA 送入
大腸桿菌DH5α 勝任細胞中，於含 50 μg/ml kanamycin 之 LB 固態平板培養基上培 養16 ~ 18 小時。各質體建構流程如圖六所示。
1.6 大腸桿菌轉形株篩選
以牙籤挑取上一步驟之大腸桿菌菌落，加入專一性引子與試劑進行菌落聚合 酶連鎖反應(Colony PCR)，PCR 反應條件見表四。反應完成後以洋菜膠體電泳分析，
以牙籤挑取上一步驟之大腸桿菌菌落，加入專一性引子與試劑進行菌落聚合 酶連鎖反應(Colony PCR)，PCR 反應條件見表四。反應完成後以洋菜膠體電泳分析，