轉形株分析

3.2 單質體轉形策略

單質體轉形策略係利用帶有表現載體p0390-Cbx-Hiegfp 之農桿菌再次對 p0390-Cbx-Hiegfp 轉形株再次進行農桿菌媒介轉形法，便可取得單一抗藥性之二次 加入500 μL CTAB buffer，並以組織研磨棒研磨，研磨後加入 3 μL 2-mercaptoethanol，

混合均勻後於65^oC 放置 30 分鐘。接著加入 500 μL CI (chloroform : isoamylalcohol =

最後加入100 μL ddH2O 將其回溶。CTAB buffer 與 wash buffer 如表六配置。

4.2 聚合酶連鎖反應

將轉形株和野生株的染色體 DNA 稀釋至適當倍數，取 5 μL 當做模版，PCR 之反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、0.1 μM dNTP、1.5 μL 10x Taq buffer、0.075 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL)、7.225 μL ddH2O，總體積為 15 μL。

所用引子以及反應條件見表四。反應產物使用洋菜膠體進行電泳確認產物大小。

4.3 螢光顯微鏡觀察

利用螢光顯微鏡Eclipse E600 (Nikon, Kanagawa, Japan)觀察菌絲，以藍光(395 nm)激發下散發出綠色螢光(509 nm)之菌絲即為成功表現綠色螢光蛋白質之轉形株。

螢光視野下的相機曝光時間皆為4 秒。

4.4 蛋白質粗萃取

收取液態培養的菌絲體，將之冷凍乾燥後使用液態氮研磨成粉末，每50 mg

菌粉加入1 mL 蛋白質萃取液(300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100, pH 7.4)，使用超音波機(Sonics & Materials Inc., USA)進行均質化，

於冰上放置一小時後，以4^oC，13,000 g 的條件離心 30 分鐘，收取上清液，接著 再使用相同條件離心一次並收取上清液，於 -80^oC 保存。

4.5 蛋白質定量

使用bicinchoninic acid (BCA)法進行可溶性總蛋白質定量。使用 bovine serum albumin (Sigma, Germany)配置 0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/ml 共八種濃度之標準品，將10 μL 標準品或待測蛋白質萃取液加至 96 孔微量滴定盤，

再加入 200 μL BCA working reagent (Pierce, Rockford, IL, Reagent A:B, 50:1, v/v)於 37^oC 避光呈色 30 分鐘後偵測 562 nm 之吸光值。將標準品測得之吸光值製作蛋白 質含量校正曲線，以換算粗萃液的可溶性總蛋白質含量。

4.6 酵素免疫分析法

酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)依目的分為多種

類型，本研究使用間接型酵素免疫分析法(Indirect sandwich ELISA)定量轉形株之綠 色螢光蛋白質。先以coating buffer 將 mouse anti-GFP 單株抗體(ab1218, Abcam, UK)稀釋 6,000 倍，加 100 μL 於 ELISA 專用 96 孔微量滴定盤中，於 23^oC 靜置 16 小時後以200 μL PBST buffer 清洗三次後，加入 300 μL gelatin-NET 於 37^oC 下靜置 2 小時後去除多餘液體備用。以 EGFP (BioVision, USA)當作標準品，以 gelatin-NET 稀釋成6、5、4、3、2、1、0.5 以及 0 ng/ml 共八種濃度標準品，將 100 μL 標準品 溶液和轉形株粗萃取液加至96 孔微量離心盤，於 37^oC 靜置 1 小時，再以 PBST 清洗四次後，加入100 μL 以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 rabbit anti-GFP 多株抗體 (ab6556, Abcam, UK)於 37^oC 靜置 1 小時，以 PBST 清洗五次後，加入 100 μL 以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 goat anti-rabbit IgG HRP conjugate (PerkinElmer, USA) 於37^oC 靜置 1 小時，以 PBST 清洗六次後，加入 100 μL 3,3’,5’5-tetramethylbenzidine 基質溶液(TMB One Component HRP Microwell Substrate, BioFX, USA)避光呈色 30 分鐘後，以2 N H2SO4終止反應，偵測450 nm 之吸光值。將標準品測得之吸光值

Polyvinylidendifluroid (PVDF) membrane 浸泡於 100%甲醇中 10 分鐘，再以半乾式 電泳轉印槽(Genmedika Biotechnology，台灣)，依序放置以轉印緩衝液浸濕之濾紙 兩片、電泳膠片、PVDF 膜、轉印緩衝液浸濕之濾紙兩片，使用 60 mA，30 分鐘 之條件將蛋白質轉印至PVDF 膜上。取出轉印後 PVDF 膜以 gelatin-NET 室溫振盪 浸洗1.5 小時，倒去 gelatin-NET 後加入以 gelatin-NET 稀釋 6,000 倍之 mouse anti-GFP 一次抗體(Living colors A.v. Monoclonal [JL-8], USA)室溫振盪浸洗 1 小時，

再以PBST buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。加入以 gelatin-NET 稀釋 5,000 倍之 goat anti-mouse IgG AP conjugate 二次抗體(PerkinElmer, USA)室溫振盪浸洗 1 小時，再

以PBST buffer 清洗四次，每次 10 分鐘。最後使用 NBT/BCIP 基質液避光呈色，

直至紫色條帶出現後以清水漂洗終止反應。上述所用之試劑配方如表八。

4.8 即時定量聚合酶鏈鎖反應

利用即時定量聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)測定一次轉形株母體與二次轉形 株之外源基因拷貝數，目標基因為egfp，所用之引子對為 egfp362-F 與 egfp468-R，

參考基因為GAPDH，所用之引子對為 HmGPD-F 與 HmGPD-R。取 5 μl 轉形株 DNA 為模版，其餘反應物組成為0.2 μM 正向引子、0.2 μM 反向引子、4.2μl ddH2O 與 10 μl GM SYBR qPCR Mix (Genemark，台灣)，總體積為 20 μl，反應條件為 94^oC，

3 min 後接著進行 35 次循環的 94^oC，15 sec 與 60^oC，31 sec。計算方法使用比較性 Ct 法(Comparative Ct method)，ΔCt 代表 egfp 之 Ct 值減去 GAPDH 之 Ct 值，ΔΔCt 代表二次轉形株的ΔCt 減去一次轉形株的 ΔCt，最後以 2^-ΔΔCt表示差距倍數。