藥理潛力

菇類多醣體被認為具有抗腫瘤的能力，研究發現鴻喜菇具有抗癌之潛力。鴻 喜菇多醣體中的β-(1-3)-glucan 在小鼠實驗證實具有抑制 Sarcoma 180 腫瘤生長的 功效[35]，此外小鼠先餵食含有鴻喜菇粉末的飼料，再注射 20-methylcholanthrene 進行癌症誘導，發現鴻喜菇具有預防腫瘤的功效[36]。

鴻喜菇含有名為Hypsin 的蛋白質，Hypsin 為一種 ribosome-inactivating protein，

具有抑制小鼠及人類白血病細胞(leukemia cell)的能力，該蛋白質即使於 100^oC 沸 水加熱10 分鐘仍能維持 60%的抑癌效果[37]。癌細胞對內皮細胞的黏附作用與癌 症轉移有密切相關，鴻喜菇中名為HM-23 的 type IV collagen-binding protein 在細 胞實驗可抑制肺癌細胞(Lewis lung carcinoma cell)之黏附作用[38]。鴻喜菇中名為 Marmorin 的 ribosome inactivating proteins (RIPs)也已知可抑制肝癌細胞株 HepG2 和乳癌株MCF-7 的增生[39]。

鴻喜菇萃取物分離出的類固醇化合物有抗結核菌感染功效，並且能夠抑制 Epstein-Barr virus (EBV)早期病毒抗原活化[40]。鴻喜菇甲醇萃取物，hypsiziprenol A9則可避免肝癌細胞HepG2 中 retinoblastoma protein (pRb)的磷酸化，使細胞停留 在G1 階段因而無法繼續生長[41]。

五 、食用菇類異源表達系統

金針菇、香菇、鮑魚菇、灰蓋鬼傘與乳牛肝菌(Suillus bovinus)等等[46, 47, 48]，因 此若要構築可跨物種使用的表現載體，洋菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子是一個好 的選擇。

1.2 報導基因

報導基因(reporter gene)意指容易偵測或定量的蛋白質，藉由報導基因可輕易 地偵測啟動子強弱或宿主進行異源表現的能力。目前研究常用的有綠色螢光蛋白 質基因(green fluorescent protein gene, gfp)、β-葡萄糖苷酶基因 (β-glucuronidase gene, gusA)、冷光酶基因(luciferase gene, luc)等，其中的綠色螢光蛋白質為科學研究帶來 很大的進步。綠色螢光蛋白質吸收波長為395 與 475 nm，最大散發波長是 508 nm，

利用特定波長之光激發即可產生綠色螢光，不需外加基質[49]，綠色螢光蛋白質的 用途廣泛，可以用於轉形株篩選，測試基因表現強弱，與目標蛋白質融合後進行

定位或是利用螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)觀察 蛋白質間的交互作用。若將綠色螢光蛋白質基因序列修改，可以得到亮度更高的 增強型綠色螢光蛋白質(enhanced green fluorescent protein gene, egfp)，提升偵測的 靈敏度[50]。 (hygromycin B phosphotransferase，hph)會對潮黴素進行磷酸化修飾導致其失去功用，

使轉形株得以在含有潮黴素之環境生長。除了潮黴素，萎銹靈(carboxin)抗性基因 也可作為菇類異源表達研究的篩選標記。萎銹靈是一種除真菌劑，對擔子菌有很 好的抑制效果，其機制為阻止電子傳遞鏈中琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase) 和輔酶Q (ubiquinone)之間的電子傳遞，使得電子傳遞鏈無法進行。若是對琥珀酸 去氫酶中的鐵硫蛋白質次單元(iron-sulfur protein subunit complex II)特定序列進行 單一胺基酸突變，便可抵抗萎銹靈之作用[53]。目前已有許多菇類研究使用萎銹靈 抗性基因作為篩選標記，例如：香菇、灰蓋鬼傘、鮑魚菇與美白菇等[54, 55, 56, 57]。

使用萎銹靈抗藥性基因作為篩選標記的好處是此抗性基因屬於同源性基因，可避 免在發展菇類食用疫苗時造成人體過敏現象。

1.4 分生策略

適當的分生策略可有效提升異源表達的表現量，包括於目標基因前加上內含 子(intron)或是於目標基因後端加上內質網停留訊息胜肽(endoplasmic reticulum retention signal peptides)。研究發現於目標基因前端添加內含子可以增加 mRNA 的 累積，於洋菇、灰蓋鬼傘、裂褶菌及白腐型真菌(Phanerochaete chysosporium)的研 究中皆可發現內含子之有無確實影響了報導基因的表現[58, 59, 60]。

在目標基因後端加上內質網停留訊號可使目標蛋白質轉譯後停留在內質網 (endoplasmic reticulum, ER)或高基氏體(Golgi body)中，使目標蛋白質完整地摺疊與 進行修飾，進而提升目標蛋白質於細胞中的累積量[61]。

2. 轉形策略

基因轉形方法可分為兩類：非載體媒介轉形法(vector-free gene transfer)或是載 體媒介轉形法(vector-mediated gene transfer)。常用於菇類轉形研究的非載體媒介轉 形法包括電穿孔法(electroporation)、Polyethylene glycol (PEG)媒介轉形法與限制酶 媒介插入法(restriction enzyme-mediated integration, REMI)法；常用於菇類轉形研究 的載體媒介轉形法則是農桿菌媒介轉形法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)。

PEG 是極具親水力的分子，高濃度 PEG 可聚集原生質體(protoplast)並使之融 合，亦可促使細胞產生胞飲作用攝入DNA。大多數 PEG 媒介轉形法需要以原生質 體為材料，但菇類的原生質體製備過程繁複且不易再生，使得轉形率偏低，同時

也有外源基因穩定性不高的缺點，使得PEG 媒介轉形法在菇類轉形發展受到限 制。

2.3 限制酶媒介插入法

限制酶媒介插入法的操作與PEG 媒介轉形法類似，但多了限制酶酵素處理，

限制酶酵素可進入原生質體的細胞核，對表達宿主染色體進行截切，宿主在修復

染色體的過程便有機會與表現載體進行黏合。與PEG 媒介轉形法相比，限制酶媒

介插入法可提升轉形率10 倍之多，同時也具有較佳的外源基因穩定性[62]。

2.4 農桿菌媒介轉形法

腫瘤農桿菌(A. tumefaciens)是一種存在於土壤中的革蘭氏陰性菌(Gram

negative)，可藉由傷口感染植物，促使植物形成冠狀腫瘤(crown gall tumor)。腫瘤 農桿菌可將自身基因嵌入受感染宿主染色體，利用腫瘤農桿菌將欲表現之基因送 入表達宿主，稱作農桿菌媒介轉形法。早期農桿菌媒介轉形法僅應用於植物，但 近年來發現酵母菌、絲狀真菌甚至哺乳類細胞都可以藉由農桿菌媒介轉形法進行 基因表達[63, 64, 65]。目前已有許多農桿菌媒介轉形法成功應用於菇類轉形之例子，

相較於其他的轉形方法，農桿菌媒介轉形法之優點為不需製備原生質體，操作簡 單、轉形率以及外源基因穩定性高，顯示農桿菌媒介轉形法於菇類轉形系統研究 深具發展潛力。圖二為真菌於農桿菌媒介轉形之操作模式。

然而以農桿菌媒介轉形法應用於菇類異源基因表現時面臨之問題是異源蛋白 質表現量不高，以金針菇為表達宿主的異源表達研究顯示綠色螢光蛋白質含量佔 全部可溶性蛋白質(total soluble protein, TSP)的比例低於 0.01% [66]。可能是因為農 桿菌的T-DNA 大多是以單一拷貝數(copy number)隨機插入，低基因拷貝數使得蛋

白質表現量偏低。目前菇類轉形研究顯示T-DNA 插入拷貝數介於一至四個之間，

但以單一拷貝數居多[67]，如何提升異源蛋白質表現量是目前菇類轉形系統重要的 課題。

六 、農桿菌轉形機制 1. Ti 質體簡介

腫瘤農桿菌其致病過程主要由腫瘤引發質體(Tumor-inducing plasmid, Ti

plasmid)所調控。腫瘤引發質體為一環狀雙股 DNA 分子，可概分為：Transferred DNA (T-DNA)區域以及毒性蛋白質基因群(vir genes)。T-DNA 區域由兩段約 25 bp 的序 列Right border (RB)與 Left border (LB)所夾帶，該序列會於農桿菌感染宿主時送入

宿主染色體，原生型的腫瘤引發質體其T-DNA 區域內具有可誘使植物宿主產生激

素的基因，進而造成異常分裂增生的腫瘤[68, 69]。

2. 毒性蛋白質活化

圖三為農桿菌感染植物細胞之過程。植物受傷部位釋出的胺基酸、有機酸與 醣類吸引農桿菌附著，同時植物受傷部位釋出的酚類化合物活化農桿菌VirA/VirG。

VirA/VirG 為二元調節系統(two-component signal-transduction system)，當 VirA 與酚 類化合物結合會促使VirA 發生自體磷酸化(autophosphorylation)，並進一步促使 VirG 發生磷酸化，磷酸化的 VirG 將作為轉錄活化子(transcriptional activator)調控其 他毒性蛋白質基因之表現。毒性蛋白質表現後，具有內切酶(endonuclease)活性的 VirD1 及 VirD2 辨認 RB 與 LB 序列並切下 T-DNA，被切下的 T-DNA 則與 VirD2 形成未成熟T-DNA 複合體(immature T-complex)，以避免被分解[70]。

3. T-DNA 傳送

農桿菌VirB/D4 複合體於自身與受感染細胞之間形成第四型分泌系統(Type IV secretion system, T4SS)以傳送 T-DNA，形成之第四型分泌系統可將未成熟 T-DNA 複合體與 VirE2 以及 VirF 等毒性蛋白質一併送入宿主細胞，在宿主細胞中 未成熟T-DNA 複合體與 VirE2 結合成為成熟 T-DNA 複合體[68, 71]。

4. T-DNA 嵌入

T-DNA 複合體上的 VirD2 與 VirE2 都有核酸定位訊號(nuclear localization signal, NLS)序列，當 T-DNA 複合體進入宿主細胞後，VirD2 與 VirE2 可分別藉由 轉運蛋白質(importin-α family)以及 VirE2 交互作用蛋白質 1 及 2 (VirE2 interacting

protein 1, VIP1 and 2, VIP2)的幫助，促使 T-DNA 進入細胞核[72]。農桿菌 T-DNA 進入細胞核後，將以隨機的方式嵌入宿主染色體，嵌入的詳細機制至今尚無定論，

推測是於染色體雙股螺旋斷裂(Double-strand break)之處嵌入。在釀酒酵母的農桿菌 媒介轉形研究，發現T-DNA 可藉由同源重組(homologous recombination, HR)或是 非同源末端接合(nonhomologous end joining, NHEJ)嵌入，並且發現嵌入的模式與宿 主的因子有密切相關。若將參與同源重組的因子剔除，酵母菌會使用非同源末端 接合嵌入T-DNA，反之亦然[63]，而在植物的系統 T-DNA 主要是以非同源性末端 接合進行嵌入。目前推測T-DNA 複合體會利用宿主本身的蛋白質幫助 T-DNA 嵌 入，T-DNA 複合體中的 VirD2 與 VirE2 功用可能是吸引相關蛋白質至雙股螺旋斷 裂處參與反應[73]。

七 、研究動機與目的

菇類轉形系統的開發與食用菇類分子農場的發展息息相關，本實驗室先前已 建立菇類電穿孔轉形系統，然而電穿孔法基因穩定性低，不利於菇類異源表達系 統的應用。為改善基因穩定性的問題，本實驗室轉而發展菇類農桿菌媒介轉形法，

並於金針菇、美白菇以及鮑魚菇成功地進行異源表達，但也面臨異源蛋白質表現 量不高的問題。本研究將利用美白菇之農桿菌媒介轉形系統進行重複轉形，藉由 多次轉形以增加送入宿主的外源基因拷貝數，進而提高異源蛋白質表現量。為達 成此目的所需完成的目標包括：

1. 建構美白菇異源表現載體

建構具有美白菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子、萎銹靈抗藥性基因以及報 導基因egfp 的表現載體。

2. 進行農桿菌媒介重複轉形法 2.1 將表現載體轉入農桿菌株。

2.2 以美白菇菌絲塊作為轉形材料進行農桿菌媒介轉形。

2.3 篩選轉形株。

2.4 對轉形株再次進行農桿菌媒介轉形。

3. 轉形株分析

3.1 利用聚合酶連鎖反應(PCR)確認外源基因插入與否。

3.2 利用西方墨點法(western blotting)和酵素免疫分析法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)進行蛋白質定性與定量分析。

3.2 利用西方墨點法(western blotting)和酵素免疫分析法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)進行蛋白質定性與定量分析。