T-DNA 傳送

農桿菌VirB/D4 複合體於自身與受感染細胞之間形成第四型分泌系統(Type IV secretion system, T4SS)以傳送 T-DNA，形成之第四型分泌系統可將未成熟 T-DNA 複合體與 VirE2 以及 VirF 等毒性蛋白質一併送入宿主細胞，在宿主細胞中 未成熟T-DNA 複合體與 VirE2 結合成為成熟 T-DNA 複合體[68, 71]。

4. T-DNA 嵌入

T-DNA 複合體上的 VirD2 與 VirE2 都有核酸定位訊號(nuclear localization signal, NLS)序列，當 T-DNA 複合體進入宿主細胞後，VirD2 與 VirE2 可分別藉由 轉運蛋白質(importin-α family)以及 VirE2 交互作用蛋白質 1 及 2 (VirE2 interacting

protein 1, VIP1 and 2, VIP2)的幫助，促使 T-DNA 進入細胞核[72]。農桿菌 T-DNA 進入細胞核後，將以隨機的方式嵌入宿主染色體，嵌入的詳細機制至今尚無定論，

推測是於染色體雙股螺旋斷裂(Double-strand break)之處嵌入。在釀酒酵母的農桿菌 媒介轉形研究，發現T-DNA 可藉由同源重組(homologous recombination, HR)或是 非同源末端接合(nonhomologous end joining, NHEJ)嵌入，並且發現嵌入的模式與宿 主的因子有密切相關。若將參與同源重組的因子剔除，酵母菌會使用非同源末端 接合嵌入T-DNA，反之亦然[63]，而在植物的系統 T-DNA 主要是以非同源性末端 接合進行嵌入。目前推測T-DNA 複合體會利用宿主本身的蛋白質幫助 T-DNA 嵌 入，T-DNA 複合體中的 VirD2 與 VirE2 功用可能是吸引相關蛋白質至雙股螺旋斷 裂處參與反應[73]。

七 、研究動機與目的

菇類轉形系統的開發與食用菇類分子農場的發展息息相關，本實驗室先前已 建立菇類電穿孔轉形系統，然而電穿孔法基因穩定性低，不利於菇類異源表達系 統的應用。為改善基因穩定性的問題，本實驗室轉而發展菇類農桿菌媒介轉形法，

並於金針菇、美白菇以及鮑魚菇成功地進行異源表達，但也面臨異源蛋白質表現 量不高的問題。本研究將利用美白菇之農桿菌媒介轉形系統進行重複轉形，藉由 多次轉形以增加送入宿主的外源基因拷貝數，進而提高異源蛋白質表現量。為達 成此目的所需完成的目標包括：

1. 建構美白菇異源表現載體

建構具有美白菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子、萎銹靈抗藥性基因以及報 導基因egfp 的表現載體。

2. 進行農桿菌媒介重複轉形法 2.1 將表現載體轉入農桿菌株。

2.2 以美白菇菌絲塊作為轉形材料進行農桿菌媒介轉形。

2.3 篩選轉形株。

2.4 對轉形株再次進行農桿菌媒介轉形。

3. 轉形株分析

3.1 利用聚合酶連鎖反應(PCR)確認外源基因插入與否。

3.2 利用西方墨點法(western blotting)和酵素免疫分析法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)進行蛋白質定性與定量分析。

3.3 以即時定量聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)測定外源基因拷貝數。

3.4 以螢光顯微鏡觀察表現EGFP 之轉形株。

本論文的研究架構如圖四所示。