發展現況與面臨問題

植物表達系統目前已經能夠成功生產各式蛋白質，如醫藥用蛋白質或是工業 用酵素等，亦有多種醫藥用蛋白質正在進行臨床試驗，表二為分子農場生產之醫 藥用蛋白質發展現況。

分子農場雖然倍受期待，但也面臨許多的問題，目前主要的疑慮是對生態的 危害以及食用後的安全性。美國安萬特(Aventis)公司在 1997 年將旗下的基因改造 玉米申請註冊，命名為星聯玉米(StarLink^TM)，該玉米本來是做為動物飼料，不得

用於人類食品。然而2000 年時在玉米製食品之中檢測出星聯玉米的存在，使得安

萬特公司撤銷星聯玉米的註冊，也與美國與17 個州達成賠償協議[21]。除了星聯

玉米之外，近年仍有基改作物汙染的例子，例如2006 年美國生產的長粒米檢測出

基因改造稻米LLRICE 601 之存在並重創了美國稻米產業[22]，以上這些例子都顯 示了目前基改作物的管理仍有很大的改善空間。基因汙染也是大眾所擔心的問題，

基因改造作物的花粉或是種子可藉由風力或昆蟲等媒介散播至環境中，並可能會 對生態系統造成影響。以上這些因素都限制了分子農場的發展，制訂適當的基改 作物管理辦法也將是發展分子農場的重點之一。

三 、食用菇類分子農場 1. 菇類簡介

菇類或稱蕈類，原先泛指傘菌類或牛肝菌類的子實體，現今菇類係指絲狀真 菌在有性世代時形成之子實體，其大小為肉眼可見，具有菌傘(cap)、菌摺(gills)與 菌柄(stem)等構造。分類上大部分的菇類是屬於擔子菌門(Basidiomycota)， 例如：

洋菇(Agaricus bisporus)、香菇(Lentinula edodes)等，少部分菇類是屬於子囊菌門 (Ascomycota)，例如：羊肚菌(Morchella esculenta)等。擔子菌在有性時期會經由減 質(immunomodulatory proteins)，可提升免疫力對抗腫瘤、抗發炎、降血糖血脂[23, 24, 25, 26, 27]。 (Schizophyllum commune)及灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus) tryptophan 營養需求菌株之

轉形研究[28, 29]，上述兩種皆是擔子菌研究常用的模式物種。而食用菇類的轉形 系統則於1996 年，由洋菇表現 hygromycin B 抗性基因[30]，以及使用鮑魚菇 (Pleurotus ostreatus)表現 β-glucuronidase (GUS)與 bialaphos 抗性基因[31]，後續也 有許多菇類轉形的研究。現階段研究多著重在各種菇類表現報導基因或是不同轉 形策略的研究，但食用菇類想要實際應用在分子農場還有許多努力的空間。若食 用菇類異源表達系統發展成熟，相信對生技醫藥、食品與工業都會有莫大的幫助。

四 、美白菇 1. 起源

美白菇(Hypsizygus marumoreus)是由日商 Hokuto Sangyo Corporation 所研發之 食用菇類，係利用紫外光照射造成鴻喜菇(Hypsizygus marmoreus)變異後再進行交 科(Tricholomataceae)、玉蕈屬(Hypsizygus)。鴻喜菇之學名為 H. marmoreus，目前 確認與Hypsizygus tessulatus 是同物異名[33]，此外鴻喜菇有許多中文別名，如真姬 菇、玉蕈、蟹味菇、海鮮菇、榆菇等。

2. 栽培優勢

美白菇的栽培條件與鴻喜菇相同，皆可於工廠環控進行大規模瓶栽，從接種 到採收大約需兩個月到三個月。日商Hokuto Sangyo Corporation 之菇類栽培廠估計 每間工廠年產量約為3000 公噸，該公司於台灣設立之栽培工廠年產量也可達 1100

4. 藥理潛力

菇類多醣體被認為具有抗腫瘤的能力，研究發現鴻喜菇具有抗癌之潛力。鴻 喜菇多醣體中的β-(1-3)-glucan 在小鼠實驗證實具有抑制 Sarcoma 180 腫瘤生長的 功效[35]，此外小鼠先餵食含有鴻喜菇粉末的飼料，再注射 20-methylcholanthrene 進行癌症誘導，發現鴻喜菇具有預防腫瘤的功效[36]。

鴻喜菇含有名為Hypsin 的蛋白質，Hypsin 為一種 ribosome-inactivating protein，

具有抑制小鼠及人類白血病細胞(leukemia cell)的能力，該蛋白質即使於 100^oC 沸 水加熱10 分鐘仍能維持 60%的抑癌效果[37]。癌細胞對內皮細胞的黏附作用與癌 症轉移有密切相關，鴻喜菇中名為HM-23 的 type IV collagen-binding protein 在細 胞實驗可抑制肺癌細胞(Lewis lung carcinoma cell)之黏附作用[38]。鴻喜菇中名為 Marmorin 的 ribosome inactivating proteins (RIPs)也已知可抑制肝癌細胞株 HepG2 和乳癌株MCF-7 的增生[39]。

鴻喜菇萃取物分離出的類固醇化合物有抗結核菌感染功效，並且能夠抑制 Epstein-Barr virus (EBV)早期病毒抗原活化[40]。鴻喜菇甲醇萃取物，hypsiziprenol A9則可避免肝癌細胞HepG2 中 retinoblastoma protein (pRb)的磷酸化，使細胞停留 在G1 階段因而無法繼續生長[41]。

五 、食用菇類異源表達系統

金針菇、香菇、鮑魚菇、灰蓋鬼傘與乳牛肝菌(Suillus bovinus)等等[46, 47, 48]，因 此若要構築可跨物種使用的表現載體，洋菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子是一個好 的選擇。

1.2 報導基因

報導基因(reporter gene)意指容易偵測或定量的蛋白質，藉由報導基因可輕易 地偵測啟動子強弱或宿主進行異源表現的能力。目前研究常用的有綠色螢光蛋白 質基因(green fluorescent protein gene, gfp)、β-葡萄糖苷酶基因 (β-glucuronidase gene, gusA)、冷光酶基因(luciferase gene, luc)等，其中的綠色螢光蛋白質為科學研究帶來 很大的進步。綠色螢光蛋白質吸收波長為395 與 475 nm，最大散發波長是 508 nm，

利用特定波長之光激發即可產生綠色螢光，不需外加基質[49]，綠色螢光蛋白質的 用途廣泛，可以用於轉形株篩選，測試基因表現強弱，與目標蛋白質融合後進行

定位或是利用螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)觀察 蛋白質間的交互作用。若將綠色螢光蛋白質基因序列修改，可以得到亮度更高的 增強型綠色螢光蛋白質(enhanced green fluorescent protein gene, egfp)，提升偵測的 靈敏度[50]。 (hygromycin B phosphotransferase，hph)會對潮黴素進行磷酸化修飾導致其失去功用，

使轉形株得以在含有潮黴素之環境生長。除了潮黴素，萎銹靈(carboxin)抗性基因 也可作為菇類異源表達研究的篩選標記。萎銹靈是一種除真菌劑，對擔子菌有很 好的抑制效果，其機制為阻止電子傳遞鏈中琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase) 和輔酶Q (ubiquinone)之間的電子傳遞，使得電子傳遞鏈無法進行。若是對琥珀酸 去氫酶中的鐵硫蛋白質次單元(iron-sulfur protein subunit complex II)特定序列進行 單一胺基酸突變，便可抵抗萎銹靈之作用[53]。目前已有許多菇類研究使用萎銹靈 抗性基因作為篩選標記，例如：香菇、灰蓋鬼傘、鮑魚菇與美白菇等[54, 55, 56, 57]。

使用萎銹靈抗藥性基因作為篩選標記的好處是此抗性基因屬於同源性基因，可避 免在發展菇類食用疫苗時造成人體過敏現象。

1.4 分生策略

適當的分生策略可有效提升異源表達的表現量，包括於目標基因前加上內含 子(intron)或是於目標基因後端加上內質網停留訊息胜肽(endoplasmic reticulum retention signal peptides)。研究發現於目標基因前端添加內含子可以增加 mRNA 的 累積，於洋菇、灰蓋鬼傘、裂褶菌及白腐型真菌(Phanerochaete chysosporium)的研 究中皆可發現內含子之有無確實影響了報導基因的表現[58, 59, 60]。

在目標基因後端加上內質網停留訊號可使目標蛋白質轉譯後停留在內質網 (endoplasmic reticulum, ER)或高基氏體(Golgi body)中，使目標蛋白質完整地摺疊與 進行修飾，進而提升目標蛋白質於細胞中的累積量[61]。

2. 轉形策略

基因轉形方法可分為兩類：非載體媒介轉形法(vector-free gene transfer)或是載 體媒介轉形法(vector-mediated gene transfer)。常用於菇類轉形研究的非載體媒介轉 形法包括電穿孔法(electroporation)、Polyethylene glycol (PEG)媒介轉形法與限制酶 媒介插入法(restriction enzyme-mediated integration, REMI)法；常用於菇類轉形研究 的載體媒介轉形法則是農桿菌媒介轉形法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)。

PEG 是極具親水力的分子，高濃度 PEG 可聚集原生質體(protoplast)並使之融 合，亦可促使細胞產生胞飲作用攝入DNA。大多數 PEG 媒介轉形法需要以原生質 體為材料，但菇類的原生質體製備過程繁複且不易再生，使得轉形率偏低，同時

也有外源基因穩定性不高的缺點，使得PEG 媒介轉形法在菇類轉形發展受到限 制。

2.3 限制酶媒介插入法

限制酶媒介插入法的操作與PEG 媒介轉形法類似，但多了限制酶酵素處理，

限制酶酵素可進入原生質體的細胞核，對表達宿主染色體進行截切，宿主在修復

染色體的過程便有機會與表現載體進行黏合。與PEG 媒介轉形法相比，限制酶媒

介插入法可提升轉形率10 倍之多，同時也具有較佳的外源基因穩定性[62]。

2.4 農桿菌媒介轉形法

腫瘤農桿菌(A. tumefaciens)是一種存在於土壤中的革蘭氏陰性菌(Gram

negative)，可藉由傷口感染植物，促使植物形成冠狀腫瘤(crown gall tumor)。腫瘤 農桿菌可將自身基因嵌入受感染宿主染色體，利用腫瘤農桿菌將欲表現之基因送 入表達宿主，稱作農桿菌媒介轉形法。早期農桿菌媒介轉形法僅應用於植物，但 近年來發現酵母菌、絲狀真菌甚至哺乳類細胞都可以藉由農桿菌媒介轉形法進行 基因表達[63, 64, 65]。目前已有許多農桿菌媒介轉形法成功應用於菇類轉形之例子，

相較於其他的轉形方法，農桿菌媒介轉形法之優點為不需製備原生質體，操作簡 單、轉形率以及外源基因穩定性高，顯示農桿菌媒介轉形法於菇類轉形系統研究 深具發展潛力。圖二為真菌於農桿菌媒介轉形之操作模式。

然而以農桿菌媒介轉形法應用於菇類異源基因表現時面臨之問題是異源蛋白 質表現量不高，以金針菇為表達宿主的異源表達研究顯示綠色螢光蛋白質含量佔 全部可溶性蛋白質(total soluble protein, TSP)的比例低於 0.01% [66]。可能是因為農 桿菌的T-DNA 大多是以單一拷貝數(copy number)隨機插入，低基因拷貝數使得蛋

白質表現量偏低。目前菇類轉形研究顯示T-DNA 插入拷貝數介於一至四個之間，

但以單一拷貝數居多[67]，如何提升異源蛋白質表現量是目前菇類轉形系統重要的 課題。

六 、農桿菌轉形機制 1. Ti 質體簡介

腫瘤農桿菌其致病過程主要由腫瘤引發質體(Tumor-inducing plasmid, Ti

plasmid)所調控。腫瘤引發質體為一環狀雙股 DNA 分子，可概分為：Transferred DNA (T-DNA)區域以及毒性蛋白質基因群(vir genes)。T-DNA 區域由兩段約 25 bp 的序 列Right border (RB)與 Left border (LB)所夾帶，該序列會於農桿菌感染宿主時送入

宿主染色體，原生型的腫瘤引發質體其T-DNA 區域內具有可誘使植物宿主產生激

素的基因，進而造成異常分裂增生的腫瘤[68, 69]。

2. 毒性蛋白質活化

圖三為農桿菌感染植物細胞之過程。植物受傷部位釋出的胺基酸、有機酸與 醣類吸引農桿菌附著，同時植物受傷部位釋出的酚類化合物活化農桿菌VirA/VirG。

VirA/VirG 為二元調節系統(two-component signal-transduction system)，當 VirA 與酚 類化合物結合會促使VirA 發生自體磷酸化(autophosphorylation)，並進一步促使

VirA/VirG 為二元調節系統(two-component signal-transduction system)，當 VirA 與酚 類化合物結合會促使VirA 發生自體磷酸化(autophosphorylation)，並進一步促使