鑑於 pYES2 PSYY259H 與 pRS314 PSYY259H 的定點突變株之產物分析 的差異，我們發現以酵母菌表現不同物種基因有其缺陷，因此未來可能利 用具有高表現量特性之載體攜帶這些非酵母菌基因，改善其表現量不足之 缺點，再進一步對不同物種酵素活性區內胺基酸作功能性分析。
另一方面，還有一個我們一直以來努力不懈的方向，尌是致力將氧化鯊 烯環化酵素進行大量的表現與純化，期望能得到 X-ray 晶體結構或進行酵 素動力學實驗，將使我們對於氧化鯊烯環化酵素有更進一步的了解。
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pBacPAK8-MTeGFP ERG7 質體建構
首先用限制酶 KpnΙ 和 NotΙ 將酵母菌（S. cerevisiae）的氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素基因 ERG7 從載體 pCR®2.1-TOPO 上剪切下，置換到 另一載體 pBacPAK8-MTeGFP（載體 pBacPAK8 經修飾，外加金屬硫蛋白 基因 metallothionein 和綠螢光基因 eGFP） 中，再分別以三組酵素：KpnΙ
＋NotΙ、BamH I，以及 StuΙ進行鑑定，經酵素鑑定片段大小皆正確無誤 的質體，再送定序，實驗流程如《附錄圖 1-1》所示。經定序結果發現， Ser147 突變為 Pro，而其他位置氨基酸皆確認無誤。
《附錄圖 1-1》pBacPAK8-MTeGFP ERG7 質體建構流程圖
桿狀病毒表現系統表現酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素
將昆蟲細胞（Spodoptera frugiperda, Sf9 cells）解凍後，以培養液洗去其 內的抗凍劑（DMSO），再培養於含有 10% 胎牛血清（FBS）的培養液
（Grace’s insect medium）中約二至三天。待細胞長到足夠數量，將其分裝 在 24 孔盤中，每孔的細胞量約 2×105，靜置 2 小時等待細胞貼附。以桿狀
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病毒轉染（transfection）之前，須先備製詴劑 A 與詴劑 B，詴劑 A 為 1 μl 微 脂體（lipofectin）混合 24 μl 不含血清的培養液，詴劑 B 為 1 μl 重組載體
（pBacPAK8-MTeGFP ERG7 或 pBacPAK8-MTeGFP hCN1）與 1 μl 桿狀病 毒（linearized baculoviral DNA）混合在 23 μl 不含血清的培養液中。詴劑 A 與詴劑 B 先各別靜置 15 分鐘，將兩詴劑混合在一起後，於室溫下再靜 置 30 分鐘。之後，將詴劑 A 加 B 與 150 μl 不含血清的培養液混合，再加 入孔盤中轉染 Sf9 細胞，並在 27℃ 培養箱中培養約四天。四天後的細胞 培養液含有大量帶有鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之桿狀病毒，以 96 孔盤將 此培養液稀釋成 10-1~10-5 不同濃度，取 100 μl 不同濃度之桿狀病毒液感 染每孔 Sf9 細胞量約 4×104 的 96 孔盤，於 27℃ 培養箱中再培養約四天 後，利用螢光顯微鏡挑選單一桿狀病毒表現（即單一螢光表現）。此單一帶 有鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之桿狀病毒，再以 Sf9 細胞放大，實驗流程如
《附錄圖 1-2》所示。
《附錄圖 1-2》桿狀病毒感染昆蟲細胞之流程圖
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除了 Sf9 細胞株外，另一株能高度表現蛋白的昆蟲細胞株 BTI-TN- 5B-4（High 5）也用於本次的表現實驗中，其培養液（High 5 medium）和 Sf9 細胞株的培養液不同，且須額外添加 10% L-Glutamine。 High 5 表現蛋白 質的實驗步驟與 Sf9 細胞株相同，將先前感染 Sf9 細胞株取得的桿狀病毒 感染 High 5 細胞株，放大桿狀病毒之表現即可。
蛋白質表現結果
依照圖《附錄圖 1-3》所示之流程，將表現的細胞株分成含有桿狀病毒 之細胞培養液和細胞震盪離心後的上清液（supernatant）和細胞殘骸（cell pellet）三部分，進行電泳分析。但是在 SDS-PAGE 上，表現酵母菌氧化 鯊烯環化酵素的 Sf9 細胞株與對照組相互比較之下，在 66 kDa ~ 97 kDa 間，沒有看到特表現量別突出的蛋白質，而在對照組中，確實有人類肌肽 酶（hCN1）表現《附錄圖 1-4》，大小約為 55 kDa；而蛋白質在 High FiveTM 的表現結果和 Sf9 細胞株結果相同《附錄圖 1-5》。
《附錄圖 1-3》電泳分析之樣品備製
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《附錄圖 1-4》酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素在 Sf9 細胞株的表現結果 1：表現 YOSC 細胞之細胞萃取上清液； 2：表現 hCN1 細胞之細胞萃取上清液；
3：表現 YOSC 細胞之細胞殘骸； 4：表現 hCN1 細胞之細胞殘骸；
5：表現 YOSC 細胞之培養液； 6：表現 hCN1 細胞之培養液。
《附錄圖 1-5》酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素在 High 5 細胞株的表現結果 1：表現 YOSC 細胞之細胞萃取上清液； 2：表現 hCN1 細胞之細胞萃取上清液；
3：表現 YOSC 細胞之細胞殘骸； 4：表現 hCN1 細胞之細胞殘骸；
5：表現 YOSC 細胞之培養液； 6：表現 hCN1 細胞之培養液。
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乙烯二胺四乙酸（Ethylenediamine-tetraacetic acid ,EDTA）
乙醚（Ether）
丙三醇（Glycerol）
80
LB 培養基（LB Broth, Miller）
胰化蛋白（Tryptone）
酵母菌專用培養基（DifcoTM YPD Broth）
酵母菌專用培養基（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid）
以上皆購自於啟新生技（CMP）
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DNA 10Kb Ladder 引子（Primers）
以上皆購自於 Bio Basic Inc., Canada
G418
Sf9 細胞株專用培養粉末（Grace’s insect medium）
High 5 細胞株專用培養液（EXPRESS FIVE® Serum Free Medium）
左旋麩醯胺酸（L-Glutamine）
以上皆購自於 Gibco
二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide, DMSO）購自於 MP Biomedicals
脱氧核糖核苷酸組（dNTP Set, 100mM Solutions）購自於 GE Healthcare 限制酶（Restriction enzyme）購自於 New England BioLabs Inc.
SYBR® Green I 購自於 Roche
微脂體（lipofectin）購自於 Invitrogen
2. 實驗套組
BigDye® Teminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 購自於 Applied Biosystems GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit 購自於 GE Healthcare Plasmid Miniprep Purification Kit 購自於 GeneMark
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 購自於 Stratagene
3. 菌株、細胞株、載體與病毒
載體 pRS313：購自於 New England BioLabs。載體 pRS313 是一種可穿梭於酵母菌 S.
cerevisiae 和大腸桿菌 E. coli 間的載體，帶有選擇性標記 His3。
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thionein）和綠螢光基因（eGFP），修飾完成之載體名為 pBacPAK8-MTeGFP。XL1-Blue：
LEU2 ade2-101 his3-Δ200 leu2-Δ1 lys2-801 trp1-Δ63 ura3-52hem1Δ::Kan
R），83
可供菌珠選殖篩選用。
Spodoptera frugiperda（Sf9）
：為昆蟲細胞株，購自於 American Type Culture Collection。
BTI-TN-5B-4（High 5）
：為昆蟲細胞株，購自於 American Type Culture Collection。
Lineaied baculoviral DNA 購自於 BD。
4. 培養液與緩衝液
G418 stock solution (1g/mL)
500 mg G418 溶解於 500 μl 經高壓滅菌之二次水，避光保存於 4℃。
Ampicillin stock solution (100mg/mL)
將 Ampicillin 溶於二次去離子水，再用 0.2 μm 濾膜過濾，去除雜菌，儲 存於 -20 ℃。
10X SYBR Green solution
以 DMSO 稀釋 10,000X SYBR Green stock solution 至 10X，避光保存於 -20℃。
6X DNA loading dye
0.25% Bromophenol blue 與 30% Glycerol 溶解於一次水中，保存於 -20℃。
50X TAE buffer
2 M Tris acetate，0.1 M EDTA，pH 8.5，儲存於室溫，以一次水稀釋 50 倍 使用。
5X sequencing buffer
取 4.85 g 的 Tris base 與 0.203 g 的 MgCl2 溶於 100 ml 的一次水中並調 至 pH 9.0，保存於 4℃。
LB medium
25 g LB Broth 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
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1M sorbitol solution
364.4 g D-sorbitol 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
50% Glucose solution
500g Glucose 溶解於一公升的一次水中，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
50X Amimo acid solution
因應不同載體所需添加之氨基酸溶液，如 ：50X ALTHMU、50X ALTHM、
50 X ALTMU、 ALHMU 等，依不同百分比將所需之氨基酸溶解於一次水，
經高壓滅菌後儲存於 4℃。0.2% Adenine，0.3% Lysine，0.2% Tryptophan，
0.2% Histidine，0.2% Methonine，0.2% Uracil。
Hemin chloride solution
在無菌環境下將 0.5 g Hemin chloride 溶解於 250 ml 0.2N 的氫氧化鈉溶 液中，再加入 250 ml 95% 酒精後避光保存於室溫。
Ergosterol solution
在無菌環境下將 1 g Ergosterol 溶解於 250 ml 95% 的酒精中，再加入 250 ml Tween 80，避光保存於室溫。
Glucose/Amino acid/ Hemin Chloride /Ergosterol plate
將 0.67 g yeast nitrogen base 與 2 g BactoTM Agar 溶解於 100 ml 的一次水 中，經高壓滅菌後加入 4 ml 50% Glucose solution、2 ml 50X amino acid
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solution、2 ml Hemin Chloride solution 與 2 ml Ergosterol supplement solution，
於無菌環境下混合均勻後倒入培養皿中待其凝固，避光保存於 4℃。
80% Glycerol solution
80 ml Glycerol 溶解於 20 ml 的一次水，經高壓滅菌後儲存於 4℃。
20% EA developing solution
將 Ethyl acetate 與 Hexane 以 1 : 4 互相混合。
TLC staining solution
緩慢的將 95% Erhanol、Sulfonic Acid 與 p-Anisaldehyde 以 18 : 1 : 1 比例 混合。
Sf9 細胞株專用培養液（Grace’s insect medium）
一包 Grace’s insect medium 粉末容於 900 ml 二次水，外加 0.35 g 的碳酸 氫 鈉 ， 再 將 pH 值 調 至 6.2 。 在 無 菌 環 境 下 加 入 10% FBS 和 1%
Penicillin-Streptomxcin 後，再以 0.22 μm 過濾杯去除雜質，保存於 4℃。
High 5 細胞株專用培養液（EXPRESS FIVE® Serum Free Medium）
在無菌環境下加入 10% L-Glutamine 和 1% Penicillin-Streptomxcin ，保存 於 4℃。
5. 實驗儀器
水浴槽 ( Baxter, DurabathTM Water Bath )
電源供應器 ( GE healthcare, Electrophoresis Power Supply EPS 301 ) 掃描器 ( EPSON, EPSON® GT-7000 Scanner )
微量旋轉式真空濃縮機 ( EYELA, Rotary vaccum evaporator N-N series ) 數位照相系統 ( Kodak, DC120 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 )
震盪培養箱( Firstek Scientific, Orbital shaking incubator Model-S302R ) PCR ( Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700 )
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紫外光/可見光光譜儀 ( Beckmann, DU 7500 Spectrophotometer ) 高速離心機 ( Beckmann, Allegra 21 Series )
電泳槽 ( GE Healthcare, Hoefer® HE 33 Mini Horizontal Submarine Unit ) DNA 定序儀 ( PerkinElmer, ABI Prism 377 DNA Sequencer )
脈衝控制器 ( BioBad , Pulse Controller )