第五章 利用飽和定點突變對酵母菌 ERG7 C457X 進行功能性分析
5.2 實驗結果與討論
5.2.4 酵母菌 ERG7 C457X 產物生成途徑推測
《圖 5-5》為酵母菌 ERG7C457X 定點飽和突變的產物生成途徑推測圖。
在 ERG7W457G 中，突變產物以單環產物 Achilleol A 為主；除此之外，在 突變株 ERG7W457F 中，也會得到少量的單環和雙環產物。這些產物的生成 是因為 A 環環化形成 C-6 碳陽離子後，隨即藉由脫氫終止環化反應，因而 得到單環的 Achilleol A 或 Camelliol C；若單環 C-6 碳陽離子能繼續環化 形成 B 環，產生雙環的 C-8 碳陽離子再行脫氫反應，則會生成雙環的 (9R,10S)-polypoda-8(26),13E,17E,21-tetraen-3 β-ol。反觀其餘仍具有酵素活 性的突變株，產物皆以羊毛硬脂醇為主，但在某些的突變點（ERG7C457T、
ERG7C457A、ERG7C457V、ERG7C457L）中，會伴隨著微量野生型 ERG7 所沒
有 的 三 環 或 四 環 產 物 生 成 。 三 環 產 物 isomalabarica-14(26),17E, 21-trien-3β-ol 的生成是當環化反應進行到欲行 C 環擴環反應前，其依反馬 可尼可夫法則，形成 6-6-5 三環 C-14 碳陽離子中間物時，有一部分受質 會在此脫氫並終止反應而形成。至於四環產物 parkeol 和羊毛硬脂醇唯一 的不同是最後在 lanosteryl C-8/C-9 cation 脫氫的位置。
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5.2.5 酵母菌 ERG7
C457X突變株電腦模擬分析
我們利用 3.9 章節所描述的方法，利用相似度較高的人類氧化鯊烯環化 酵素結晶結構作為模版，模擬酵母菌中 ERG7 活性區域氨基酸的相對空間 位置，以進行酵母菌 ERG7 的結構分析。《圖 5-6》顯示當以羊毛硬脂醇 為受質時，Cys457 的位置與其他幾個開環反應相關的氨基酸之相對位置。
其中 Asp456 已由實驗證實為酵母菌 ERG7 進行開環時提供質子的氨基 酸；而 Cys540 與 Cys457 則是被認為會與 Asp456 形成氫鍵以增加其酸 性；Glu460 則是具有重新質子化 Asp456 的功能42。由產物分析結果發現，
當酵母菌 Cys457 位置以不同屬性的殘基進行取代時，會改變其產物的分 布。
《圖 5-6》野生型酵母菌 ERG7C457 與附近氨基酸結構模擬圖
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5.2.5.1 帶電荷氨基酸和芳香族氨基酸對開環的影響
在先前鯊烯-蛇麻烯環化酵素三定點突變研究中，曾經指出 Asp337（對 應到酵母菌 ERG7 為 Cys457）可能與辨認受質的角色有關 50。而在酵母 菌飽和突變實驗中，經麥角固醇補充篩選分析可以發現，三個帶正電的鹼 性氨基酸 His、Lys 與 Arg 都會造成酵母菌 ERG7 的失活，而導致菌株 的死亡，經由外加麥角固醇培養之後進行產物分析的結果也發現，鹼性氨 基酸取代的酵素不具有能環化氧化鯊烯之環化酵素的功能。除此之外，在 三個帶有芳香族氨基酸的取代中，除了 Phe 會產生微量的單環和雙環產物 之外，Tyr 和 Trp 也都造成酵母菌 ERG7 失活。
以 Arg 和 Trp 為例，分子模擬結果顯示當 Cys457 位置突變為帶有 芳香族或鹼性殘基的氨基酸時，其氨基酸側鏈會伸向活性區內，而 Cys457 位置尌在提供質子開環的 Asp456 旁，巨大的突變殘基會形成嚴重的立體 障礙，並占據部分受質與酵素結合位置，使受質與酵素無法和酵素作適當 的結合，因而阻礙受質與 Asp 456 的反應，使得開環反應無法進行，最終 導致酵素失去活性。而在 Phe 的取代突變株中，可能是因殘基較 Tyr 和 Trp 小且不帶電荷，所以產生微量的單環或雙環產物，但也無法繼續進行 環化反應以形成三環或四環的產物。
《圖 5-7》A. 酵母菌 ERG7C457W 結構模擬圖；B. 酵母菌 ERG7C457R 結構模擬圖
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在酸性基團取代中，Asp 的殘基只比 Glu 少了一個碳原子的長度，但 兩者的酵素活性卻截然不同。我們利用分子模擬的方式，比較野生型與
ERG7C457E 或 ERG7C457D 兩個突變株的差異，從立體空間上來看，Glu 的殘
基和野生型的一樣都指向活性區內，而 Asp 的殘基卻指向九十度角後方，
如《圖 5-8》所示。另一方面，突變也影響 Glu460 殘基，其與突變氨基酸 Glu457 和 Asp457 的間距分別為 7.1Å 和 7.8Å ；而突變氨基酸 Asp457 與 Asp456 其間距增長為 7.1Å ，但野生型的 Cys457 和 突變株的 Glu457 與其 Asp456 的距離皆只有 6.3Å 。在人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 結晶結構中認為 Glu460 具有重新質子化 Asp456 的功能，因此我們推測 所突變的酸性基團會和 Asp456 競爭 Glu460，但在 ERG7C457D 突變株中，
其 Asp457 卻因位向問題無法補足 Asp456 所失去的功能，而使酵素失去 活性。
《圖 5-8》A. 野生型酵母菌 ERG7C457 結構模擬圖；
B. 酵母菌 ERG7C457E 結構模擬圖；C. 酵母菌 ERG7C457D 結構模擬圖
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5.2.5.2 ERG7
C457 在環化過程所扮演的的角色ERG7C457X 突變株基本上仍都具有酵素活性，只要突變殘基不帶電荷或 巨大的立體障礙。在這些具酵素活性的突變點中，只有 ERG7C457G 的主產 物不是羊毛硬脂醇，而是單環的 Achilleol A，其和羊毛硬脂醇產物比例約 為 3:1。從分子模擬上來看《圖 5-9》，雖然 ERG7C457G 不會造成鄰近氨基 酸有明顯的位移或是角度轉變，但卻在酵素活性區空出了原本 -SH（thiol group）殘基所佔有的空間，這可能讓受質或氨基酸的可變動角度增加，變 得較不穩定，而容易在單環脫氫中止反應形成 Achilleol A。 Xiong 等人在 阿拉伯芥中也發現一種氧化鯊烯環化酵素，可得到雙環和多種單環產物，
其基因組（At5g42600）的開環序列正是 DGTAE51。因此我們推測，Cys457 不只利用 -SH 基團固定 Asp456 的位向，並且能利用其本身的空間障礙，
進而減小受質可變動的空間，也尌能增加受質在酵素活性區域的穩定性，
而更有利於 Asp456 開環和後續的環化步驟。
《圖 5-9》酵母菌突變株 ERG7C457G（藍色）與野生型 ERG7（灰色）之空間結構比較