第四章 利用丙氨酸掃描法對豌豆和阿拉伯芥的 氧化鯊烯環化酵素假設活
4.2 丙氨酸掃描之結果與討論
4.2.4 PsaPSY 突變株電腦模擬分析與結果討論
由於目前 PsaPSY 和 AthCAS 都尚未有結晶結構被解析出來，所以我 們在進行的結構分析時，是利用相似度較高的人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素結晶結構作為模版，來模擬酵素活性區域內其氨基酸的相對空間位 置。我們依照第 3.9 章節所敘述的方法建構突變蛋白質分子結構，《圖 4-5 A》
為 β-香桂素合成酵素的蛋白質分子模擬結果，並顯示其以 β-香桂素為受質 時十四個假設活性氨基酸的相對位置。在 PsaPSY 十四個假設活性區的單 定點突變中，除了 PSYY259A 與 PSYG369A 會使酵素失活以外，其它突變的 結果仍都保有野生型的酵素環化功能，並能生成 β-香桂素。從分子模擬圖
《圖 4-5》來看，我們發現當 Tyr259 和 Gly369 突變點成 Ala 後，會影 響其週遭氨基酸環境，使其位移或是產生角度上的轉變，尤其是帶有芳香 族性質基團的變動最大，這可能是導致環化反應中的碳陽離子不穩定，而 無法生成β-香桂素的原因。
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《圖 4-5》A. 野生型 PsaPSY 活性區結構模擬圖；
B. 突變株 PsaPSYG369A（黃色）與野生型（綠色）之空間比較；
C. 突變株 PsaPSYY259A（橘色）與野生型（綠色）之空間比較
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由於在野生型 pRS314 PSY 及其各突變點中發現，其產物生成量比起 pRS314 ERG7 所生成羊毛硬脂醇產物的濃度低許多，從質譜儀上來看，野 生型 pRS314 ERG7 產生的羊毛硬脂醇產物吸收質可達 107，但野生型 pRS314 PSY 所生成的 β-香桂素吸收值卻只有 106左右《圖 4-6》。 除此之 外，在其他十二個保有野生型酵素活性的突變株其產物分布中，只發現 β-香桂素的生成，卻沒有發現其他在不同碳原子脫氫中止反應或是提早結束 的環化產物。而在 2000 年 Kushiro 等人在研究 β-香桂素合成酵素和羽扇 醇合成酵素的關係時發現，經由分析 PNYY261H（對應豌豆為 PSYY259）的 定點突變產物，可得到不同於野生型的三種四環產物，推測 Tyr261 可能 對於達瑪烯碳陽離子（dammarenyl cation）之後的碳陽離子中間產物有穩定 的作用 49。而在我們自己的實驗室裡，也曾利用能大量表現基因的載體 pYES2 進行 PSYY259H 的定點突變實驗，在突變的產物分析中，我們也確 實看到一些非β-香桂素的四環產物。綜合上述因素，我們懷疑 pRS314 PSY 在酵母菌中因表現量不佳，導致新產物因太過微量而無法看到，此外因為 Ala 突變而導致沒有新產物生成的因素亦不能加以排除。
《圖 4-6》野生型 pRS314 ERG7 與 pRS314 PSY 經管柱層析後的 GC-MS 圖
因此，依照《圖 4-7》描述的方法，我們利用限制酶 BamHΙ+XhoΙ 進行 剪 切 ， 並 將 原 本 在 pYES2 PSYY259H 上 的 PSYY259H 片 段 與 pRS314
PSYY259A 上的 PSYY259A 片段進行置換，因而得到 pRS314 PSYY259H 突變株。
在麥角固醇補充篩選部分，pRS314 PSYY259H 和其他突變點一樣，無法補足
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失去的 ERG7 功能，之後依照 4.2.3 章節敘述的方法進行突變株的產物分 析。在 pRS314 PSYY259H 產物分析中，和 pYES2 PSYY259H一樣的是失去原 本的酵素活性，無法生成 β-香桂素，但卻沒有看到其他四環產物的生成。
所以我們認為，β-香桂素環化酵素活性區的單定點突變沒有看到未知產物的 原因，可能是因為 PSY 是植物基因非酵母菌基因，導致在酵母菌內表現量 不佳所造成。
《圖 4-7》利用限制酶切接取得 pRS314 PSYY259H 之方法