骨架重排與脫氫反應

酵素活性區內的許多具有高度π電子性質的芳香族氨基酸，可以透過碳 陽離子與其π電子的共振作用來穩定甲基與氫化基的轉移重排，以利最後的 脫氫終止反應。整個骨架重排過程結束之後，在人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇 環化酵素中具有高度保留性的氨基酸 His232（其對應到酵母菌 ERG7 為 His234），由於其鹼性殘基十分靠近 C-8/C-9 碳陽離子，所以被認為是最 能夠接受質子，並進而終止整個環化機制的關鍵氨基酸位置。另外，His232 除了會透過鄰近的水分子的交互作用去影響催化反應的進行外，還會與其 附近的 Tyr503 之側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯，使得 His232 得以 位於脫氫反應的最佳位置《圖1-16》²⁴。

此外，在酵母菌 ERG7 中對於 His234 與 Tyr510 的飽和定點突變的 實驗結果也更進一步的證明了這兩個氨基酸在活性區域內所具有的功能。

在酵母菌 ERG7 中針對 His234 定點突變的產物分析上發現了許多在不同 地 方 進 行 脫 氫 反 應 的 四 環 產 物 如 protosta-20,24-dien-3β-ol 、 protosta-12,24-diene-3β-ol 還有 parkeol ^35,36。另外，在 Tyr510 突變成 Ala 的突變點中也發現了 parkeol^37,38。綜合以上結果，更加證明了 His234 在酵 母菌 ERG7 活性區域中的功能，除了利用碳陽離子與π電子的共振作用穩 定甲基與氫化基的骨架重排以外，也會幫助酵素在正確的位置上進行脫氫 反應^35,36。

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《圖 1-16》氧化鯊烯環化酵素及其產物 -羊毛硬脂醇形成複合物的結構圖。圖中 所顯示的胺基酸基團為距離產物在 5Å 內的位置，水分子只有在 Asp456 及 His232 附近被觀察到²⁴

環阿屯醇環化酵素和氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素環化機制的差別，

只是在進行到最後一步的去質子化步驟時，氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素會 催化 C-19 上的氫行脫除反應而生成環阿屯醇，而氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素則催化 C-8 上的氫脫除而生成羊毛硬脂醇。從熱力學的觀點來看，

環阿屯醇比羊毛硬脂醇不穩定，所以學者認為環阿屯醇環化酵素之所以可 以將產物環化成為能量較不趨向的環阿屯醇，可能是因為酵素裡某些特定 胺基酸的影響而導致環阿屯醇的生成。先前對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素

（AthCAS1）的突變實驗中也發現， Tyr410、His477 與 Ile481 在各物種 的環阿屯醇環化酵素中皆具有高度保留的特性，但是在 ERG7 中則分別以 Thr、Cys、Gln 及 Val 的形式存在《圖 1-17》³⁹。將這些胺基酸進行定點 突變實驗的結果證實，產生羊毛硬脂醇效率最好的突變株為雙定點突變株

AthCAS1

H477N/I481V《表 1-1》⁴⁰。Suzuki 等人在 2006 年時發表了植物羊毛 硬脂醇的合成酵素，他們從阿拉伯芥中發現基因 At3g45130 可以在植物中

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合成羊毛硬脂醇，最後命名為 LAS（lanosterol synthesis）⁴¹。有趣的是從序 列比對中可以發現， LAS 在相對應的 CAS 氨基酸 His477 與 I481 位置 分別被換成 Asn 與 Val，這與上述 CAS 的雙定點突變實驗結果不謀而合，

也顯示了這兩個氨基酸對於羊毛硬脂醇合成的重要性。

《圖 1-17》Tyr410（◆）、 His477（＊）與 Ile481（▼）在 CAS1 高度保留，而在 ERG7 中則被 Thr、Cys、Gln 或是 Val 所取代³⁹

《表1-1》阿拉伯芥中 CAS 定點突變產物及其比例分配表⁴⁰

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P48449、S. cerevisiae ERG7: P38604、A. thaliana CAS: NP_178722、A.

acidocaldarius SHC: BAA25185 和 P. sativum βAS: BAA97558 進行氨基酸

序列比對，藉此方法得知在不同物種間三萜類環化酵素彼此間的相同性 (identity)及相似性( homology) ，因而得以再進一步的探討酵素在結構上與 功能上的相關性。

H.sapiens ERG7 MTEGTCLRRRGGPYKTEPATDLG--RWRLN-CERGRQTWTYLQDER---AGREQT 49 S.cerevisiae ERG7 MTEFYSDTIG---LPKTDPR--LWRLRTDELGRESWEYLTPQQ---AANDPP 44 A.thaliana CAS MWKLKIAEGGS-PWLRTTNNHVGRQFWEFDPNLGTPEDLAAVEEARKSFSDNRFVQKHSA 59 P.sativum βAS MWRLKIAEGGNDPYLFSTNNFVGRQTWEYDPEAGSEEERAQVEEARRNFYNNRFEVKPCG 60 A.acidocaldarius SHC ---

H.sapiens ERG7 GLEAYALGLDTKNYFKDLPKAH---TAFEGALN----GMTFYVGLQAED-GHWTGDY 98 S.cerevisiae ERG7 STFTQWLLQDPK-FPQPHPERNKHSPDFSAFDACHN----GASFFKLLQEPDSGIFPCQY 99 A.thaliana CAS DLLMRLQFSRENLISPVLPQVKIEDTDDVTEEMVETTLKRGLDFYSTIQAHD-GHWPGDY 118 P.sativum βAS DLLWRFQVLRENNFKQTIGGVKIEDEEEITYEKTTTTLRRGTHHLATLQTSD-GHWPAQI 119 A.acidocaldarius SHC ---MAEQLVEAPAYARTLDRAV---EYLLSCQKDE-GYWWGPL 36

H.sapiens ERG7 GGPLFLLPGLLITCHVAR---IPLPAGYREEIVRYLRSVQLP-DGGWGLHIEDKSTVFGT 154 S.cerevisiae ERG7 KGPMFMTIGYVAVNYIAG---IEIPEHERIELIRYIVNTAHPVDGGWGLHSVDKSTVFGT 156 A.thaliana CAS GGPMFLLPGLIITLSITGALNTVLSEQHKQEMRRYLYNHQNE-DGGWGLHIEGPSTMFGS 177 P.sativum βAS AGPLFFMPPLVFCVYITGHLDSVFPPEHRKEILRYIYCHQNE-DGGWGLHIEGHSTMFCT 178 A.acidocaldarius SHC LSNVTMEAEYVLLCHILDR----VDRDRMEKIRRYLLHEQRE-DGTWALYPGGPPDLDTT 91

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H.sapiens ERG7 ALNYVSLRILGVGPDDP---DLVRARNILHKKGGAVAIPSWGKFWLAVLNVYSWEGLNTL 211 S.cerevisiae ERG7 VLNYVILRLLGLPKDHP---VCAKARSTLLRLGGAIGSPHWGKIWLSALNLYKWEGVNPA 213 A.thaliana CAS VLNYVTLRLLGEGPNDG-DGDMEKGRDWILNHGGATNITSWGKMWLSVLGAFEWSGNNPL 236 P.sativum βAS ALNYICMRILGEGPDGGEDNACVRARNWIRQHGGVTHIPSWGKTWLSILGVFDWLGSNPM 238 A.acidocaldarius SHC IEAYVALKYIGMSRDEE---PMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMV 148

H.sapiens ERG7 FPEMWLFPDWAPAHPSTLWCHCRQVYLPMSYCYAVRLSAAEDPLVQSLRQELYVEDFASI 271 S.cerevisiae ERG7 PPETWLLPYSLPMHPGRWWVHTRGVYIPVSYLSLVKFSCPMTPLLEELRNEIYTKPFDKI 273 A.thaliana CAS PPEIWLLPYFLPIHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGKRFVGPITSTVLSLRKELFTVPYHEV 296 P.sativum βAS PPEFWILPSFLPMHPAKMWCYCRLVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQLREELHTEPYEKI 298 A.acidocaldarius SHC PPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVP--ELYETDVPPR 206

H.sapiens ERG7 DWLAQRNNVAPDELYTPHSWLLRVVYALLNLYEHHHS---AHLRQRAVQKLYEHIVA 325 S.cerevisiae ERG7 NFSKNRNTVCGVDLYYPHSTTLNIANSLVVFYEKYLRN---RFIYSLSKKKVYDLIKT 328 A.thaliana CAS NWNEARNLCAKEDLYYPHPLVQDILWASLHKIVEPVLMRWPG-ANLREKAIRTAIEHIHY 355 P.sativum βAS NWTKTRHLCAKEDIYYPHPLIQDLIWDSLYIFTEPLLTRWPFNKLVRKRALEVTMKHIHY 358 A.acidocaldarius SHC RRGAKGG---GGWIFDALDRALHGYQKLSVHP---FRRAAEIRALDWLLE 250

H.sapiens ERG7 DDRFTKSISIGPISKTINMLVRWYVDGPASTAFQEHVSRIPDYLWMGLDGMKMQGTNGSQ 385 S.cerevisiae ERG7 ELQNTDSLCIAPVNQAFCALVTLIEEGVDSEAFQRLQYRFKDALFHGPQGMTIMGTNGVQ 388 A.thaliana CAS EDENTRYICIGPVNKVLNMLCCWVED-PNSEAFKLHLPRIHDFLWLAEDGMKMQGYNGSQ 414 P.sativum βAS EDENSRYLTIGCVEKVLCMLACWVED-PNGDAFKKHIARVPDYLWISEDGMTMQSF-GSQ 416 A.acidocaldarius SHC RQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISP 310

H.sapiens ERG7 IWDTAFAIQALLEAGGHHRPEFSSCLQKAHEFLRLSQVP-DNPPDYQKYYRQMRKGGFSF 444 S.cerevisiae ERG7 TWDCAFAIQYFFVAGLAERPEFYNTIVSAYKFLCHAQF---DTECVPGSYRDKRKGAWGF 445 A.thaliana CAS LWDTGFAIQAILATNLVE--EYGPVLEKAHSFVKNSQVLEDCPGDLNYWYRHISKGAWPF 472 P.sativum βAS EWDAGFAVQALLATNLIE--EIKPALAKGHDFIKKSQVTENPSGDFKSMHRHISKGSWTF 474 A.acidocaldarius SHC VWDTGLAVLALRAAGLPAD---HDRLVKAGEWLLDRQIT--VPGDWAVKRPNLKPGGFAF 365

H.sapiens ERG7 STLDCGWIVSDCTAEALKAVLLLQEK--CPHVTEHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD----G 498 S.cerevisiae ERG7 STKTQGYTVADCTAEAIKAIIMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSFEYG 505 A.thaliana CAS STADHGWPISDCTAEGLKAALLLSKVP-KAIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD----G 527 P.sativum βAS SDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSLLP-PEIVGEKMEPERLFDSVNLLLSLQSKK----G 529 A.acidocaldarius SHC QFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPD---ERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSN----G 415

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H.sapiens ERG7 GFATYETKRGGHLLELLNPSEVFGDIMIDYTYVECTSAVMQALKYFHKRFPEHRAAEIRE 558 S.cerevisiae ERG7 SFATYEKIKAPLAMETLNPAEVFGNIMVEYPYVECTDSSVLGLTYFHKYF-DYRKEEIRT 564 A.thaliana CAS GLATYELTRSYPWLELINPAETFGDIVIDYPYVECTSAAIQALISFRKLYPGHRKKEVDE 587 P.sativum βAS GLAAWEPAGAQEWLELLNPTEFFADIVVEHEYVECTGSAIQALVLFKKLYPGHRKKEIEN 589 A.acidocaldarius SHC GWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFG--EVTDPPSEDVTAHVLECFG---SFGYDDAWK 466

H.sapiens ERG7 TLTQGLEFCRRQQRADGSWEGSWGVCFTYGTWFGLEAFACMGQTYRDGTACAEVSRACDF 618 S.cerevisiae ERG7 RIRIAIEFIKKSQLPDGSWYGSWGICFTYAGMFALEALHTVGETYEN---SSTVRKGCDF 621 A.thaliana CAS CIEKAVKFIESIQAADGSWYGSWAVCFTYGTWFGVKGLVAVGKTLKN---SPHVAKACEF 644 P.sativum βAS FIFNAVRFLEDTQTEDGSWYGNWGVCFTYGSWFALGGLAAAGKTYTN---CAAIRKGVKF 646 A.acidocaldarius SHC VIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREP----YIQKALDW 522

H.sapiens ERG7 LLSRQMADGGWGEDFESCEERRYLQSA--QSQIHNTCWAMMGLMAVRHPDIE--AQERGV 674 S.cerevisiae ERG7 LVSKQMKDGGWGESMKSSELHSYVDSE--KSLVVQTAWALIALLFAEYPNKE--VIDRGI 677 A.thaliana CAS LLSKQQPSGGWGESYLSCQDKVYSNLDGNRSHVVNTAWAMLALIGAGQAEVDRKPLHRAA 704 P.sativum βAS LLTTQREDGGWGESYLSSPKKIYVPLEGNRSNVVHTAWALMGLIHAGQSERDPTPLHRAA 706 A.acidocaldarius SHC VEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKG--ASTPSQTAWALMALIAGGRAESE--AARRGV 578

H.sapiens ERG7 RCLLEKQLPNGDWPQENIAG-VFNKSCAISYTSYRNIFPIWALGRFSQLYPERALAGHP 732 S.cerevisiae ERG7 DLLKNRQEESGEWKFESVEG-VFNHSCAIEYPSYRFLFPIKALGMYSRAYETHTL---- 731 A.thaliana CAS RYLINAQMENGDFPQQEIMG-VFNRNCMITYAAYRNIFPIWALGEYRCQVLLQQGE--- 759 P.sativum βAS KLLINSQLEQGDWPQQEITG-VFMKNCMLHYPMYRDIYPLWALAEYRRRVPLP--- 758 A.acidocaldarius SHC QYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR--- 631

《圖 1-18》H. sapiens ERG7、S. cerevisiae ERG7、A. thaliana CAS、P. sativum βAS 與 A. acidocaldarius SHC 氨基酸序列比對結果

從不同的環化酵素家族其蛋白質序列比對中，可以發現到有些氨基酸 Motif），其氨基酸序列為 [(K/R)(G/A)X2-3(F/Y/W)(L/I/V)X3QX2-5GXW]。這 段功能性區域在 OSLC 與 CAS 中皆有五次重複，而在 SHC 中則重複了

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八次《圖 1-20》。早期學者認為 Q-W Motif 參與在酵素進行環化反應過程 中，因鍵的斷裂與生成所引起的放熱反應以及其焓（enthalpy）釋放有關的 步驟，另外也可能藉由這些功能區域中具有高度保留性的 Tyr 與 Trp，利 用其富含 π 電子軌域的側鏈與高能量的碳陽離子中間物產生碳陽離子與 π 電子的交互作用來穩定這些中間產物，而此推測也符合 Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 的理論模組。

H.sapiens ERG7 STLDCGWIVSDCTAEALKAVLLLQEK--CPHVTEHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD----G 498 S.cerevisiae ERG7 STKTQGYTVADCTAEAIKAIIMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSFEYG 505 A.thaliana CAS STADHGWPISDCTAEGLKAALLLSKVP-KAIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD----G 527 P.sativum βAS SDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSLLP-PEIVGEKMEPERLFDSVNLLLSLQSKK----G 529 A.acidocaldarius SHC QFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPD---ERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSN----G 415

《圖 1-19》不同物種間（氧化）鯊烯環化酵素內負責調控反應起始的胺基酸序列

《圖 1-20》 Q-W Motif 在環化酵素家族內之分佈情形。OSC（H. S.）為 H. sapiens ERG7；

OSC（S.c.）為 S. cerevisiae ERG7；SHC（A.a.）為 A. acidocaldarius SHC；CAS（A.t.）

為 A. thaliana CAS

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然而，在 SHC 的 X-ray 結晶結構被解讀出來後，卻發現到 Q-W Motif 並不是位於酵素的活性區域上，而是位於酵素的表面。這些具有高度保留 性的胺基酸會透過氫鍵與疏水性的交互作用和 α 螺旋結構進行鍵結，而 Wendt 等人也認為酵素是利用這些交互作用來穩定本身的結構，避免被環 化過程中所釋放的能量所破壞。所以 Q-W Motif 近年來已被證實並不全然 與環化機制有關，而認為可能是作為穩定酵素結構的胺基酸。

從序列比對結果發現，酵母菌和人類氧化鯊烯-羊毛脂醇環化酵素及細 菌的 SHC 三者約只有 40% 左右的相似度，但它們在結構、立體選擇性與 催化機制上十分相似。因此學者們認為這些環化酵素家族催化生成高度產 物的特異性主要是由於下列原因所造成的：(1)有嚴格的反應機制。反應受 質必須結合至酵素上正確的受質結合區，以促使受質排列成特殊的結構。(2) 在環化過程中會產生許多具有高能量的碳陽離子中間產物。(3)活性區內的 芳香族氨基酸會利用碳陽離子與 π 電子的交互作用來穩定過渡態的中間產 物，因此可以預防早期環化重組的過程被截斷，以確保產物的順利生成。

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在蛋白質結構的領域中，常會利用核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）及蛋白質 X-ray 單晶繞射（Protein X-ray Crystallography，

X-ray diffraction）解出蛋白質結構。但上述兩種方法皆有所限制，核磁共振 83.7 kDa；阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環化酵素由 759 個 氨基酸所組成，分子量為 86kDa；豌豆（Pisum sativum）中的香桂素合成 酵素由 758 個氨基酸所組成。分子量大加上此酵素與膜結合的特性，因而

在文檔中 利用定點突變研究不同物種之氧化鯊烯環化酵素假設活性區內氨基酸之角色 (頁 29-37)