在整篇論文中，我們利用了丙氨酸掃描法，針對豌豆 PSY 和阿拉伯芥 CAS 的 假 設 活 性 區 氨 基 酸 做 定 點 突 變 ， 也 用 飽 和 定 點 突 變 將 酵 母 菌
ERG7C457 突變成其他 19 種氨基酸，藉由突變產物的分析配合分子模擬結
構圖，更進一步探討這些活性區氨基酸在酵素催化機制中所扮演的角色，
以及酵素結構與活性的關係。
6.1 利用丙氨酸掃描針對 PsaPSY 和 AthCAS 假設活性區氨基 酸的結果分析
（1） 在 PsaPSY 中，Y259A 與 G369A 單定點突變株即造成酵素失去活 性。由電腦分子模擬結果發現，許多活性區內用來穩定高能中間物的芳香 族氨基酸，同時受到 Y259A 與 G369A 突變影響，產生角度或是位置上的 偏移，而導致酵素失去活性。
（2） 在 AthCAS 中，五個定點突變株 Y118A、L124A、W221A、M254A 和 P367A 會導致酵素失去原本活性。在其分子模擬結果中，也觀察到活性 區內一些芳香族氨基酸受定點突變影響而產生偏移現象。
（3） CASH257A 不具有原酵素活性，而是生成在不同位置脫氫的四環產物 parkeol。當 His 突變成殘基較小的 Ala 時，多出來的空間可能造成受質的 浮動增加，再加上 Phe726 的偏移，能進一步穩定 C9/C11 碳陽離子中間物，
導致產物脫氫的位置改變，進而生成 parkeol。
（4） 經由分析 pYES2 PSYY259H 與 pRS314 PSYY259H 突變株產物證明，豌
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豆基因 PSY 確實因在酵母菌內的表現量不足，導致我們沒有辦法觀察到一 些提早環化結束或是在不同位置脫氫的產物，因此難以對其功能做進一步 的分析。但在丙氨酸掃描突變株中，也難以排除因 Ala 基團影響的可能因 素。同樣的問題，可能也存在於同為外來基因的 AthCAS 中。
6.2 酵母菌 ERG7 C457 的功能性分析
（1） 在酵母菌 ERG7C457X 的功能性篩選中，除了芳香族氨基酸（Phe、
Tyr 和 Trp）、帶負電荷氨基酸（His、Lys 和 Arg）和酸性基團氨基酸 Asp 突變會使酵素失去活性之外，其它突變株都仍保有野生型 ERG 的酵素活 性。
（2） 在 C457F 突變株中，可得到微量的單環和雙環產物，至於其它五個 芳香族氨基酸和帶電荷氨基酸突變株：C457Y、 C457W 、C457H、C457K 和 C457R，皆因其殘基巨大的立體障礙或是基團上所帶的電荷，使受質與 酵素無法和酵素作適當的結合，因而阻礙受質與 Asp 456 的反應，使得開 環反應無法進行。
（3） 在 C457D 和 C457E 的殘基只差了一個碳鏈的長度，卻導致完全迥 異的酵素活性。經電腦模擬發現，這一個碳鏈的差別，導致兩個殘基偏折 角度的改變。推測當突變的酸性基團與 Asp456 競爭與 Glu460 反應再質 子化時，C457D 因殘基的鏈長與角度的影響，無法互補 Asp456 的功能，
而導致酵素完全失去活性。
（4） C457G 突變株中，因 Gly 殘基過小，導致受質或氨基酸的可變動角 度增加，變得較不穩定，而得到 75% 的 Achilleol A 與 25% 的羊毛硬脂
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醇。
（5） 綜合飽和定點突變株和電腦模擬結果，發現因 Cys457 鄰近開環氨 基酸 Asp456，所以容易對於開環反應的成敗有所影響，但只要突變的基團 不是具有過分巨大的立體障礙或是帶有電荷的影響，基本上仍都具有酵素 活性，可生成羊毛硬脂醇。此外，Cys457 也能利用其本身殘基以減少受質 或酵素變動的空間，達到穩定催化反應的功能。