AthCAS 突變株結果分析與討論

《圖 4-8》顯示當以環阿屯醇為受質時，其假設活性區內的十四個氨基 酸的相對位置，這些氨基酸大多分布在 C、D 環或是受質側鏈附近，有些甚 至是屬於第二層的氨基酸。在 AthCAS 假設活性區的單定點突變中，

CAS^H257A 會 產 生微 量 的 parkeol， 而 CAS^Y118A、 CAS^L124A、 CAS^W221A、

CAS^M254A 和 CAS^P367A 五個定點突變則會使酵素失活，其餘剩下的的六個突

變株仍都保有野生型的 AthCAS 環化功能，生成環阿屯醇。

《圖 4-8》野生型 AthCAS 十四個活性區氨基酸結構模擬圖

比對 AthCAS 與氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的序列，發現二者的胺 基酸保留性高，活性區對應的胺基酸大部分為相同的氨基酸，只有在

CAS^Lue124、CAS^Thr215、CAS^Met254 其對應的氨基酸在官能基特性上有明顯差

異，故此，猜測這三個殘基位置及其鄰近的氨基酸可能是造成終止反應脫 氫位置不同的重要決定位置。但經丙氨酸突變後，我們發現 CAS^T215A 對酵 素活性並無影響，而 CAS^L124A、CAS^M254A 會使酵素失去活性，另外由其結

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構模擬圖如《圖 4-9》顯示，當 Leu124 突變成 Ala 後，會影響 Phe123 和 Trp221 的位置，並且產生角度上的改變，也使 Glu165 和 Lue166 有明顯 的偏移；而 Met254 突變後，經由主鏈的改變會影響其鄰近 Trp255 的位 置，使其向活性區內位移，除此之外，鄰近的 Tyr262、Tyr557、Pro558 和 Tyr557 等氨基酸也都有微幅不小的變動。故此推論，這些活性區氨基酸因 自身殘基在空間上的改變，會影響其鄰近氨基酸在空間角度或位置上改變，

而影響原本酵素活性。此外，在 CAS^Y118A、CAS^Y221A 和 CAS^P367A 的模擬 結構圖中，我們也看到有類似的效應：CAS^Y118A 影響 Tyr410、Trp416、

Phe726 和 Phe123，CAS^Y221A 則影響 Phe123、Trp217、Tyr262 和 Pro264，

以及 CAS^P367A 影響 Phe123、Leu124、Tyr118 等等。或許因為所突變的氨 基酸位於活性區內，所以只要做單點突變，尌會影響到其它同樣位在活性 區中鄰近的芳香族氨基酸，而這些芳香族基團又是在環化過程中穩定高能 中間物所不可或缺的，因此才會造成酵素失去原本活性。

此外，我們只有在 CAS^H257A 觀察到非環阿屯產物，其之所以產生 parkeol，可能是因為當 His 突變成殘基較小的 Ala 後，會使得受質的 C 環浮動的空間增加，且經由結構模擬發現，在此突變株中 Phe726 苯環的 位置會偏折到 C11 位置附近，如《圖 4-9 F》所示，因此我們認為其可經 由環上π 電子來穩定 C9 與 C11 上過渡態的碳陽離子，使其最終在此脫氫 而生成 parkeol。另外，我們認為 pRS313 CAS 和 pRS314 PSY 有相同的 問題，因為其皆為植物基因而非酵母菌基因，所以用酵母菌表現時，表現 量不如酵母菌本身基因 ERG7，因此對於新產物的生成難以觀測。

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《圖 4-9》A. 突變株 AthCAS^Y118A（綠色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較；

B. 突變株 AthCAS^L124A（黃色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較；

C. 突變株 AthCAS^W221A（桃色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較；

D. 突變株 AthCAS^M254A（灰色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較；

E. 突變株 AthCAS^P367A（橘色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較；

F. 突變株 AthCAS^H257A（紫色）與野生型 AthCAS（藍色）之空間比較

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