第四章 利用丙氨酸掃描法對豌豆和阿拉伯芥的 氧化鯊烯環化酵素假設活
4.1 研究背景
在自然界中，細菌與原生動物並不會產生固醇類，而是以五環的蛇麻 烯作為替代 43,44。細菌中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素、哺乳類動物中的氧化鯊 烯-羊毛硬脂醇環化酵素與植物中的環阿屯醇合成酵素和香桂素合成酵素同 樣屬於三萜類環化酵素家族，因此具有類似的環化機制《圖 4-1》45。
《圖 4-1》鯊烯-蛇麻烯環化酵素（SHC）的環化機制45
從受質的觀點來看，真核細胞的氧化鯊烯環化酵素利用氧化鯊烯作為受 質，而細菌的鯊烯環化酵素則是利用鯊烯作為受質，所以鯊烯環化酵素被 認為出現在演化過程中較早的厭氧時期。另外，細菌的鯊烯環化酵素對受 質的專一性也較低，不僅可以利用鯊烯作為受質，對於氧化鯊烯或是其光 學異構物甚至是一般的多萜醇也可以進行反應。相反地，真核的氧化鯊烯 環化酵素則具有很高的受質結構專一性。若從環化機制上來觀察，鯊烯環 化酵素在反應機制和形態上都是以較簡單的方式進行。當它在進行環化作 用時，受質會以較穩定的”椅形-椅形-椅形”的結構存在，這使得受質需要的 酵素助力較小，而在細菌的鯊烯環化酵素中，也不具有最後的骨架重排步 驟。
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素中也具有高度保留性，且在氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素並不具有這樣 的氨基酸，所以被認為是參與蛇麻烯 E 環形成的關鍵胺基酸位置。蛇麻烯 環化酵素的最終步驟是藉由具立體選擇性的脫氫反應形成 hop-22(29)-en
（80%），或是藉由水的加成產生 hopan-22-ol（20%） 而終止整個環化反 應。Wendt 等人推測，酵素是利用 Gln262、Glu45、Glu95 和 Arg127 所 形成的氫鍵網絡將水分子極性化，以利極性化的水分子吸引質子或羥基的 加成。定點突變的實驗也證實，Glu45Ala 和 Glu45Asp 突變會使 hopen 與 hopanol 的產物比例產生巨大的改變。另外，值得注意的是藉由受質類似物 所得部分環化的產物也都是以脫氫中止反應，而非羥基的加成來終止反 應。
《圖 4-2》右圖為 AacSHC 之 X-ray 晶體結構圖。C 為胺基酸的 COOH 端；N 為 NH2 端；L 為抑制劑（LDAO）接合位置；E 為酵素表面唯一的非極性區域，其大小約為 1600Å2 並被認為是受質進入的通道（Entrance Channel）。紅色與黃色之滾筒狀緞帶構形為 α-Helix 的結構；綠色為 β 結構；紫色為 QW-Motifs 之重複區域。左圖為鯊烯環化酵 素之活性區氨基酸位置42
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《圖 4-3》鯊烯-蛇麻烯環化酵素活性區域內假設活性氨基酸的位置與功能48
我們利用分子模擬的方式，以鯊烯蛇麻烯環化酵素（AacSHC）的 X-ray 晶體結構為模板，經序列比對的方式找出其相應於豌豆中香桂素合成酵素
（PsaPSY）與阿拉伯芥中環阿屯醇合成酵素（AthCAS）的活性區氨基酸《表 4-1》，再經丙氨酸掃描法，也尌是把假設的活性區氨基酸突變成丙氨酸，
利用此法遮蔽特定位置上所帶的官能基的功能，探索當此位置官能基被去 除時，會產生何種情形，藉此推估原先殘基所參與的功能為何。一些研究 團隊探討酵素立體結構對於環化反應上的催化機制，已清楚地建立反應受 質經重排重組後其所形成碳陽離子中間物的可能催化機制。配合這些理論 模組及催化機制，我們假若此氨基酸在環化的催化過程中具有決定性影響，
經此重要突變後，會因為改變了酵素參與環化的殘基，或影響受質在酵素 中的摺疊方式，或者破壞了可穩定反應受質碳陽離子中間物的結構，而有 可能改變產物專一性或有多樣產物的產生。
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AacSHC PsaPSY AthCAS SceERG7