第三章 實驗方法
3.1 重組質體的建構
利用 Stratagene 公司所出品的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互補引子。再以含有正 常 功 能 的 野 生 型 pRS314 PSY 或 pRS314 ERG7 作 為 模 板 ， 利 用 QuikChange PCR Kit 所標示之標準流程《圖 3-2》，建構定點突變之質體。
《圖 3-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis 示意圖
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PSY primer name Sequence
CTL-PSY-I119A-ApaⅠ1 5’-CCA gCT CAA gCT gCA ggg CCC CTA TTT TTC-3’
CTL-PSY-F124A-ApaⅠ1 5’-CAA ATT gCA ggg CCC CTA gCT TTC ATg CCT-3’
CTL-PSY-F125A-ApaⅠ1 5’-CAA ATT gCA ggg CCC CTA TTT gCC ATg CCT CCT-3’
CTL-PSY-P128A-StyⅠ1 5’-TTC ATg CCT gCC TTg gTT TTC TgT gTC-3’
CTL-PSY-L180A-NdeⅠ1 5’-gTA CTg CAg CCA ACT ACA TAT gTA TgC gg-3’
CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 5’-CAA CAC ggT ggg GTC ACC CAT ATA gCT TCg Tgg-3’
CTL-PSY-W219A-ClaⅠ1 5’-TAC CTT Cgg Cgg ggA AAA CTT ggC TA T CgA TAC TT-3’
CTL-PSY-W223A-ClaⅠ1 5’-ggg AAA ACT gCg CTA TCg ATA CTT ggT gTg-3’
CTL-PSY-M256A-HincⅡ1 5’-CAg CTA AAg CgT ggT gTT ATT gTC gAC Tgg TAT AC-3’
CTL-PSY-Y259A-HincⅡ1 5’-ATg Tgg TgT gCT TgT CgA CTg gTA TAC ATg-3’
CTL-PSY-V263A-SalⅠ1 5’-ggT gTT ATT gTC gAC Tgg CAT ACA TgC CTA Tg-3’
CTL-PSY-Y264A-SpeⅠ1 5’-gTT ATT gTC gAC TAg TAg CCA TgC CTA Tg-3’
CTL-PSY-G369A-MfeⅠ1 5’-CgA TAC CTT ACA ATT gCC TgT gTg gAA AAg-3’
CTL-PSY-C370A-MfeⅠ1 5’-CgA TAC CTT ACA ATT ggC gCT gTg gAA AAg-3’
《表3-2》酵母菌 ERG7C457X 飽和定點突變之引子設計
YOSC primer name Sequence
CTL-YOSC-C457IKMNRST-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT AN(C/g) ACT gCA gAA g-3’
CTL-YOSC-C457CFLSWY-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT TN(C/g) ACT gCA gAA g-3’
CTL-YOSC-C457HLPQR-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT CN(C/g) ACT gCA gAA g-3’
CTL-YOSC-C457ADEGV-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT gN(C/g) ACT gCA gAA g-3’
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（2）QuikChange Site-Directed Mutagenesis
利用 Stratagene 公司的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，按 照《表 3-3》所列之組成條件混合，再以《圖 3-3》所示溫度進行聚合酶連 鎖反應來建構飽和定點突變之質體 DNA，其配對反應（annealing）溫度視 引子的 Tm 值決定。
《表3-3》 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之組成
Reagent Volume (μl)
Primer1 (1μg/μl) 0.5
Primer2 (1μg/μl) 0.5
Template 0.5
dNTP (10 mM) 1.6
Pfu II buffer
2
Pfu II polymerase
0.4
DDW 14.5
Total 20
《圖 3-3》 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 反應條件
（3）Dpn I 酵素切除母股 DNA
將 PCR 產物以《表 3-4》之條件放置在水浴槽中於 37℃ 下反應四個 小時，因 DpnΙ 酵素具有截切甲基化 DNA 之特性，因此我們可以用其去 除不含有突變之母股 DNA。
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《表3-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物之條件
Reagent Volume (μl)
PCR products 8
10X NE Buffer 4 1
Dpn I
1
（4）突變質體的放大與酵素鑑定
利用熱導入（Heat shock）進行轉形作用（transformation），使大腸桿 菌吸收重組質體。從 -80℃ 冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取 10 μl 含有突變點之質體 DNA ，並加入 100 μl 的勝任細胞，冰浴 20 分鐘使質 體 DNA 附著於細胞的表面。置於 42℃ 的水浴一分鐘，使細胞表面因熱 產生小孔洞而促使質體 DNA 進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入於 1 ml 的 LB 詴管中，以 37℃、200 rpm 震盪條件培養一小時後，將菌液以 8,000rpm 的條件離心一分鐘並去除上清液，接著在無菌環境下將菌液塗在 LB 培養基，在 37℃ 下培養約 16 小時後，挑取單一菌落培養於 3 ml 的 LB 詴管（含 Ampicillin 100mg/L），於 37℃、200 rpm 震盪條件下培養 12 小時，即可利用 Plasmid Miniprep Purification Kit 抽取放大之質體 DNA。
由於 XLI-Blue 含 tetr 基因，可以抵抗四環素生長，而質體 pRS314 帶有 抗 Ampicillin 的基因，因此可利用 Ampicillin 篩選轉形細胞，只有轉型成 功的細胞可同時在 Amp / LB 培養基及 Tet / LB 培養基生長。
將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依《表 3-5》所示之條件，
與限制酶和特定緩衝液混和，並置於 37℃ 水浴槽中反應四小時，再以 DNA 電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。
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《表3-5》特定限制酶鑑定之材料條件
Reagent Volume (μl) 1 Volume (μl) 2
Plasmid 2 2
10X NE Buffer 1 1
BSA - 1
Enzyme 0.5 0.5
DDW 6.5 5.5
（5）突變質體的定序
將上述經由限制酶鑑定過之含有突變的質體 DNA 以 Sanger Method
（ dideoxynucleotide chain termination ） 進 行 定 序 。 首 先 利 用 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，以《表 3-6》所示之材料條件進行聚 合酶連鎖反應，各突變質體之引子列於《表 3-7》。反應過後，以酒精沈澱 法取得 DNA，再以 ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
《表3-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
Reagent Volume (μl)
Plasmid 2
5X Sequencing Buffer 3
Primer 1
BigDye 3.1 0.8
DDW 13.2
《圖 3-4》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之溫度
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《表3-7》pRS314 PSY、pRS313 CAS 與 pRS314 ERG7變質體定序引子對照表