國 立 交 通 大 學
生物科技研究所
碩士論文
利用定點突變研究不同物種之
氧化鯊烯環化酵素假設活性區內氨基酸之角色
Functional Analysis of Putative Active Site Residues in
Oxidosqualene Cyclases from Different Species
by Site-Directed Mutagenesis
研 究 生 : 呂靜婷
指導教授 : 吳東昆 博士
利用定點突變研究不同物種之
氧化鯊烯環化酵素假設活性區內氨基酸之角色
Functional Analysis of Putative Active Site Residues in
Oxidosqualene Cyclases from Different Specie
by Site-Directed Mutagenesis
研究生：呂靜婷 Student: Ching-Ting Lu 指導教授：吳東昆 博士 Advisor: Dr. Tung-Kung Wu國 立 交 通 大 學
生物科技研究所
A ThesisSubmitted to Department of Biological Science and Technology College of Biological Science and Technology
National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of Master
in
Biological Science and Technology July, 2010
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
I
利用定點突變研究不同物種之
氧化鯊烯環化酵素假設活性區內氨基酸之角色
學生: 呂靜婷 指導教授: 吳東昆 博士 國立交通大學 生物科技研究所碩士班 摘要 氧化鯊烯環化酵素的催化機制在近半世紀以來，是生物化學及化學家 公認最迷人且最具挑戰性的生化反應之一。直鏈狀的氧化鯊烯在不同物種 的氧化鯊烯環化酵素內，經過單一步驟的酵素催化反應後，生成近二百種 具有物種特異性的四至六環的三萜類化合物。為了探討同源的氧化鯊烯環 化酵素如何在演化的過程中，藉由改變其活性位置的氨基酸結構以產生具 有不同物種專一性之產物，我們利用丙氨酸掃描法，探討豌豆中香桂素合 成酵素和阿拉伯芥中環阿屯醇酵素的假設活性區氨基酸其參與在酵素的結 構與活性關係。並且，針對酵母菌氧化鯊烯環化酵素活性區域中 Cys457 進 行飽和定點突變，進行功能性的全面分析。在豌豆香桂素合成酵素中，我們發現 PSYY259A 與 PSYG369A 單定點突
變株會造成酵素失去其原本的活性；而在阿拉伯芥環阿屯醇酵素中，有五
個定點突變株 CASY118A、CASL124A、CASW221A、CASM254A
和 CASP367A 會 導致酵素失去原本活性，而 CASH257A 則是改變在環化最終步驟的脫氫反應， 進而生成帕克醇。這些影響酵素活性的氨基酸突變，對於鄰近的氨基酸都 具有一定程度的影響，而導致環化機制的失常。此外，利用不同載體表現 PSYY259H並分析其突變株產物結果發現，若欲以酵母菌表現其他物種基因， 需以具有高表現量特質之載體攜帶較佳。 在酵母菌 ERG7 飽和定點突變中，巨大的立體障礙（如 Phe、Tyr 與 Trp
II 等氨基酸取代）與電荷影響（如 His、Lys、Arg 和 Asp 等取代）都可能會 使酵素失去原本活性。此外，殘基過小的 Gly 取代也會影響酵素與受質的 穩定性，改變產物分布，使單環的 Achilleol A 成為其主要產物。實驗結果 顯示，Cys457 對於受質的開環反應有直接相關的影響，此外也會利用氨基 酸殘基的立體障礙穩定環化機制的反應。
III
Functional Analysis of Putative Active Site Residues in
Oxidosqualene Cyclases from Different Specie
by Site-Directed Mutagenesis
Student: Ching-Ting Lu Advisor: Dr. Tung-Kung Wu
Institute of Naitonal Chiao Tung Unversity
Abstract
The enzymatic cyclization of oxidosqualene is one of the most remarkable
steps in the biosynthesis of steroids and triterpenoids. Oxidosqualene cyclases catalyze the biotransformation of the linear form substrate, oxidosqualene, into nearly 200 skeletally diverse triterpene compounds. In order to investigate the evolutionary divergence for the production of species-dependent products from individual oxidosqualene cyclases-mediated cyclizations via changing their critical active site environments, the alanine-scanning mutagenesis on plant P.
sativum βAS and A. thaliana CAS were carried out, respectively, to study the
relationship between functional residues substitutions and the respective enzymatic activity. Moreover, site-saturated mutagenesis experiments on Cys457 of S. cerevisiae ERG7 were carried out to clarify functional role of Cys457.
From the observation of mutagenic effect on either plant P. sativum βAS and
IV
catalytic function in βAS cyclization reaction. Moreover, CASY118A、CASL124A、
CASW221A、CASM254A、CASH257A and CASP367A mutations also lost their original
function. Among them, CASH257A mutation changed the deprotonation site and resulted in the production of parkeol. The homology model revealed that the position of aromatic amino acid in active site was affected by these mutations. Besides, the analysis result of NSL extraction of PSYY259H mutant with a galactose-inducible vector, pYES2, exhibited a distinct product profiles from that of original pRS314 vector, suggesting that pYES2 vector is a suitable plasmid for analysis of plant oxidosqualene cyclase.
In parallel, the site-saturated mutations on Cys457 position of S. cerevisiae ERG7 showed that most of the substitutions successfully complemented the cyclase activity in a yeast ERG7 deficient strain, TKW14c2, except for the aromatic side chain substituted mutations（Phe、Tyr and Trp）and electronically charged side chain substitutions（His、Lys、Arg and Asp）. Conversely, the residue of Gly substitution is too small to stabilize the cyclization reaction and leads to a monocyclic achilleol A formation. The homology modeling study suggested that the functional role of Cys457 might affect Asp456 to initiate the epoxide ring opening as well as to stabilize the following A-ring cyclization.
V
謝 誌
轉眼間，即將告別兩年的碩士生活，在這兩年裡有歡笑也有淚水，對 於一路陪伴的老師、學長姐、同學以及學弟妹們在此要獻上我最深的感謝 及祝福。 感謝吳東昆老師，謝謝老師讓我加入這溫馨的大家庭，並且不時的給 予實驗上以及做人處世上的教導以及照顧，謝謝老師對於整個實驗室投入， 讓我們擁有比別人更多更多的資源和儀器，即使在經費拮据的情況下，老 師仍希望我們能無後顧之憂的進行實驗，千言萬語還是化作一句—老師， 謝謝您！ 感謝口詴委員李耀坤老師和楊裕雄老師在百忙之中抽空審閱修改我的 論文、親臨指導口詴，並且不吝惜的給予許多寶貴的建議，使我收穫良多。 感謝實驗室永遠的燈塔—翔哥，謝謝你在最後的一個月幫我再三的修 改論文；感謝媛婷學姐兩年來耐心的教導和鼓勵，你每一次的鼓勵都讓徬 徫的我生出無比信心；感謝裕國學長在貧乏的實驗生活中，帶來許多非人 類的朋友；感謝豪哥一直默默的維護著實驗室的電腦儀器，在你離開博愛 校區的實驗室後才發現你有多重要；感謝晉源學長在表現實驗上的教導， 在那一個月內我見識到學長對於實驗認真的一面；感謝文鴻學長一直支持 著我幻想的明星夢，甚至加入我的幻想世界；Thank you, Mili. I’ll always miss your India food.；感謝小紅學姐在搬去光復居住後，仍辛苦奔波到博愛陪我 吃早餐，趕上十點進實驗室的目標；感謝一直不斷發 paper 的 Allen 從不吝 嗇與我們分享你的喜悅；感謝亦諄學姐和胡天昶對我實驗上和生活上的指 導和幫助，雖然我都直呼胡天昶名諱，但我還是很尊敬你的，學長；感謝 兩年來一直甘苦與共的同學，書涵、小花和奕齊有你們真好；感謝與我僅 有 2 個月碩班同學緣分的小強不時回來探望，謝謝你分享不同實驗室的生 活讓我更懂得珍惜；感謝學弟妹怡臻、欣怡、欣芳、世穎、新進學弟妹和 專題生們，謝謝你們分擔了實驗室庶務也未帶來了歡樂。 還要感謝我親愛的家人：爸爸、媽媽還有姊姊，謝謝你們的支持，讓 我可以依實無虞的念書，有你們我真的很幸福。 最後，祝福大家身體健康、一切順利、天天開心！！VI
目錄
中文摘要 ... I 英文摘要 ... III 謝誌 ... V 目錄 ... VI 表目錄 ... IX 圖目錄 ... X 第一章 前言 ... 1 1.1 氧化鯊烯環化酵素簡介 ... 1 1.2 氧化鯊烯酵素環化機制 ... 5 1.2.1 受質的摺疊 ... 6 1.2.2 環氧基開環和 A 環的形成 ... 7 1.2.3 環化過程和受質穩定之假說 ... 9 1.2.4 骨架重排與脫氫反應 ... 15 1.3 (氧化)鯊烯環化酵素氨基酸序列比對 ... 18 第二章 研究目的 ... 23 第三章 實驗方法 ... 25 3.1 重組質體的建構 ... 26 3.2 酵母菌珠 TKW14c2 的電穿孔作用 ... 31 3.3 功能性補充活性篩選 ... 32 3.4 酵母菌的培養 ... 33 3.5 非皂化脂質的萃取 ... 33VII 3.6 管柱液相色層分析 ... 33 3.7 薄層色層分析 ... 34 3.8 氣相層析-質譜儀（GC-MS）的條件 ... 35 3.9 突變電腦模擬圖的建構 ... 35 第四章 利用丙氨酸掃描法對豌豆和阿拉伯芥的 氧化鯊烯環化酵素假設活 性區進行功能性分析 ... 36 4.1 研究背景 ... 36 4.2 丙氨酸掃描之結果與討論 ... 41 4.2.1 建構假設活性區之定點突變株 ... 41 4.2.2 定點突變株功能性補充篩選 ... 43 4.2.3 PsaPSY 定點突變株產物分析 ... 44 4.2.4 PsaPSY 突變株電腦模擬分析與結果討論 ... 46 4.2.5 AthCAS 突變株結果分析與討論 ... 50 第五章 利用飽和定點突變對酵母菌 ERG7C457X 進行功能性分析 ... 53 5.1 研究背景 ... 53 5.2 實驗結果與討論 ... 56 5.2.1 建構酵母菌 ERG7C457X 定點飽和突變株 ... 56 5.2.2 酵母菌 ERG7C457X 突變株功能性補充篩選 ... 56 5.2.3 酵母菌 ERG7C457X 突變株產物分析 ... 58 5.2.4 酵母菌 ERG7C457X 產物生成途徑推測 ... 61 5.2.5.1 帶電荷氨基酸和芳香族氨基酸對開環的影響 ... 64 5.2.5.2 ERG7C457 在環化過程所扮演的的角色 ... 66 第六章 結論 ... 67
VIII 6.1 利用丙氨酸掃描針對 PsaPSY 和 AthCAS 假設活性區氨基酸的結果 分析 ... 67 6.2 酵母菌 ERG7C457 的功能性分析 ... 68 第七章 未來展望 ... 70 參考文獻 ... 71 附錄一 利用桿狀病毒於昆蟲細胞中表現酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化 酵素 ... 74 附錄二 實驗藥品和儀器 ... 79
IX
表目錄
《表 1-1》阿拉伯芥中 CAS 定點突變產物及其比例分配表 ... 17
《表 3-1》豌豆 PSY 假設活性區胺基酸定點突變之引子設計 ... 27
《表 3-2》酵母菌 ERG7C457X 飽和定點突變之引子設計 ... 27
《表 3-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之組成 ... 28
《表 3-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物之條件 ... 29
《表 3-5》特定限制酶鑑定之材料條件 ... 30
《表 3-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料 ... 30
《表 3-7》pRS314 PSY、pRS313 CAS 與 pRS314 ERG7 變質體定序引子 對照表 ... 31 《表 3-8》因應不同載體所需之氨基酸添加表 ... 32 《表 4-1》各物種間假設活性區之氨基酸比對 ... 40 《表 4-2》PsaPSY 之酵素鑑定 ... 42 《表 4-3》PsaPSY 假設活性區功能性篩選表 ... 43 《表 4-4》丙氨酸掃描 PsaPSY 與 AthCAS 假設活性區氨基酸之產物分 析表 ... 44 《表 5-1》酵母菌 ERG7C457X 功能性篩選 ... 57 《表 5-2》酵母菌 ERG7C457X 的產物分析表 ... 59
X
圖目錄
《圖 1-1》氧化鯊烯在真菌及動物中經 OSLC 環化成羊毛硬脂醇 ... 1 《圖 1-2》 (氧化)鯊烯酵素家族在不同物種間的產物專一性與多樣性 ... 2 《圖 1-3》動物、真菌和植物體內固醇類的生合成步驟 ... 3 《圖 1-4》降膽固醇藥物﹕Lovastatin、Pravastatin、Fluvastatin 結構 ... 4 《圖 1-5》氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之環化機制 ... 6 《圖 1-6》 氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物 ... 7 《圖 1-7》酵母菌與人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之假設開環環化 機制 ... 8 《圖 1-8》鄰助作用幫助環氧基質子化開環 ... 9 《圖 1-9》環化形成 A 環速率大於 C2-C3 單鍵旋轉速率 ... 9 《圖 1-10》人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素受質在 B 環的構形與穩定 ... 10 《圖 1-11》利用類似物作為受質結果顯示 C 環會先形成五圓環 ... 11 《圖 1-12》Hess 認為 C 環與 D 環會經由過渡態 10 同時形成 ... 11 《圖 1-13》氧化鯊烯酵素環化過程 ... 錯誤! 尚未定義書籤。 《圖 1-14》Johnson 提出的理論模型 Johnson Model ... 14《圖 1-15》Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 理論模組 ... 14
《圖 1-16》氧化鯊烯環化酵素及其產物-羊毛硬脂醇形成複合物的結構圖 ... 16 《圖 1-17》CAS 與 ERG7 中氨基酸保留形式的差異 ... 17 《圖 1-18》各物中間（氧化）鯊烯環化酵素氨基酸序列比對結果 ... 20 《圖 1-19》不同物種間（氧化）鯊烯環化酵素內負責調控反應起始的胺 基酸序列 ... 21 《圖 1-20》 Q-W Motif 在環化酵素家族內之分佈情形 ... 21
XI
《圖 3-1》實驗流程圖... 25
《圖 3-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis 示意圖 ... 26
《圖 3-3》 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 反應條件 ... 28
《圖 3-4》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之溫度 ... 30
《圖 4-1》鯊烯-蛇麻烯環化酵素的環化機制 ... 36
《圖 4-2》AacSHC 之 X-ray 晶體結構圖與活性區氨基酸 ... 38
《圖 4-3》鯊烯-蛇麻烯環化酵素活性區域內假設活性氨基酸的位置與功 能 ... 39
《圖 4-4》不同氧化鯊烯環化產物標準品之質譜與其結構對照圖 ... 45
《圖 4-5》野生型 Psa PSY、Psa PSYG369A 與 Psa PSYY259A 結構模擬圖 47 《圖 4-6》野生型 pRS314 ERG7 與 pRS314 PSY 經管柱層析後的 GC-MS 圖 ... 48
《圖 4-7》利用限制酶切接取得 pRS314 PSYY259H 之方法 ... 49
《圖 4-8》野生型 AthCAS 十四個活性區氨基酸結構模擬圖 ... 50
《圖 4-9》阿拉伯芥 CASY118A、CASL124A、CASW221A、CASM254A、CASP367A 和 CASH257A 等突變株分別與野生型 CAS 之空間結構比較 . 52 《圖 5-1》野生型和三定點突變株之鯊烯環化酵素環化受質與其產物 ... 53
《圖 5-2》人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 X-ray 晶體結構 ... 54
《圖 5-3》人類氧化鯊烯環化酵素 Cys456 和 Cys533 以氫鍵與 Asp455 連結 ... 55 《圖 5-4》酵母菌 ERG7C457X 其產物質譜與其結構對照圖 ... 60 《圖 5-5》酵母菌 ERG7C457X 產物生成路徑推測圖 ... 62 《圖 5-6》野生型酵母菌 ERG7C457 與附近氨基酸結構模擬圖 ... 63 《圖 5-7》酵母菌突變株 ERG7C457W、ERG7C457R 與其鄰近氨基酸結構模 擬圖 ... 64
XII 鄰近氨基酸結構模擬圖 ... 65 《圖 5-9》酵母菌突變株 ERG7C457G 與野生型 ERG7 之空間結構比較 ... 66 《附錄圖 1-1》pBacPAK8-MTeGFP ERG7 質體建構流程圖 ... 75 《附錄圖 1-2》桿狀病毒感染昆蟲細胞之流程圖 ... 76 《附錄圖 1-3》電泳分析之樣品備製 ... 77 《附錄圖 1-4》酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素在 Sf9 細胞株的表 現結果... 78 《附錄圖 1-5》酵母菌氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素在 High 5 細胞株的 表現結果 ... 78
1
第一章 前言
1.1 氧化鯊烯環化酵素簡介
氧化鯊烯環化酵素家族以直鏈狀的氧化鯊烯（oxidosqualene, OS）為受 質，經過單一步驟的酵素催化反應後，生成多種具有物種特異性的四至六 環的三萜類化合物（triterpenoid）《圖1-1》。目前約有近 200 種氧化鯊烯 環化酵素的產物被報導出來1，這些產物的產生是經由類似的催化機制，因 此都具有相似的骨架結構，但是由於在酵素活性區域與受質結合區的不同， 導致其在環化骨架上有所差異，另外經由甲基與氫化基的重排反應後也會 產生許多不同的碳陽離子中間產物，最後則依不同的碳陽離子的脫除步驟 （cation-quenching）以終止反應，進而形成多樣的產物，這些環化產物亦 可作為固醇類生合成的前驅物。 (3S)-2,3-Oxidosqualene HO Lanosterol O HO H H H Cholesterol Another 18 enzymatic reactionsOSC
《圖 1-1》氧化鯊烯在真菌及動物中經氧化鯊烯環化酵素環化成羊毛硬脂醇
在高等植物中，氧化鯊烯可以被環阿屯醇合成酵素（ cycloartenol synthase, CAS）環化進而生成五環之環阿屯醇（cycloartenol），或是經由羽 扇醇合成酵素（lupeol synthase, LUS）的作用合成五環的羽扇醇（lupeol）， 亦可以被香桂素合成酵素（amyrin synthase, AMS）環化而形成五環的 α-香 桂素（α-amyrin）或 β-香桂素（β-amyrin）。在動物、真菌與其它甲基營 生 菌 （ methylotrophic bacterium ） 中 ， 氧 化 鯊 烯 - 羊 毛 硬 脂 醇 環 化 酵 素
2
（oxidosqualene-lanosterol cyclase, OSLC）則會將氧化鯊烯環化形成四環之 羊毛硬脂醇（lanosterol, LA）《圖 1-2》。這些具有產物專一性的環化產物， 可分別依反應產物骨架的複雜性進而區分為 6-6-6-5 四環、6-6-6-6-5 五環、 6-6-6-6-6 五環或其他單環、雙環、三環與六環的三萜類化合物。 Squalene O (3S)-2,3-Oxidosqualene OH Hopanol Hopene HO Lupenol HO
β-Amyrin HO Dammaradienol HO Cycloartenol
HO Lanosterol Bacterial Bacterial Higher plants Higher plants Higher plants Higher plants
Animals and Fungi
《圖 1-2》 (氧化)鯊烯酵素家族在不同物種間的產物專一性與多樣性
這些環化產物為固醇類生合成的前驅物《圖1-3》。固醇類（sterols） 是多環脂醇類物質的通稱，其組成通常是以四至六個環作為其結構的中心 骨架，並含有一個長短不一且經由不同官能基修飾之側鏈，同時在其C-3位 置上會有一羥基者稱之。自然界的固醇類普遍存在於動、植物與真菌中，
3 在大多數的真核細胞中，固醇類物質扮演著細胞膜組成及生理調控的重要 角色2。 Acetyl-CoA CoA-SH thilase Acetoacetyl-CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA HMG-CoA synthase CoA-SH Acetyl-CoA
HMG-CoA reductase 2NADPH+2H
+ CoA-SH+2NADP+ Mevalonate 2 Isoprenoid intermediate Squalene (3S)-2,3-Oxidosqualene O SHC Bacteria Hopene HO Lanosterol HO Cycloartenol HO β-Amyrin HO H H H H HO H β-Sitosterol (membrane sterol) H HO H H Ergosterol (membrane sterol) Cholesterol (membrane sterol) O O HO HO H H H H H OH OH Brassinolide (phytonormone) CAS OSLC βAS Dolichol HemeA Ubiquinone Isopentenyl tRNA Fungi Animal Plants Plants Plants 《圖 1-3》動物、真菌和植物體內固醇類的生合成步驟 在動物體內，最常見的固醇類物質以膽固醇（cholesterol）最為重要， 其主要由肝臟製造產生，其次是在腎上腺皮質及動脈管壁上生成，同時也 可經由食物攝取而獲得3,4。由於膽固醇是細胞膜脂質筏（lipid raft）的組成 成分—脂質筏是指細胞膜中的一塊固性區域，當其比例增加時，細胞膜的 流動性尌降低—因此可以藉此調控細胞膜的流動性，進而影響細胞膜內外 物質的滲透4。許多文獻的研究也指出，脂質筏可能與訊息傳遞、發炎反應、 細胞移動（migration）、神經傳導等反應有關，如：阿茲海默症（Alzheimer’s
4 disease）等。此外，膽固醇亦可藉此調控細胞膜上之蛋白質，使其進行訊息 傳遞、代謝反應與催化等作用5。膽固醇也是膽汁、維生素D 3、紅血球與其 它五種固醇類激素的重要前驅物。五種固醇類激素包括：糖皮質固醇 （Glucocorticoids）中的皮質醇（Cortisol）、礦物皮質固醇（Mineralocorticoids） 中的醛固酮（Aldosterone）、雄性激素（Androgens）、雌激素（Estrogens） 與黃體酮（Progestins）。人體也可利用膽固醇，自行合成脂溶性維生素D， 而維生素D是一種具有激素功能的固醇，會影響鈣質吸收，進而造成血鈣與 骨鈣的回饋循環平衡，並刺激基因表現與增加骨質的密度。而在酵母菌的 實驗也發現，部份具特定結構的固醇類，以及其相對應的激素，對於細胞 分裂中增生週期的調控，有密切的相關性。 目前最常使用的降膽固醇藥物為施德丁（statin）類化合物，其為羥甲 基戊二醯輔酶還原酵素（HMG-CoA reductase）的抑制劑《圖1-4》。羥甲 基戊二醯輔酶位於固醇類生合成步驟的上游，在抑制固醇類的同時，也抑 制其中游產物異戊二烯的生成，進而影響具有重要功能的二級代謝物的生 成及調節。反觀氧化鯊烯環化酵素，其位於整個反應的中下游，若以此處 作為研發抑制物的研究標的，對於身體的負作用理論上會相對降低，故近 年來針對氧化鯊烯環化酵素進行抑制劑的合成，已成為研發降低膽固醇或 是抗黴菌的新目標。 O H O HO O O Lovastatin O H HO OH COOH O HO Pravastatin N COOH OH F HO Fluvastatin 《圖 1-4》降膽固醇藥物﹕Lovastatin、Pravastatin、Fluvastatin 結構
5
1.2 氧化鯊烯酵素環化機制
除了環化產物的重要生理功能外，氧化鯊烯環化酵素的催化機制更是 近半世紀以來，生物化學家及化學家公認最迷人且最具挑戰性的生化反應 之一。隨著羊毛硬脂醇（lanosterol）的結構鑑定完成，Woodward 和 Bloch 等人推論其反應前驅物為鯊烯6。但 Corey 與 Bloch 證明在哺乳類中，其 氧化鯊烯環化酵素合成羊毛硬脂醇的反應受質是 2,3-氧化鯊烯而非鯊烯7。 Barton 則更進一步証明真核生物是利用 3(S)-2,3-氧化鯊烯做為其環化的反 應受質，而非 3(R) 的鏡像異構物8,9。接下來，一系列以化學合成受質類似 物(analog)或是抑制劑對於酵素所進行的研究，在酵素機制研究領域上，提 供許多有利的證據。這些證據不只用來解釋受質結構的必需性，也可以說 明受質在酵素活性區內的幾何構形。 目前，對於氧化鯊烯環化酵素催化機制的了解，包含了16個鍵的斷裂 與生成，可分為下列幾個部分：（1）受質與酵素間結合，並摺疊成適當構 形；（2）環化酵素中的酸性氨基酸提供質子，使得親核性的雙鍵(在鯊烯結 構中)或是環氧基(在氧化鯊烯中)藉由其親核性作用而開環，並伴隨著鄰近 雙鍵的斷裂，使得A環同時環化；（3）具有立體選擇性的環化；（4）甲基 和氫化基(hydride)的重排重組反應，生成帶有正電荷的高能碳陽離子中間產 物；（5）最後，經由去質子化而形成雙鍵，或是藉由水分子的作用以提供 氫氧基團形成雙醇類產物而終止反應《圖1-5》。6 (3S)-2,3-Oxidosqualene O HO Lanosterol Enz-AH HO H H H H B HO H H H Protosteryl Cation Initiation
(Oxirane-ring Openimg and A-ring Formation)
Cyclization (B/C/D-ring formation) Rearrangement (H17α→20α, H13α→17α, Me14β→13β, Me8α→14α) HO H HO H H Cholesterol Termination
Another 18 enzymatic reactions
OSC OSC OSC 《圖 1-5》氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之環化機制 1.2.1 受質的摺疊 1970年，Robinson發現酵素必須將受質先折疊成環化產物結構的相似位 置才可進行催化反應10。鯊烯在其環化酵素的活性區域中，皆依全椅形的形 式（all-chairform）摺疊；而氧化鯊烯在不同物種的氧化鯊烯環化酵素活性 區域中，經由環化酵素上氨基酸殘基的誘導，則會有兩種受質摺疊方式， 其 分 別 為 椅 形 - 船 形 - 椅 形 （ chair-boat-chair ） 與 椅 形 - 椅 形 - 椅 形 （chair-chair-chair）。正因為摺疊方式的不同，而造成了立體構形相異的反 應機制，再經質子化及一連串的雙鍵電子轉移後，會生成二種在 C-20 上 帶有正電荷的中間產物：（1）經由 chair-boat-chair 骨架摺疊生成的原脂醇 碳 陽 離 子 中 間 物 （ Protosteryl Cation intermediates ） ； （ 2 ） 經 由 chair-chair-chair 骨架摺疊形成達瑪烯碳陽離子中間物（Dammarenyl Cation intermediates）。其中，原脂醇碳陽離子中間物經過不同的甲基與氫化基的 轉移等骨架重排作用後，會在不同位置進行脫氫反應，或是藉由水分子作 用 來 終 止 反 應 ， 形 成 環 阿 屯 醇 、 羊 毛 硬 脂 醇 和 南 瓜 子 雙 烯 脂 醇 （cucurbitidienol）等產物；而達瑪烯碳陽離子中間物在不同酵素中則可以
7 O O O HO HO (3S)-2,3-Oxidosqualene chair -chair - chair Enz-AH Enz-AH
Protosteryl Cation Dammarenyl Cation
chair -boat -chair HO HO Lanosterol Cycloartenol Higher plants HO HO Dammaradienol Lupenol Higher plants HO β-Amyrin HO -Amyrin Animals/Fungi
Cyclization catalyzed by Oxidosqualene cyclases
被繼續誘導環化而形成 6-6-6-6-5 及 6-6-6-6-6 五環結構的碳陽離子中間 物 ， 接 著 再 經 由 類 似 的 骨 架 重 排 與 脫 氫 作 用 而 生 成 達 瑪 雙 烯 醇 （dammaradienol）、羽扇醇、α-香桂素及 ß-香桂素等《圖1-6》11-13。 《圖 1-6》 氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物 1.2.2 環氧基開環和 A 環的形成 整個環化反應起始於親核性環氧基的活化開環。在先前的研究中指出， 若將鯊烯置於中性或是弱酸的溶液中，在室溫下可穩定地存放一天，因此 強酸被認為是促使環氧基活化開環所必需的14。1997 年，Corey 等人利用
一 系 列 的 丙 氨 酸 定 點 突 變 式 掃 瞄 法 （ Alanine scanning site-directed mutagenesis），針對酵母菌中 ERG7 的活性區域內高度保留性的胺基酸進 行實驗，實驗結果顯示酵母菌 ERG7 中的 His146、His234 與 Asp456 位
置在催化機制上扮演十分重要的角色15,16。這些研究認為 ERG7 在催化環
8
而提供質子促使環氧基質子化而開環《圖1-7a》17。同樣地，在人類氧化鯊
烯-羊毛硬脂醇環化酵素的 X-ray 結晶結構上也發現，Cys456 和 Cys533 兩者皆以氫鍵與 Asp455 連結，可藉此增強 Asp455 的酸性，使其更容易 釋出氫離子去誘導環氧基的質子化開環，同時 Asp455 還可透過與水分子 及 Glu459 的羧酸基團作用，或是藉由最後脫氫步驟的質子轉移而再質子 化《圖1-7b》18。 《圖 1-7》a. 酵母菌 ERG7 假設開環環化機制17 ；b. 人類 OSLC 開環環化機制18 E. J. Corey 等 人 在 1997 年 以 化 學 反 應 證 明 ， 不 具 有 鄰 助 作 用 (anchimeric assistance)的受質難以在化學反應中被質子化；而在具有鄰助作 用的受質中，又以親核性較強的烯烴對於C-O斷裂的幫助較大《圖1-8》14。 根據以上反應速率觀察結果推論，環化反應的起始不只需要有酸性基團在 適當的位置提供質子，還需要受質在適當的摺疊方式下，使其環氧基上的 C-O 鍵的斷裂，並伴隨著鄰近 C-C 雙鍵的斷裂，同時形成A環。此外，以 帶有 α-C2 甲基修飾的氧化鯊烯類似物為受質的實驗結果也發現，A環形成 的速率甚至比 C2-C3 單鍵旋轉速率還快《圖1-9》。近年來理論計算的結 果也都認同在經由質子化開環反應後，會引起A環的環化形成，因此這兩個 步驟到目前為止被認為是同步發生的14,19-21。
9 O O SiMe3 O 3.3×10-7 s-1 k1 1.74×10-5 s-1 HO ClCH2CO2 OH O + + 77% 17% 6% ClCH2CO2 HO OH 52% 48% k1 3.0×10-7 s-1 HO + 《圖 1-8》鄰助作用幫助環氧基質子化開環14 O R HO H H R H 0xidosqualene cyclase R=Et, CH2OH,CH=CH2 《圖 1-9》環化形成 A 環速率大於 C2-C3 單鍵旋轉速率 1.2.3 環化過程和受質穩定之假說 早期在環化機制尚不清楚時，Matsuda 等人在研究B環形成時發現，酵 母菌 ERG7 內的氨基酸 Val454 位置具有高度的保留性。同樣的，對應到 植 物 CAS 的 Ile481 位 置 亦 然 。 所 以 他 們 利 用 分 子 生 物 學 的 方 式 將 Val454 突變成同為疏水性氨基酸的 Phe、Leu 與 Ile，還有立體空間較為 簡單的 Ala 與 Gly 。實驗的結果顯示在 Ala 與 Gly 的突變中，會得到單 環的產物，所以他們認為 Val454 會藉由其立體空間較大的側鏈來幫助B環
的形成22。在 2004 年所發表的人類 OSLC 結晶結構中，Thoma 等人指出
幾個具有高度保留性的氨基酸位置，其中 Trp387、Phe444 與 Trp58 會利 用其含有苯環的側鏈，並透過碳陽離子與π電子共振交互作用來穩定形成A 環與B環時所產生的 C-6 和 C-10 的碳陽離子中間產物。然而，在酵母菌
10 ERG7 的 Phe445 定點突變實驗裡，卻得到了一個 6-6-5 三環與三個在不 同位置去質子化的 6-6-6-5 四環產物。這也證明了在酵母菌 ERG7 中， Phe445 會影響在C環形成時的 C-14 碳陽離子中間物與最後在 C-8/C-9 的去質子化步驟23。另外，在B環形成時，針對能量較不傾向的船形結構方 面，Thoma 認為 Tyr98 利用其立體空間較大的側鏈幫助推動氧化鯊烯 C-10 上的甲基到分子平面之下，而進一步地阻礙B環形成能量較傾向的椅 形構形《圖1-10》24。不過在酵母菌 ERG7 氨基酸 Tyr99 位置的飽和定點 突變實驗結果中，Tyr99 已被證實其與 C-14 碳陽離子的穩定有關，在此 位 置 進 行 突 變 則 會 得 到(13αH)-isomalabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol 、 (13αH)-isomalabarica- 14Z,17E,21–trien-3β-ol 與羊毛硬脂醇等相關產物25。 《圖 1-10》Trp387、Phe444 與 Trp581 能穩定 A 環與 B 環形成時 C-6、C-10- 碳陽 離中間物；Tyr98 的側鏈藉由立體空間障礙促使 B 環形成能量較不傾向的船形結構24 另外在 1995 年，Corey 等人在以 20-oxaoxidosqualene 取代氧化鯊烯 作為受質的實驗中，發現除了 6-6-6-5 的四環產物以外還有 6-6-5 的三環 系統產物。所以他們藉此結果推測，在 C 環形成的過程中會先形成五圓環， 再經由擴環反應而成為六圓環《圖 1-11》26,27。另一方面，利用電腦模擬所
11 作的理論能量計算方面，也認為 C 環的環化過程會先形成五圓環再行擴環 作用成為六圓環21；Hess 則從他的計算結果認為 6-6-5 的三環碳陽離子中 間物為環化過程中的第一個中間物，之後 C 環的擴環與 D 環的環化得以同 時發生，因此他們認為環化作用並不是像先前所認為的會先形成六圓環的 C 環再行擴環作用而產生《圖 1-12》19,20。另外 Gao 在其以 SHC 為受質的 理論計算的研究中，則是認為在整個環化過程中只會生成單環與雙環的碳 陽離子中間物，其 C、D 與 E 環都是同時形成的28。 《圖 1-11》利用類似物作為受質結果顯示 C 環會先形成五圓環27 《圖 1-12》Hess 認為 C 環與 D 環會經由過渡態 10 同時形成29
12 氨基酸側鏈上所富含π電子的特性，來穩定形成C環時依反-馬可尼可夫 （anti-Markovnikov）法則所產生的二級碳陽離子，並且可以利用碳陽離子 與 π 電子的共振作用來穩定帶有正電荷的高能 C-20 碳陽離子中間物。然 而在酵母菌 ERG7 氨基酸 Phe699 位置的定點突變實驗中，除了三環產物 外，還發現了在不同位置脫氫的產物，這結果顯示 Phe699 也會對 C-17 碳 陽離子有所影響30,31。在香桂素合成酵素中，環化五圓環D環所形成的達瑪 烯碳陽離子中間物後，可經擴環作用產生 baccharenyl cation，甚至進一步 環化形成E環；但在氧化鯊烯羊毛硬脂醇酵素和環阿屯醇酵素中，一連串的 環化步驟會終止在五圓環的D環所形成的 C-20 原脂醇碳陽離子，這是因為 其缺少像鯊烯環化酵素中 Trp169 與 Phe605 的芳香族性官能基，因此無 法藉由其π電子來穩定 C-17 二級碳陽離子中間物，而能更進一步的環化形 成E環《圖1-13》。
14
目前，有兩種假說解釋酵素如何穩定環化步驟中產生的許多高能量碳 陽離子中間物。1987 年，Johnson 提出了第一個理論模型（Johnson Model）
《圖 1-14》，在這個模型中 Johnson 認為酵素會利用其具相位選擇性（facing
selective）的負電荷來穩定過渡狀態（transition state）的正電高能量的碳陽
離子32,33。
《圖 1-14》Johnson 提出的理論模型 Johnson Model 32,33
另外，在 1992 年 Griffin 提出了另一個 Aromatic Hypothesis 理論模
組34《圖1-15》。由於在氧化鯊烯環化酵素中，具有芳香族基團的氨基酸 Tyr、
Trp 與 Phe 在各物種中皆具有高度保留性，因此 Griffin 認為這些基團會 利用其碳陽離子與π電子作用（cation-π interaction）的穩定效應，來引導受 質進行適當的骨架摺疊並且穩定具有高能量且帶正電的中間產物，使其之 後的甲基與氫化基可以做適當的轉移重排。
15 1.2.4 骨架重排與脫氫反應 酵素活性區內的許多具有高度π電子性質的芳香族氨基酸，可以透過碳 陽離子與其π電子的共振作用來穩定甲基與氫化基的轉移重排，以利最後的 脫氫終止反應。整個骨架重排過程結束之後，在人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇 環化酵素中具有高度保留性的氨基酸 His232（其對應到酵母菌 ERG7 為 His234），由於其鹼性殘基十分靠近 C-8/C-9 碳陽離子，所以被認為是最 能夠接受質子，並進而終止整個環化機制的關鍵氨基酸位置。另外，His232 除了會透過鄰近的水分子的交互作用去影響催化反應的進行外，還會與其 附近的 Tyr503 之側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯，使得 His232 得以 位於脫氫反應的最佳位置《圖1-16》24。
此外，在酵母菌 ERG7 中對於 His234 與 Tyr510 的飽和定點突變的 實驗結果也更進一步的證明了這兩個氨基酸在活性區域內所具有的功能。 在酵母菌 ERG7 中針對 His234 定點突變的產物分析上發現了許多在不同 地 方 進 行 脫 氫 反 應 的 四 環 產 物 如 protosta-20,24-dien-3β-ol 、
protosta-12,24-diene-3β-ol 還有 parkeol 35,36。另外，在 Tyr510 突變成 Ala
的突變點中也發現了 parkeol37,38。綜合以上結果，更加證明了 His234 在酵
母菌 ERG7 活性區域中的功能，除了利用碳陽離子與π電子的共振作用穩 定甲基與氫化基的骨架重排以外，也會幫助酵素在正確的位置上進行脫氫
16 《圖 1-16》氧化鯊烯環化酵素及其產物 -羊毛硬脂醇形成複合物的結構圖。圖中 所顯示的胺基酸基團為距離產物在 5Å 內的位置，水分子只有在 Asp456 及 His232 附近被觀察到24 環阿屯醇環化酵素和氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素環化機制的差別， 只是在進行到最後一步的去質子化步驟時，氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素會 催化 C-19 上的氫行脫除反應而生成環阿屯醇，而氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素則催化 C-8 上的氫脫除而生成羊毛硬脂醇。從熱力學的觀點來看， 環阿屯醇比羊毛硬脂醇不穩定，所以學者認為環阿屯醇環化酵素之所以可 以將產物環化成為能量較不趨向的環阿屯醇，可能是因為酵素裡某些特定 胺基酸的影響而導致環阿屯醇的生成。先前對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素 （AthCAS1）的突變實驗中也發現， Tyr410、His477 與 Ile481 在各物種 的環阿屯醇環化酵素中皆具有高度保留的特性，但是在 ERG7 中則分別以
Thr、Cys、Gln 及 Val 的形式存在《圖 1-17》39。將這些胺基酸進行定點
突變實驗的結果證實，產生羊毛硬脂醇效率最好的突變株為雙定點突變株
AthCAS1H477N/I481V《表 1-1》40。Suzuki 等人在 2006 年時發表了植物羊毛 硬脂醇的合成酵素，他們從阿拉伯芥中發現基因 At3g45130 可以在植物中
17
合成羊毛硬脂醇，最後命名為 LAS（lanosterol synthesis）41。有趣的是從序
列比對中可以發現， LAS 在相對應的 CAS 氨基酸 His477 與 I481 位置 分別被換成 Asn 與 Val，這與上述 CAS 的雙定點突變實驗結果不謀而合， 也顯示了這兩個氨基酸對於羊毛硬脂醇合成的重要性。
《圖 1-17》Tyr410（◆）、 His477（＊）與 Ile481（▼）在 CAS1 高度保留，而在 ERG7
中則被 Thr、Cys、Gln 或是 Val 所取代39
18
1.3 (氧化)鯊烯環化酵素氨基酸序列比對
以生物演化的觀點來看，若在不同物種間皆保留相同之氨基酸序列， 則此氨基酸可能對於酵素催化活性具備重要的功能且不可或缺；反之，較 不重要的氨基酸則會隨物種的需要而產生變異或者根本被剃除掉，但這些 差異極有可能是導致不同酵素間功能變異之關鍵。隨著研究的進行，有越 來越多同源且功能相近的蛋白質氨基酸相繼被定序完成，為了從已知結果 中探求進一步的資訊，因此我們採用 Clustal W 程式對於：H. sapiens ERG7: P48449、S. cerevisiae ERG7: P38604、A. thaliana CAS: NP_178722、A.acidocaldarius SHC: BAA25185 和 P. sativum βAS: BAA97558 進行氨基酸
序列比對，藉此方法得知在不同物種間三萜類環化酵素彼此間的相同性 (identity)及相似性( homology) ，因而得以再進一步的探討酵素在結構上與 功能上的相關性。
H.sapiens ERG7 MTEGTCLRRRGGPYKTEPATDLG--RWRLN-CERGRQTWTYLQDER---AGREQT 49
S.cerevisiae ERG7 MTEFYSDTIG---LPKTDPR--LWRLRTDELGRESWEYLTPQQ---AANDPP 44
A.thaliana CAS MWKLKIAEGGS-PWLRTTNNHVGRQFWEFDPNLGTPEDLAAVEEARKSFSDNRFVQKHSA 59
P.sativum βAS MWRLKIAEGGNDPYLFSTNNFVGRQTWEYDPEAGSEEERAQVEEARRNFYNNRFEVKPCG 60
A.acidocaldarius SHC ---
H.sapiens ERG7 GLEAYALGLDTKNYFKDLPKAH---TAFEGALN----GMTFYVGLQAED-GHWTGDY 98
S.cerevisiae ERG7 STFTQWLLQDPK-FPQPHPERNKHSPDFSAFDACHN----GASFFKLLQEPDSGIFPCQY 99
A.thaliana CAS DLLMRLQFSRENLISPVLPQVKIEDTDDVTEEMVETTLKRGLDFYSTIQAHD-GHWPGDY 118
P.sativum βAS DLLWRFQVLRENNFKQTIGGVKIEDEEEITYEKTTTTLRRGTHHLATLQTSD-GHWPAQI 119
A.acidocaldarius SHC ---MAEQLVEAPAYARTLDRAV---EYLLSCQKDE-GYWWGPL 36
H.sapiens ERG7 GGPLFLLPGLLITCHVAR---IPLPAGYREEIVRYLRSVQLP-DGGWGLHIEDKSTVFGT 154
S.cerevisiae ERG7 KGPMFMTIGYVAVNYIAG---IEIPEHERIELIRYIVNTAHPVDGGWGLHSVDKSTVFGT 156
A.thaliana CAS GGPMFLLPGLIITLSITGALNTVLSEQHKQEMRRYLYNHQNE-DGGWGLHIEGPSTMFGS 177
P.sativum βAS AGPLFFMPPLVFCVYITGHLDSVFPPEHRKEILRYIYCHQNE-DGGWGLHIEGHSTMFCT 178
19
H.sapiens ERG7 ALNYVSLRILGVGPDDP---DLVRARNILHKKGGAVAIPSWGKFWLAVLNVYSWEGLNTL 211
S.cerevisiae ERG7 VLNYVILRLLGLPKDHP---VCAKARSTLLRLGGAIGSPHWGKIWLSALNLYKWEGVNPA 213
A.thaliana CAS VLNYVTLRLLGEGPNDG-DGDMEKGRDWILNHGGATNITSWGKMWLSVLGAFEWSGNNPL 236
P.sativum βAS ALNYICMRILGEGPDGGEDNACVRARNWIRQHGGVTHIPSWGKTWLSILGVFDWLGSNPM 238
A.acidocaldarius SHC IEAYVALKYIGMSRDEE---PMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMV 148
H.sapiens ERG7 FPEMWLFPDWAPAHPSTLWCHCRQVYLPMSYCYAVRLSAAEDPLVQSLRQELYVEDFASI 271
S.cerevisiae ERG7 PPETWLLPYSLPMHPGRWWVHTRGVYIPVSYLSLVKFSCPMTPLLEELRNEIYTKPFDKI 273
A.thaliana CAS PPEIWLLPYFLPIHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGKRFVGPITSTVLSLRKELFTVPYHEV 296
P.sativum βAS PPEFWILPSFLPMHPAKMWCYCRLVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQLREELHTEPYEKI 298
A.acidocaldarius SHC PPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVP--ELYETDVPPR 206
H.sapiens ERG7 DWLAQRNNVAPDELYTPHSWLLRVVYALLNLYEHHHS---AHLRQRAVQKLYEHIVA 325
S.cerevisiae ERG7 NFSKNRNTVCGVDLYYPHSTTLNIANSLVVFYEKYLRN---RFIYSLSKKKVYDLIKT 328
A.thaliana CAS NWNEARNLCAKEDLYYPHPLVQDILWASLHKIVEPVLMRWPG-ANLREKAIRTAIEHIHY 355
P.sativum βAS NWTKTRHLCAKEDIYYPHPLIQDLIWDSLYIFTEPLLTRWPFNKLVRKRALEVTMKHIHY 358
A.acidocaldarius SHC RRGAKGG---GGWIFDALDRALHGYQKLSVHP---FRRAAEIRALDWLLE 250
H.sapiens ERG7 DDRFTKSISIGPISKTINMLVRWYVDGPASTAFQEHVSRIPDYLWMGLDGMKMQGTNGSQ 385
S.cerevisiae ERG7 ELQNTDSLCIAPVNQAFCALVTLIEEGVDSEAFQRLQYRFKDALFHGPQGMTIMGTNGVQ 388
A.thaliana CAS EDENTRYICIGPVNKVLNMLCCWVED-PNSEAFKLHLPRIHDFLWLAEDGMKMQGYNGSQ 414
P.sativum βAS EDENSRYLTIGCVEKVLCMLACWVED-PNGDAFKKHIARVPDYLWISEDGMTMQSF-GSQ 416
A.acidocaldarius SHC RQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISP 310
H.sapiens ERG7 IWDTAFAIQALLEAGGHHRPEFSSCLQKAHEFLRLSQVP-DNPPDYQKYYRQMRKGGFSF 444
S.cerevisiae ERG7 TWDCAFAIQYFFVAGLAERPEFYNTIVSAYKFLCHAQF---DTECVPGSYRDKRKGAWGF 445
A.thaliana CAS LWDTGFAIQAILATNLVE--EYGPVLEKAHSFVKNSQVLEDCPGDLNYWYRHISKGAWPF 472
P.sativum βAS EWDAGFAVQALLATNLIE--EIKPALAKGHDFIKKSQVTENPSGDFKSMHRHISKGSWTF 474
A.acidocaldarius SHC VWDTGLAVLALRAAGLPAD---HDRLVKAGEWLLDRQIT--VPGDWAVKRPNLKPGGFAF 365
H.sapiens ERG7 STLDCGWIVSDCTAEALKAVLLLQEK--CPHVTEHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD----G 498
S.cerevisiae ERG7 STKTQGYTVADCTAEAIKAIIMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSFEYG 505
A.thaliana CAS STADHGWPISDCTAEGLKAALLLSKVP-KAIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD----G 527
P.sativum βAS SDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSLLP-PEIVGEKMEPERLFDSVNLLLSLQSKK----G 529
20
H.sapiens ERG7 GFATYETKRGGHLLELLNPSEVFGDIMIDYTYVECTSAVMQALKYFHKRFPEHRAAEIRE 558
S.cerevisiae ERG7 SFATYEKIKAPLAMETLNPAEVFGNIMVEYPYVECTDSSVLGLTYFHKYF-DYRKEEIRT 564
A.thaliana CAS GLATYELTRSYPWLELINPAETFGDIVIDYPYVECTSAAIQALISFRKLYPGHRKKEVDE 587
P.sativum βAS GLAAWEPAGAQEWLELLNPTEFFADIVVEHEYVECTGSAIQALVLFKKLYPGHRKKEIEN 589
A.acidocaldarius SHC GWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFG--EVTDPPSEDVTAHVLECFG---SFGYDDAWK 466
H.sapiens ERG7 TLTQGLEFCRRQQRADGSWEGSWGVCFTYGTWFGLEAFACMGQTYRDGTACAEVSRACDF 618
S.cerevisiae ERG7 RIRIAIEFIKKSQLPDGSWYGSWGICFTYAGMFALEALHTVGETYEN---SSTVRKGCDF 621
A.thaliana CAS CIEKAVKFIESIQAADGSWYGSWAVCFTYGTWFGVKGLVAVGKTLKN---SPHVAKACEF 644
P.sativum βAS FIFNAVRFLEDTQTEDGSWYGNWGVCFTYGSWFALGGLAAAGKTYTN---CAAIRKGVKF 646
A.acidocaldarius SHC VIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREP----YIQKALDW 522
H.sapiens ERG7 LLSRQMADGGWGEDFESCEERRYLQSA--QSQIHNTCWAMMGLMAVRHPDIE--AQERGV 674
S.cerevisiae ERG7 LVSKQMKDGGWGESMKSSELHSYVDSE--KSLVVQTAWALIALLFAEYPNKE--VIDRGI 677
A.thaliana CAS LLSKQQPSGGWGESYLSCQDKVYSNLDGNRSHVVNTAWAMLALIGAGQAEVDRKPLHRAA 704
P.sativum βAS LLTTQREDGGWGESYLSSPKKIYVPLEGNRSNVVHTAWALMGLIHAGQSERDPTPLHRAA 706
A.acidocaldarius SHC VEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKG--ASTPSQTAWALMALIAGGRAESE--AARRGV 578
H.sapiens ERG7 RCLLEKQLPNGDWPQENIAG-VFNKSCAISYTSYRNIFPIWALGRFSQLYPERALAGHP 732
S.cerevisiae ERG7 DLLKNRQEESGEWKFESVEG-VFNHSCAIEYPSYRFLFPIKALGMYSRAYETHTL---- 731
A.thaliana CAS RYLINAQMENGDFPQQEIMG-VFNRNCMITYAAYRNIFPIWALGEYRCQVLLQQGE--- 759
P.sativum βAS KLLINSQLEQGDWPQQEITG-VFMKNCMLHYPMYRDIYPLWALAEYRRRVPLP--- 758
A.acidocaldarius SHC QYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR--- 631
《圖 1-18》H. sapiens ERG7、S. cerevisiae ERG7、A. thaliana CAS、P. sativum βAS 與 A. acidocaldarius SHC 氨基酸序列比對結果 從不同的環化酵素家族其蛋白質序列比對中，可以發現到有些氨基酸 片段在各物種中都被高度保留。其中一段高度保留的氨基酸序列位於酵素 活性區前端，其被認為是調控整個催化反應起始的氨基酸序列，在鯊烯環 化酵素中的序列為 DDTA，而在氧化鯊烯環化酵素中則為 DCTA《圖 1-19》。 另 外 一 段 高 度 保 留 的 氨 基 酸 序 列 稱 為 Q-W 活 性 功 能 區 域 （ Q-W
Motif），其氨基酸序列為 [(K/R)(G/A)X2-3(F/Y/W)(L/I/V)X3QX2-5GXW]。這
21 八次《圖 1-20》。早期學者認為 Q-W Motif 參與在酵素進行環化反應過程 中，因鍵的斷裂與生成所引起的放熱反應以及其焓（enthalpy）釋放有關的 步驟，另外也可能藉由這些功能區域中具有高度保留性的 Tyr 與 Trp，利 用其富含 π 電子軌域的側鏈與高能量的碳陽離子中間物產生碳陽離子與 π 電子的交互作用來穩定這些中間產物，而此推測也符合 Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 的理論模組。
H.sapiens ERG7 STLDCGWIVSDCTAEALKAVLLLQEK--CPHVTEHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD----G 498
S.cerevisiae ERG7 STKTQGYTVADCTAEAIKAIIMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSFEYG 505
A.thaliana CAS STADHGWPISDCTAEGLKAALLLSKVP-KAIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD----G 527
P.sativum βAS SDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSLLP-PEIVGEKMEPERLFDSVNLLLSLQSKK----G 529
A.acidocaldarius SHC QFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPD---ERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSN----G 415 《圖 1-19》不同物種間（氧化）鯊烯環化酵素內負責調控反應起始的胺基酸序列
《圖 1-20》 Q-W Motif 在環化酵素家族內之分佈情形。OSC（H. S.）為 H. sapiens ERG7； OSC（S.c.）為 S. cerevisiae ERG7；SHC（A.a.）為 A. acidocaldarius SHC；CAS（A.t.） 為 A. thaliana CAS
22 然而，在 SHC 的 X-ray 結晶結構被解讀出來後，卻發現到 Q-W Motif 並不是位於酵素的活性區域上，而是位於酵素的表面。這些具有高度保留 性的胺基酸會透過氫鍵與疏水性的交互作用和 α 螺旋結構進行鍵結，而 Wendt 等人也認為酵素是利用這些交互作用來穩定本身的結構，避免被環 化過程中所釋放的能量所破壞。所以 Q-W Motif 近年來已被證實並不全然 與環化機制有關，而認為可能是作為穩定酵素結構的胺基酸。 從序列比對結果發現，酵母菌和人類氧化鯊烯-羊毛脂醇環化酵素及細 菌的 SHC 三者約只有 40% 左右的相似度，但它們在結構、立體選擇性與 催化機制上十分相似。因此學者們認為這些環化酵素家族催化生成高度產 物的特異性主要是由於下列原因所造成的：(1)有嚴格的反應機制。反應受 質必須結合至酵素上正確的受質結合區，以促使受質排列成特殊的結構。(2) 在環化過程中會產生許多具有高能量的碳陽離子中間產物。(3)活性區內的 芳香族氨基酸會利用碳陽離子與 π 電子的交互作用來穩定過渡態的中間產 物，因此可以預防早期環化重組的過程被截斷，以確保產物的順利生成。
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第二章 研究目的
過去近半世紀以來，鯊烯及氧化鯊烯之環化反應機制與其演化方面之課 題，一直是化學家及生化學家極度感興趣的課題。而本實驗室對於這類環 化酵素的研究重點在於：（1）了解其催化氧化鯊烯之環化/重排重組反應之 反應機構，進而對於其催化反應之複雜性以及其反應生成物之多樣性有更 進一步的認識；（2）反應所牽涉到相關酵素之結構與活性關係的了解，有 助於將來設計氧化鯊烯酵素之抑制劑；（3）研究細菌鯊烯環化酵素和動植 物間的氧化鯊烯環化酵素在散開演化（Divergent evolution）的過程中，如 何改變其活性位置胺基酸之結構，以產生具有不同物種專一性之產物。 在蛋白質結構的領域中，常會利用核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）及蛋白質 X-ray 單晶繞射（Protein X-ray Crystallography， X-ray diffraction）解出蛋白質結構。但上述兩種方法皆有所限制，核磁共振 光譜只能夠解出分子量較小的蛋白質；而在進行 X-ray 單晶繞射之前則必 須先純化出一定數量的蛋白質，但是在利用蛋白質進行結晶詴驗時，養晶 的條件往往複雜不易拿捏。而且，我們所研究的酵母菌（Saccharomyce scerevisiae）氧化鯊烯環化酵素是由 ERG7 基因所轉譯出來的膜蛋白，由 2,196 個鹼基對轉譯而生成 731 個氨基酸序列，而其理論蛋白質分子量為 83.7 kDa；阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環化酵素由 759 個 氨基酸所組成，分子量為 86kDa；豌豆（Pisum sativum）中的香桂素合成 酵素由 758 個氨基酸所組成。分子量大加上此酵素與膜結合的特性，因而 造成酵素在純化上十分不易，至今尚未有結晶結構被解析出來，所以無法 利用上述兩種方法來得到氧化鯊烯環化酵素的結構並探討與催化機制間的 關係，也因此在其結構與催化機制方面的了解仍然有限。 隨著 1997 年細菌的鯊烯環化酵素42 與 2004 年人類的氧化鯊烯-羊毛 硬脂醇環化酵素 X-ray 結晶結構的解讀 24，提供了我們更多對酵母菌24 ERG7 的了解，特別是人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的結晶結構。透 過這些資訊我們可以知道，受質在整個環化過程中會經過十幾個鍵的斷裂 與生成，最後經由甲基與氫化基的轉移，然後在不同的地方進行脫氫終止 反應。在環化過程中，酵素活性區域的氨基酸基團扮演著辨識受質與穩定 中間產物等十分重要的功能，所以近年來科學家也針對活性區域內的假設 活性氨基酸進行了許多突變實驗的研究。利用突變的技術研究蛋白質功能 上的變化或影響，已經是蛋白質工程及分子生物技術中一種很常被應用的 方法。突變的方式最常見的有二種，分別為定點突變與隨機突變。定點突 變通常是針對某個特定位置的氨基酸進行取代、刪除或對入，用以探討某 重要區段上特定氨基酸序列所執行的功能。而隨機突變則是對蛋白質上的 氨基酸序列不預設位置做突變，通常會不知道被突變的位置，且突變的量 較大而能建構成一個突變株庫（library），之後再設計篩選方式從中挑選出 所要的突變株。在本實驗中，我們選擇利用定點突變的方式，探討不同物 種間氧化鯊烯環化酵素的催化機制，以及酵素結構與活性的關係，主要研 究目標為： （1） 藉由丙氨酸掃描法（Alanin scaning），將香桂素合成酵素（PsaβAS） 和環阿屯醇合成酵素（AthCAS）中其假設活性區域的特定氨基酸位置，以 人為方式進行分子演化，使其突變成丙氨酸，再藉由對突變株的產物分析， 進一步探討環化酵素活性區其結構與催化機制的相關性，並闡明活性區域 的殘基各自在催化機制上所扮演的角色。透過突變株產物圖譜與比例的建 構，我們得以探討產物專一性與多樣性的關係，並希望能更進一步地了解 環化酵素家族彼此間的演化性及催化反應上的差異。 （2） 利用飽和突變技術，將酵母菌氧化鯊烯環化酵素活性區中的 Cys457 突變成另外十九種氨基酸，並且對其進行突變產物分析，再利用電腦模擬 方式，觀察突變過後周圍重要氨基酸的相對應位置是否有改變，更細部探 討在催化上這些突變殘基對環化機制的影響，以及 Cys457 所扮演的角色。
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第三章 實驗方法
實驗策略流程
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3.1 重組質體的建構
利用 Stratagene 公司所出品的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互補引子。再以含有正 常 功 能 的 野 生 型 pRS314 PSY 或 pRS314 ERG7 作 為 模 板 ， 利 用 QuikChange PCR Kit 所標示之標準流程《圖 3-2》，建構定點突變之質體。
27 (1) 引子設計: 除了突變之胺基酸位置外(粗體表示)，並在突變點之前後設計一個靜默突變 （Silent mutation，紅色字體表示），藉此增加或減少一個限制酶切位以作 為限制酶鑑定之用。如下表所列： 《表3-1》豌豆 PSY 假設活性區胺基酸定點突變之引子設計
PSY primer name Sequence
CTL-PSY-I119A-ApaⅠ1 5’-CCA gCT CAA gCT gCA ggg CCC CTA TTT TTC-3’ CTL-PSY-F124A-ApaⅠ1 5’-CAA ATT gCA ggg CCC CTA gCT TTC ATg CCT-3’ CTL-PSY-F125A-ApaⅠ1 5’-CAA ATT gCA ggg CCC CTA TTT gCC ATg CCT CCT-3’
CTL-PSY-P128A-StyⅠ1 5’-TTC ATg CCT gCC TTg gTT TTC TgT gTC-3’ CTL-PSY-L180A-NdeⅠ1 5’-gTA CTg CAg CCA ACT ACA TAT gTA TgC gg-3’ CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 5’-CAA CAC ggT ggg GTC ACC CAT ATA gCT TCg Tgg-3’
CTL-PSY-W219A-ClaⅠ1 5’-TAC CTT Cgg Cgg ggA AAA CTT ggC TAT CgA TAC TT-3’ CTL-PSY-W223A-ClaⅠ1 5’-ggg AAA ACT gCg CTA TCg ATA CTT ggT gTg-3’ CTL-PSY-M256A-HincⅡ1 5’-CAg CTA AAg CgT ggT gTT ATT gTC gAC Tgg TAT AC-3’
CTL-PSY-Y259A-HincⅡ1 5’-ATg Tgg TgT gCT TgT CgA CTg gTA TAC ATg-3’ CTL-PSY-V263A-SalⅠ1 5’-ggT gTT ATT gTC gAC Tgg CAT ACA TgC CTA Tg-3’ CTL-PSY-Y264A-SpeⅠ1 5’-gTT ATT gTC gAC TAg TAg CCA TgC CTA Tg-3’ CTL-PSY-G369A-MfeⅠ1 5’-CgA TAC CTT ACA ATT gCC TgT gTg gAA AAg-3’ CTL-PSY-C370A-MfeⅠ1 5’-CgA TAC CTT ACA ATT ggC gCT gTg gAA AAg-3’
《表3-2》酵母菌 ERG7C457X 飽和定點突變之引子設計
YOSC primer name Sequence
CTL-YOSC-C457IKMNRST-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT AN(C/g) ACT gCA gAA g-3’ CTL-YOSC-C457CFLSWY-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT TN(C/g) ACT gCA gAA g-3’ CTL-YOSC-C457HLPQR-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT CN(C/g) ACT gCA gAA g-3’ CTL-YOSC-C457ADEGV-AlwnⅠ1 5’-ggC TAT ACA gTg gCT gAT gN(C/g) ACT gCA gAA g-3’
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（2）QuikChange Site-Directed Mutagenesis
利用 Stratagene 公司的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，按 照《表 3-3》所列之組成條件混合，再以《圖 3-3》所示溫度進行聚合酶連 鎖反應來建構飽和定點突變之質體 DNA，其配對反應（annealing）溫度視 引子的 Tm 值決定。
《表3-3》 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之組成
Reagent Volume (μl) Primer1 (1μg/μl) 0.5 Primer2 (1μg/μl) 0.5 Template 0.5 dNTP (10 mM) 1.6 Pfu II buffer 2 Pfu II polymerase 0.4 DDW 14.5 Total 20
《圖 3-3》 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 反應條件
（3）Dpn I 酵素切除母股 DNA
將 PCR 產物以《表 3-4》之條件放置在水浴槽中於 37℃ 下反應四個 小時，因 DpnΙ 酵素具有截切甲基化 DNA 之特性，因此我們可以用其去 除不含有突變之母股 DNA。
29 《表3-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物之條件 Reagent Volume (μl) PCR products 8 10X NE Buffer 4 1 Dpn I 1 （4）突變質體的放大與酵素鑑定 利用熱導入（Heat shock）進行轉形作用（transformation），使大腸桿 菌吸收重組質體。從 -80℃ 冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取 10 μl 含有突變點之質體 DNA ，並加入 100 μl 的勝任細胞，冰浴 20 分鐘使質 體 DNA 附著於細胞的表面。置於 42℃ 的水浴一分鐘，使細胞表面因熱 產生小孔洞而促使質體 DNA 進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入於 1 ml 的 LB 詴管中，以 37℃、200 rpm 震盪條件培養一小時後，將菌液以 8,000rpm 的條件離心一分鐘並去除上清液，接著在無菌環境下將菌液塗在 LB 培養基，在 37℃ 下培養約 16 小時後，挑取單一菌落培養於 3 ml 的 LB 詴管（含 Ampicillin 100mg/L），於 37℃、200 rpm 震盪條件下培養 12 小時，即可利用 Plasmid Miniprep Purification Kit 抽取放大之質體 DNA。 由於 XLI-Blue 含 tetr 基因，可以抵抗四環素生長，而質體 pRS314 帶有 抗 Ampicillin 的基因，因此可利用 Ampicillin 篩選轉形細胞，只有轉型成 功的細胞可同時在 Amp / LB 培養基及 Tet / LB 培養基生長。 將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依《表 3-5》所示之條件， 與限制酶和特定緩衝液混和，並置於 37℃ 水浴槽中反應四小時，再以 DNA 電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。
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《表3-5》特定限制酶鑑定之材料條件
Reagent Volume (μl) 1 Volume (μl) 2
Plasmid 2 2 10X NE Buffer 1 1 BSA - 1 Enzyme 0.5 0.5 DDW 6.5 5.5 （5）突變質體的定序
將上述經由限制酶鑑定過之含有突變的質體 DNA 以 Sanger Method
（ dideoxynucleotide chain termination ） 進 行 定 序 。 首 先 利 用 BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，以《表 3-6》所示之材料條件進行聚 合酶連鎖反應，各突變質體之引子列於《表 3-7》。反應過後，以酒精沈澱 法取得 DNA，再以 ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
《表3-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
Reagent Volume (μl) Plasmid 2 5X Sequencing Buffer 3 Primer 1 BigDye 3.1 0.8 DDW 13.2
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《表3-7》pRS314 PSY、pRS313 CAS 與 pRS314 ERG7變質體定序引子對照表
PSY mutation Sequence primer CAS mutation Sequence primer
I119A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ2 Y118A CAS-L179A 2 F124A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ2 F123A CAS-L179A 2 F125A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ2 L124A CAS-L179A 2 P128A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ2 G127A CAS-L179A 2 L180A CTL-PSY-P128A-StyⅠ1 L179A Tkp5 Seq2 P217A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ1 T215A CAS-L179A 1 W219A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ1 W217A CAS-L179A 1 W223A CTL-PSY-L180A-NdeⅠ1 W221A CAS-L179A 1 M256A CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 M254A CAS-L179A 1 Y259A CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 H257A CAS-L179A 1 V263A CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 V261A CAS-L179A 1 Y264A CTL-PSY-P217A-BstE Ⅱ1 Y262A CAS-L179A 1 G369A YCC-PSY-W418A-disHind III 1 G366A CAS-W416A 2 C370A YCC-PSY-W418A- disHind III 1 P367A CAS-W416A 2
YOSC mutatin Sequence primer
C457X YTL-OSCW390X-KpnⅠ1
3.2 酵母菌珠 TKW14c2 的電穿孔作用
於 -80℃ 冰箱中取出 TKW14c2 菌株（MATa or MATα ERG7Δ:: LEU2
hem1Δ::G418 ade2-101 his3Δ-200 leu2-Δ1 lys2-801 trp1-Δ63 ura3-52），由於
TKW14c2 不含有 ERG7 基因，且 Heme 基因已被置換掉，因此培養液需 要額外補充 Hemin + Ergosterol + Met （氨基酸 Methionine 在體內的生合 成與 Heme 基因相關，因此當 Heme 基因被置換掉時，Methionine 的生合 成會受影響）。將其接種於 3 ml YNB 溶液中（含有 Amino acid/ Hemin/
Ergosterol/ Glucose），詴管在 30℃ 培養箱中以 200 rpm 條件培養約三天。
32 1 至 1.5 之間，之後將全部菌液在 4℃下以 3,000 rpm 離心十分鐘，去除 上清液後，以經高壓滅菌之二次（20 ml）緩慢沖洗菌體。重複上述離心步 驟後以 20 ml 經高壓滅菌之二次水沖洗菌體。再重複上述離心步驟，倒除 上清液並以 4 ml 經高壓滅菌之冰過的 1M D-sorbitol 溶液緩慢沖洗菌體。 同樣地，再以 3,000 rpm 於 4℃條件下離心十分鐘並倒除上清液。最後加入 50 μl× n（n 為所需轉殖的樣品數目）之 D-sorbitol 溶液。之後取 50 μl 菌 液混和 5 μl 含有突變之質體 DNA，並於 4℃ 下冰浴 5 分鐘。接著將混 合液置入 2 mm 的電穿透玻璃管，設定玻璃管入脈衝控制器條件為 1.5 kV， 200 Ω，25 μF 以進行電穿透作用。在電擊後立刻加入 500 μl 無菌的 1M D-sorbitol 溶液將細胞懸浮混勻，最後取 120 μl 的菌液塗佈在 YNB 培養 基中（含有 Amino acid/ Hemin/ Ergosterol/ Glucose）《表 3-8》，於 30℃ 恆 溫箱中培養三至五天待其菌落生長即可進行功能性補充篩選分析。 《表3-8》因應不同載體(vector)所需之氨基酸添加表
3.3 功能性補充活性篩選
將質體轉植到 TKW14c2 酵母菌中，主要目的是為了利用宿主本身基 因的缺陷，進行麥角固醇補充篩選（Ergosterol supplement）。將先前以電 穿孔方式轉殖入酵母菌 TKW14c2 之菌株培養皿取出，於其上挑取單一菌 落，並依序劃眉於以下兩組培養皿上：Glucose + amino acid + Hemin（實驗 組）與 Glucose + amino acid + Hemin + Ergosterol（對照組）。利用外界補載體（其內源性氨基酸） Amino acid
pRS 313（His） Ade、Lys、Trp、Met、Uracil pRS314（Trp） Ade、Lys、His、Met、Uracil pYES2（Uracil） Ade、Lys、Trp、His、Met
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充麥角固醇與否，得以篩選出哪些突變株會使酵素失去 ERG7 正常的催化 功能，並藉此分析那些突變位置在 ERG7 催化機制上具有重要影響性。
3.4 酵母菌的培養
從麥角固醇補充篩選培養皿上挑取含有突變之菌落，並接種於 3ml 的 YNB 溶液中（含 Glucose/Amino acid/ Hemin/ Ergosterol，若酵素具有酵母 菌 ERG7 活性則不加 Ergosterol），於 37℃、200 rpm 震盪條件下培養約 二至三天。將詴管底部菌體重新懸浮均勻，再把菌液到入 100 ml 無菌之 YNB 培養液，並於同樣環境下培養二至三天。同樣地，將菌體懸浮均勻後 置入 2.5 L 經高壓滅菌過之相同培養液，在 37℃、200 rpm 震盪培養一個 禮拜即可。
3.5 非皂化脂質的萃取
將培養一個星期之酵母菌於 4℃、6,000 rpm 條件下離心十分鐘，再以 15% KOH 與 0.1% Pyrogallol 溶液重新懸浮細胞，接著加入等體積之 95% 酒精，並於 110℃ 下進行兩個小時熱迴流反應。此方法是利用高溫強鹼來 打破酵母菌，並以 Pyrogallol 去除掉可皂化之脂質。之後加入三倍體積之 石油醚萃取非皂化性脂質（NSL），收集有機層後加入無水硫酸鈉以去除水 分並且過濾。接著利用旋轉真空濃縮機乾燥收集產物，等待進行管柱層析。3.6 管柱液相色層分析
本方法是利用矽粉（silica gel）作為管柱中的固相態，另外使用不互溶34 之極性溶液：4% 乙酸乙酯（Ethyl acetate，EA）與 96% 正已烷混合作為 流動相之沖堤液（Eluent），利用幫浦施壓並不斷添加沖堤液，使樣品中的 化合物依極性不同而分佈於兩相之間，再利用 TLC 片將相同 Rf 值之詴管 溶液收集在一起，以迴旋濃縮機濃縮後即可利用 GC-MS（氣相層析與質譜 儀）作進一步分析，詳細步驟如下。 首先將適量矽粉與 100 ml 的正已烷互相混和攪拌均勻後，倒入管柱中 填充管柱並以幫浦壓實緊密。接著將樣品溶於二氯甲烷（CH2Cl2）中，在 不破壞矽粉層表面情況下小心加入管柱中。接著以 4% 乙酸乙酯與 96% 正已烷混合液作為沖堤液，並以幫浦加壓將流出之溶劑依序以詴管收下， 再用 TLC 片將相同 Rf 值之詴管收集，即可以迴旋濃縮機濃縮。
3.7 薄層色層分析
將詴管中的樣品各取 500 μl 於微量小管中，利用真空乾燥機抽乾溶劑。 裁取適當大小之表面附有矽粉的玻璃薄層平版（TLC 片），利用少許二氯 甲烷回溶樣品後，接著以毛細管將樣品點於平版邊緣約 0.7 公分處，為了獲 得最佳之分離效率，這些斑點應該要具有最小之直徑。之後利用 20% 乙酸 乙 酯 混 和 80% 正 已 烷 做 為 展 開 劑 進 行 平 板 展 佈 。 平 板 展 佈 （ Plate Development）是利用流動相載送樣品流經靜相的一種過程；此種過程與液 相層析法的沖提過程是具有相同意義，皆是利用極性不同來分離其中之化 合物。首先，將平板置入一只呈現展佈溶劑之飽和蒸氣態的密閉容器中， 平板一邊浸入展佈溶劑中，但必須小心以避免樣品與展佈劑有直接接觸。 展佈溶劑會藉著在顆粒之間的毛細管作用力，而沿著平板往上移動。當展 佈溶劑到達樣品施用之斑點時，它會溶解樣品，並將樣品往上載送，而樣 品自身則在移動之溶劑與靜相之間進行分佈行為。當展佈劑移動至距離平 板頂端約 0.5 公分時，可將平板從容器中移出，並予以乾燥。最後利用顯色35 溶液會與有機化合物形成深色產物之特性，將平版浸泡於顯色溶液中並置 於加熱版（Hot plate）上加熱顯色，即可利用 TLC 片對分析物進行定位分 析。
3.8 氣相層析-質譜儀（GC-MS）的條件
氣 相 層 析 儀 使 用 Agilent 6890N 型 號 ， 管 柱 選 用 Agilent122-5731 DB-5HT（30 m × 0.25 mm ; 0.1 μm film），注射口氣化溫度設定為 250℃， 以不分流（Splitless）方式進行，氣體供應源為氩氣（He Gas），烘箱（Oven） 條件為起始溫度 50℃，持續 1 分鐘，之後以每分鐘 10℃ 方式上升至最終 溫度 300℃，並持續 8 分鐘，總時間為 34 分鐘，搭配質譜（MS）儀做為 訊號偵測器。MS 使用 Agilent Technologies Model5973MSD 型號，程式設 定為溶劑延遲偵測 7 分鐘，掃描範圍 50~550 Da，質譜離子供應源溫度設 定為 230℃。3.9 突變電腦模擬圖的建構
由於目前 SceERG7、AthCAS 和 PsaPSY 都尚未有結晶結構被解析出 來，所以我們在進行結構分析時，先利用相似度較高的人類氧化鯊烯-羊毛 硬脂醇環化酵素結晶結構作為模版，模擬活性區域氨基酸的相對空間位置。 突 變 的 蛋 白 質 結 構 是 利 用 國 家 高 速 網 路 中 心 的 應 用 程 式 Accelrys Discovery Studio Client 2.5 中 Protein Modeling 底下的 Build homology Modeling 模擬建構，突變過後的分子與含有受質的野生型模板比對過後， 在模擬結構中放入受質，再以國高的程式進行加氫（Apply Force Field）及 能量最小化（Minimization）計算，模擬出當受質存在時酵素的最佳構形。36
