微粒體甲烷單氧化酵素之模型三核銅金屬簇化物之研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. Models of the Particulate Methane Monooxygenase(pMMO): Trinuclear Copper Clusters. 微粒體甲烷單氧化酵素之模型三核銅金屬簇化物之研究. 研究生〆蘇柏瑋指導教授〆陳炳孙博士李位仁博士. 中華民國一○一年七月.

(2) 致謝兩年的時間轉眼間就過去了，能夠完成碩士論文的研究絕對不是一個人可以辦到的，首先要感謝我的指導教授陳炳孙博士，從剛考上師大來到學校與老師面談的那一刻開始，就被老師的熱情打動。在正式加入實驗室後和老師實際相處，老師確實是個熱血的人，對實驗充滿了熱情與信心，所有的問題都會認真的回答與討論，我們也對老師充滿了信任，並且在這兩年內學到了很多。同時也很感謝兩位口試委員俞聖法博士及李位仁博士在百忙之中撥冗參加口試，並且對於我的研究內容給與細心指正與意見，使得研究能夠更趨於完善，在此致上最誠摯謝意。感謝貴儀中心何秋慧助教、林懿雯助教及顏碧秀助教在 NMR、 ESI-MS 及 GC-MS 上的技術指導，時常對我們研究生生活的關心以及走廊上偶遇的談天說地，這些都會變成研究生生活中難忘的回憶。感謝 D403A 的所有快樂的夥伴們，有你們的存在，我才能夠順利的走完這兩年。感謝簡佑芩學姊帶領我們的實驗室，指導我們實驗的技巧，並且對於我的煩惱給予意見。感謝姜博仁學長，和我一樣從高雄大學畢的學長，與大學時代聽過的傳聞一樣親切，在實驗室中帶領我做研究，讓我快速的適應實驗室的生活。感謝藍國峻學長，雖然. I.

(3) 常常睡過頭，但是做事很認真，在實驗室給了我很多的幫助及意見。感謝莊堯舜同學，精打細算管理實驗室的器材，細心的提醒了我實驗室的上錯誤。感謝辜大維同學，不只有著一起做實驗的革命情感，還有共同的興趣，時常分享網路上有趣的情報。感謝游小嬋同學，同一屆同學中唯一的女生，開朗的個性為實驗室帶來活力，有時脫線的表現也為實驗室帶來歡樂，當我怠惰時也會替我打氣給我鼓勵。感謝田耘政同學，D403A 的榮譽會員，是我從小學就認識的好朋友，雖然他是生命科學系的研究生，但卻在我們實驗室用電腦做研究，與我們一起努力，為實驗室添加了人氣。感謝李位仁實驗室的李柏毅同學、鄒毓旂同學及蔡佩真同學在寫論文時與我們不斷的互相鼓勵，感謝朱其翊學弟、周彥甫學弟和林耘瑄學妹在我們實驗室沒有儀器時給予幫助。感謝許貫中實驗室的周宜婷學姊和施志鴻學長，為我們實驗室帶來歡笑。感謝陳興立同學，和我一起考上師大化學所，彼此交換情報互相照顧和鼓勵。感謝國中同學們與高中同學們在我的研究生生活中添加了樂趣與歡笑，並且對我關心和鼓勵。感謝廖偲涵在我寫論文充滿煩躁與不安的夜晚裡打電話來和我聊天，紓解我負面的情緒。感謝室友陳俞廷在宿舍中陪我玩遊戲抒發壓力。最後我要感謝我的家人，有他們在我背後支持我，我才能安心的 II.

(4) 完成我的求學生崖，也因為有家人的支持，我必須要不斷的努力向上才能報答他們對我們的恩情。本文獻給我敬愛的家人，關心我的師長及朋友們，衷心感謝你們對我的關懷及幫助，願與你們分享這分喜悅，即使不是每個人都可以看到這篇謝誌，但這兩年來的回憶與心情會永遠留存在我的心中。. 民國一○一年七月蘇柏瑋於師大化學. III.

(5) 摘要在本篇研究中，我們合成出全新的含氮配位基 7-ImPy 以及 7-MeImPy，能與一價銅離子[CuI(CH3CN)4](BF4)配位形成三核銅簇離子化合物[CuICuICuI(7-ImPy)](BF4) 和 [CuICuICuI(7-MeImPy)](BF4)，本實驗室先前的研究 7-Dipy 類似，可以抓三個銅金屬，形成三核銅金屬簇離子化合物。這類三核銅簇離子化合物能被氧氣活化形成 di(-oxo)的高活性中間物，經由三核銅簇錯化合物的自旋態調控，使其中之一的氧原子被活化至 1D 狀態，此時會釋放出其中一個架橋氧原子，直接崁入烷類分子的 C-H 中，可將烷類轉化為醇類。在本篇研. 究. 中. 成. 功. 利. 用. [CuICuICuI(7-ImPy)](BF4). 和. [CuICuICuI(7-MeImPy)](BF4)兩種系統在常溫常壓下將 cyclohexane (C-H 鍵能為 99.3 kcal/mol) 氧化生成 cyclohexanol 和 cyclohexanone，其中催化變得有選擇性，以 cyclohexanol 為主要產物。在本研究中使用微波合成取代了傳統的加熱方式，微波可以直接進行內部加熱，使合成含氮配位基的時間可以大幅度的縮短，並且增加純度，減少副產物的產生。為了證明我們的三核銅簇離子化合物的反應機構是經由單氧直接嵌入(O-atom insertion)而不是經由自由基反應，在三核銅簇離子化. IV.

(6) 合物 [CuICuICuI(7-ImPy)](BF4) 和 [CuICuICuI(7-MeImPy)](BF4) 的催化反應過程中加入對自由基極為靈敏的化合物 5,5-Dimethyl-Pyrroline-N-Oxide (DMPO)，做室溫 EPR 的測試，發現在整個催化反應的過程中，並沒有偵測到 DMPO 與自由基反應的 EPR 訊號，由此證明了此三核銅簇離子化合物的反應機構是經由單氧直接嵌入而非自由基的反應路徑。. 關鍵字:微粒體甲烷單氧化酵素、三核銅金屬簇化物、催化。. V.

(7) Abstract In this study, two new ligands 7-Impy and 7-MeImpy have been synthesized, and they can coordinate with 3 equivalents of CuI ions to form a trinuclear copper complex [CuICuICuI(7-Impy)](BF4) and [CuICuICuI(7-MeImpy)](BF4). These ligands are similar to our previous developed 7-Dipy ligand in the scaffold to trap three CuI ions. It is known that the hydroxylation of alkane molecules catalyzed by trinuclear copper complexes through the “oxene” insertion mechanism. The active “oxene” with a “1D” spin state will have lower reaction energy barrier when it is tuned by three copper ions. In this study, these new catalysts, [CuICuICuI(7-ImPy)](BF4) and [CuICuICuI(7-MeImPy)](BF4), are also able to catalyze the oxidation of cyclohexane converting to cyclohexanol and cyclohexanone. Compared to our previous developed 7-Dipy ligand, the catalytic reaction is more favorable for the product of cyclohexanol. In this study, we replaced traditional heating by microwave for the ligand synthesis. Microwave can enhance internal heating efficiently, which significantly reduce the reaction time, increase the purity, and reduce the byproducts. In addition, for proving the reaction catalyzed by our trinuclear copper cluster via the O-atom insertion mechanism or radical mechanism, we. designed. a. series. of. experiments. using. 5,5-Dimethyl-Pyrroline-N-Oxide (DMPO), which is very sensitive to radical. We added DMPO in catalytic reaction, and measured EPR while VI.

(8) in the reaction. We found that there are no radical EPR peaks related to DMPO derivatives, similar to the case of 7-Dipy.. Keywords: Particulate methane monooxygenases, Trinuclear copper clusters, Catalysis.. VII.

(9) 目錄致謝............................................................................................................. I 摘要.......................................................................................................... IV Abstract .................................................................................................... VI 目錄........................................................................................................VIII 圖表目錄.................................................................................................... X 附圖目錄............................................................................................... XVI 一前言.......................................................................................................1 二實驗部分.............................................................................................18 2-1 藥品與儀器 .......................................................................................18 2-2 3,3-(1,4-diazepane-1,4-diyl)bis(1-chloropropan -2-ol) 7-Cl 之合成.20 2-3 4-(2-Pyridylmethylaminomethyl)imidazole Impy 之合成 ................21 2-4 MeImpy 之合成 .................................................................................22 2-5 7-Impy 之合成 ...................................................................................23 2-6 7-MeImpy 之合成 ..............................................................................24 2-7 製備 Cu(I) 化合物 ..........................................................................25 2-8 三核銅金屬簇化物之合成 ...............................................................26 2-9 催化產物鑑定 ...................................................................................27 三結果與討論.........................................................................................28 3-1 微波合成 ...........................................................................................28 VIII.

(10) 3-2 三核銅金屬簇離子化合物的形成與氧氣之反應 ...........................31 3-3 三核銅金屬簇離子化合物經氧氣氧化後電子吸收光譜 ...............34 3-4 三核銅金屬簇離子化合物 CV ........................................................37 3-5 三核銅金屬簇離子化合物之催化作用 ...........................................39 3-6 三核銅金屬簇離子化合物催化反應時間追蹤研究 .......................44 3-7 三核銅金屬簇離子化合物與 H2O2 反應時中間物之 EPR 研究 ...47 四結論.....................................................................................................52 五參考資料.............................................................................................53. IX.

(11) 圖表目錄圖 1-1：嗜甲烷菌中的微粒體單氧化酵素 (pMMO) 的 X-ray 晶體結構，主要由三個子單位所組成〆pmoA、pmoB 及 pmoC 々陳長謙院士實驗室推測在微粒體甲烷單氧化酵素的 D site 位置應包含一個三銅的結構，紅色框內則為其推測。8 ...................................4 圖 1-2〆微粒體甲烷單氧化酵素，含有兩個 C-cluster 三核銅，及三個 E-cluster 三核銅，其位置其反應作用圖。12 .............................5 圖 1-3〆三種推測的金屬簇離子化合物(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物。 ..................................6 圖 1-4〆陳長謙院士實驗室對(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物直接將氧原子嵌入甲烷分子的 DFT 計算。9 .8 圖 1-5〆陳長謙院士實驗室對(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物直接將氧原子嵌入甲烷分子之能階 DFT 計算。9 .........8 圖 1-6〆陳長謙院士實驗室對(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物與甲烷進行兩步的自由基反應形成甲醇之能階高低 DFT 計算。9.......................................................................................9. X.

(12) 圖 1-7〆陳長謙院士實驗室對(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物在 300K 下與甲烷反應的 KH/KD 值。9 ...............................................................9 圖 1-8〆Stack 與 Solomon 研究團隊發展出的混價(II ,II , III)三核銅簇錯化物 ..............................................................................................10 圖 1-9〆陳長謙院士實驗室設計出一系列與理論計算符合的三核銅簇離子化合物其配位基結構。 ..........................................................12 圖 1-10〆(a) 陳長謙院士實驗室研究三核銅簇離子化合物[Cu ICu ICu I. (L)](X) ( L=7-Me , 7-Et々X = BF4 , ClO4)與氧氣的反應機制 (b). 陳長謙院士實驗室以 7-Et 當作配位基的氧化受質後所形成的晶體結構[CuIICuII(O)CuII(7-Et) ](X)2 (X = BF4, ClO4)。 ..............13 圖 1-11 : 陳長謙院士實驗室研究的三核銅簇離子化合物改變氧原子電子自旋組態形成“singlet oxene”，並嵌入甲烷分子中的過渡態示意圖。12 ........................................................................................14 圖 1-12〆各種催化環己烷的系統，其選擇性與產率。 ....................16 圖 1-13〆四合銅離子錯化物。 ............................................................16 圖 1-14〆陳長謙院士實驗室設計的 7-Me 和 7-Et 以及本實驗室設計的 7-Dipy 的配位基結構圖。 .........................................................17 XI.

(13) 圖 2-1〆3,3-(1,4-diazepane-1,4-diyl)bis(1-chloropropan-2-ol)之合成。 ...........................................................................................................20 圖 2-2：4-(2-Pyridylmethylaminomethyl)imidazole 之合成。 ...........21 圖 2-3：MeImPy 之合成。 ...................................................................22 圖 2-4：7-ImPy 之合成 .........................................................................23 圖 2-5：7-MeImPy 之合成....................................................................24 圖 3-1〆偶極極化作用(Dipolar polarization)。 ..................................28 圖 3-2〆傳導作用(Ion conduction mechanism)。 ...............................29 圖 3-3〆微波加熱(左圖)與油浴加熱(右圖)之間的問度梯度比較圖。 ...........................................................................................................29 圖 3-4〆[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之形成。 .........................31 圖 3-5〆[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之 ESI-MS 光譜圖。 ......32 圖 3-6〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之形成。....................32 圖 3-7〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之 ESI-MS 光譜圖。 33 圖 3-8〆各系統 UV-Vis 吸收光譜圖，濃度 2×10-3M (a)[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 (b)[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2。 ....................................34 圖 3-9〆各系統 UV-Vis 吸收光譜圖，濃度 10-4M (a)[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 (b)[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2。 ....................................34 圖 3-10〆本實驗室先前研究之 UV-Vis 吸收光譜圖 XII.

(14) (1)[CuIICuII(-O)CuII(7-OH-Me)](BF4) (2)[CuIICuII(-O)CuII(7-OH-Et)](BF4) (3)[CuIICuII(-O)CuII(7-OH-Dipy)](BF4)。.....................................35 圖 3-11〆本實驗室先前研究之 UV-Vis 吸收光譜圖(經稀釋過後) (1)[CuIICuII(-O)CuII(7-OH-Me)](BF4) (2)[CuIICuII(-O)CuII(7-OH-Et)](BF4) (3)[CuIICuII (O) CuII(7-OH-Dipy)](BF4)。 .................................................................35 圖 3-12〆[CuIICuII(O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之 CV 圖，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為-1.5 V 到+1.5 V，掃描速度 50 mV/s。 ...........................................................................................................37 圖 3-13〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之 CV 圖，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為-1.2 V 到+1.5 V，掃描速度 50 mV/s。 ...........................................................................................................38 圖 3-14〆(a)[CuI CuI CuI (7-Impy)]BF4 加入 50 當量 H2O2 氧化 500 當量 cyclohexane 之 GC 層析圖 (b)[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 加入 50 當量 H2O2 氧化 500 當量 cyclohexane 之 GC 層析圖 (c)滯留時間 t = 2.70 min cyclohexanol 的質譜圖 (d)滯留時間 t = 2.79 min cyclohexanol 的質譜圖。 ................................................................40 圖 3-15〆cyclohexanol 及 cyclohexanone 所需之氧化當量示意圖。 ...........................................................................................................41 圖 3-16〆(a)只有加入 7-Impy (b)只有加入 7-MeImpy (c)只有加入 XIII.

(15) [CuICuICuI(CH3CN)4]BF4 (d)沒有 ligand 也沒有 [CuICuICuI(CH3CN)4]BF4。四組實驗皆加入 500 當量 cyclohexane 和 50 當量 H2O2 進行氧化反應 1 小時。 ......................................43 圖 3-17〆[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 在室溫下加入 200 當量 H2O2 催化 500 當量 cyclohexane，反應 5、10、15、30、45、90、180 分鐘的 TON 對時間圖。 ........................................................................44 圖 3-18〆[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 在室溫下加入 200 當量 H2O2 催化 500 當量 cyclohexane，反應 5、10、15、30、45、90、180 分鐘的 TON 對時間圖。 ....................................................................45 圖 3-19〆典型 DMPO 與自由基反應的 EPR 光譜圖。 ....................47 圖 3-20〆(a) [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 加入 200 當量 cyclohexane，50 當量 H2O2，10 當量 DMPO 後，反應 20 分鐘之室溫 EPR 光譜圖 (b) [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 加入 200 當量 cyclohexane，50 當量 H2O2，10 當量 DMPO 後，反應 20 分鐘之室溫 EPR 光譜圖。 ...........................................................................................................48 圖 3-21〆(a)[CuIICuII(-O)CuII(7-impy)](BF4)2 加入，10 當量 DMPO 後之室溫 EPR 光譜 (b)[CuIICuII. -O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 加入，. 10 當量 DMPO 後之室溫 EPR 光譜。 ..........................................49 圖 3-22〆本實驗室先前之研究，室溫下[CuICuICuI(7-Dipy)]BF4 (19 加入 35% H2O2. 和 DMPO (190mmol) 之 EPR XIV.

(16) 光譜圖。 ..........................................................................................50 圖 3-23〆推測[CuICuICuI(7-Impy)]+加入雙氧水後傳遞氧原子催化 cyclohexane 之反應機構圖。 .........................................................51. XV.

(17) 附圖目錄附圖 1: 7-Cl 400MHz 1H NMR ...............................................................57 附圖 2: 7-Cl 400MHz 13C NMR...............................................................58 附圖 3: Impy 400MHz 1H NMR ..............................................................59 附圖 4: Impy 400MHz 13C NMR .............................................................60 附圖 5: MeImpy 400MHz 1H NMR .........................................................61 附圖 6: MeImpy 400MHz 13C NMR ........................................................62 附圖 7: 7-Impy 400MHz 1H NMR ...........................................................63 附圖 8: 7-Impy ESI-MS ...........................................................................64 附圖 9: 7-MeImpy 400MHz 1H NMR......................................................65 附圖 10: 7-MeImpy ESI-MS ....................................................................66. XVI.

(18) 一前言自然界中存在一種細菌，能夠在室溫常壓下將甲烷轉化成甲醇。這種細菌被稱之為嗜甲烷菌。雖然嗜甲烷菌能夠讓此反應自然發生，但是對於化學家來說，將甲烷轉化成甲醇卻是個困難的挑戰，因為甲烷上的 C-H 鍵的鍵能為 104 Kcal/mol，是個惰性的碳氫化合物。甲烷是溫室氣體，其造成溫室效應的效果平均每 100 年約是二氧化碳的 25 倍，甲烷同時也是重要的燃料，被廣泛地運用在我們的生活之中。自然界中，甲烷的來源很多，包括沼澤的沼氣、動植物的自然排放、有機物的分解、海洋中的甲烷水合物以及伴隨著石油開採的天然氣，蘊藏量相當豐富。天然氣中，甲烷的含量占 80%以上，但開採地點大多位於較偏遠的地區，因此儲存與運輸便成為了非常重要的課題。使用天然氣管線直接運輸有著距離上的限制，只能用在中短距離，不能夠跨越海洋。利用高壓將天然氣液化儲存，可使運送距離變得更遠，但是卻需要額外的設備來進行加壓液化及減壓汽化的處理，使得成本提高。早期開採石油時，由於這些天然氣無法帶來利潤，就將天然氣直接燒掉，此作法不僅是浪費資源，更是增加了汙染。較好的做法是將其轉換成燃料或原料再運輸到目的地。BP 石油公司目前利用兩階段的氣體液化技術來達成這個目標，第一階段，將甲烷轉化 1.

(19) 成一氧化碳和氫氣的混合氣體。第二階段，利用 Fisher-Tropsch 合成液態的產品如甲醇。在極度重視環保議題的現在來說，乾淨的能量來源變得相當重要。氫氣是個乾淨的綠色能源，燃燒後只會產生水和氫氣，但卻存在著儲存上的問題，需要特殊的設備來保存，並且有洩漏和爆炸的危隩。甲醇則是容易保存的綠色能源，目前發展中的直接甲醇燃料電池 (DMFC)，可藉由不斷的補充甲醇達到連續使用的目的，並能高效率的轉化成電能，其副產物只有熱、水和少量的二氧化碳。目前的甲醇的來源主要有兩種，第一種是生質能源，使用農作物轉換，需要大面積的土地栽培農作物。第二種是工業上的合成，將甲烷轉化成甲醇，目前石化工業要使用昂貴的過度金屬，並且在高溫高壓下才能完成這個轉化反應，但是自然界中的是甲烷菌卻能在常溫常壓下完成。嗜甲烷菌(Methanotrophic bacteria)，其含有兩種嗜甲烷菌單氧化酵素(Methane monooxygenases,MMO)，分別為微粒體嗜甲烷單氧化酵素 pMMO(particulate metnane monooxygenase)與可溶性甲烷單氧化酵素 sMMO(soluble methane monoxygenases)屬於水溶性蛋白。甲烷單氧化酵素(MMO)對甲烷的 C-H 鍵氧化成甲醇的化學式如下: 4-6. CH4 + NADH + H+ + O2. MMO. 2. CH3OH + NAD+ + H2O.

(20) 可溶性甲烷單氧化酵素(sMMO)為一含雙鐵離子為活性中心的金屬酵素，當雙鐵離子同時具有四價的高氧化態時，將可氧化氧氣分子進而氧化甲烷中的 C-H 鍵，其只能在一些扭曲的嗜甲烷菌中單離出來。微粒體嗜甲烷單氧化酵素(pMMO)為一多銅離子為活性中心的金屬酵素，被發現存在於所有嗜甲烷菌中，因為其活性中心銅離子，並無法像 sMMO 中的雙鐵離子一樣，可以具有四價的高氧化態，因此，在熱力學上被懷疑其不易進行 C-H 鍵的氧化，所以早先也有研究團隊認為其上應具有鐵離子。雖然目前其晶體結構已被解出，也證實是含銅酵素，但其銅離子的數目及其反應機制仍存在爭論，也是催化劑設計的重要關鍵。微粒體嗜甲烷單氧化酵素其晶體結構，由 Amy C. Rosenzweig 實驗室在 2005 年解出。其是一種嵌入膜蛋白 (integral protein)，由 pmoA(~29kDa)、pmoB(~43kDa)、pmoC(~29kDa)三個蛋白質子單元成的錯合體 7。(圖 1-1)分別在 pmoA 中含一單銅金屬離子，pmoB 中則含有一雙核銅金屬中心，此位置被認為是催化甲烷的反應中心，但此處暴露在親水性環境下，如進行甲烷氧化(C-H 鍵能:104 Kcal/mole)成，則可能繼續氧化甲醇(C-H 鍵能: 98 Kcal/mole)，進而繼續氧化甲醛 (C-H 鍵能: 88 Kcal/mole)，接著甚至氧化成二氧化碳(CO2)，而 pmoC 中存在一個單鋅金屬離子。然而因為此晶體的分離與純化過程複雜， 3.

(21) 可能存在著一些爭議，是否裡面的銅金屬數目正確或在純化過程中掉出?其銅離子掉出後是否依然具有活性?. 圖 1-1〆嗜甲烷菌中的微粒體單氧化酵素 (pMMO) 的 X-ray 晶體結構，主要由三個子單位所組成〆pmoA、pmoB 及 pmoC 々陳長謙院士實驗室推測在微粒體甲烷單氧化酵素的 D site 位置應包含一個三銅的結構，紅色框內則為其推測。8. 此外，中研院陳長謙院士實驗室，以氧化還原電位法及 EPR(電子順磁共振光譜儀)，加上理論計算的基礎，推測 pMMO 的酵素中心，應該為具有一三雙核銅簇中心，且應位於 pmoA 子單元的疏水袋 (hydrophobic pocket)中，也就是稱為“D site”的位置。此位置可解釋反應有機物質如甲烷進入，而產物甲醇排出的選擇性特性。根據純化後的微粒體嗜甲烷單氧化酵素 pMMO，已證實其具有多銅離子中心，每單位酵素中約存在著 15 個銅離子 10,11，每三個銅形成 4.

(22) 一三核銅的小單位，共可分成兩個催化的三核銅簇(簡稱 C-cluster)，此兩三核銅簇皆可還原氧分子，但只有其中一三核銅簇扮演著受質 C-H 鍵的氧化反應。其他三個三核銅簇(簡稱 E-cluster)則扮演電子傳遞給反應後的 C-cluster 使其還原，此後才發生甲烷單氧化的反應。(圖 1-2)目前的研究專注在 C-cluster 的三核銅簇的模型設計。. 圖 1-2: 微粒體甲烷單氧化酵素，含有兩個 C-cluster 三核銅，及三個 E-cluster 三核銅，其位置其反應作用圖。12. 微粒體甲烷單氧化酵素(pMMO)，其活性位置，根據推測有三種可能的金屬離子錯化物，分別為(1)bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物、(2)bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物、(3) 混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物。(圖 1-3) 9. 5.

(23) 圖 1-3: 三種推測的金屬簇離子化合物(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物。. 先前的理論計算，已針對此三種金屬簇離子化合物做運算。其中 (1)混價的三核銅金屬簇離子化合物，因具有反鐵磁耦合作用，形成電子基態自旋狀態為 S=0，其與甲烷分子反應的過程會經由一步的反應機構，由單氧直接嵌入 C-H 鍵形成 C-OH 鍵。並經由 DFT(density function theory)的計算，得知其在反應過程經過一活化能為 15.0 Kcal/mol(圖 1-4)。而(2)雙核銅簇金屬離子化合物，跟(1)混價的三核銅金屬簇離子化合物相同，也具有反鐵磁耦合作用，形成電子基態自旋狀態為 S=0，其與甲烷分子反應的過程同樣經由一步的反應機構，由單氧直接嵌入 C-H 鍵形成 C-OH 鍵。並經由 DFT(density function theory)的計算，得知其在反應過程經過一活化能為 20.0 Kcal/mol(圖 1-5)。最後，(3)混價雙核銅金屬簇離子化合物，因混價原因，使其具有與(1) 混價的三核銅金屬簇離子化合物、(2)雙核銅簇金屬離子化合物 6.

(24) 不同的電子基態自旋狀態 S=1/2。所以其反應會經由兩部的自由基反應，第一步先抓甲烷上的氫原子，形成〃O-H 及〃CH3 自由基，接著〃 O-H 及〃CH3 自由基重新鍵結形成產物甲醇。其 DFT(density function theory)的計算，得知其在反應過程經過的速率決定步驟活化能為 19.1 Kcal/mol(圖 1-6)。除此之外，先前的研究也計算過在 300K，經過量子穿隧校應修正後的 kinetic isotope effect(KH/KD)，(1)混價的三核銅金屬簇離子化合物為 4.3，(2)雙核銅簇金屬離子化合物為 3.8，(3)混價雙核銅金屬簇離子化合物為 15.5(圖 1-7)。而 pMMO 對乙烷的催化效果，經量測 KIE=5.2~5.5。由此可知，(1)混價的三核銅金屬簇離子化合物反應所經活化能為最小，其與(2)之 KIE 的理論計算值最接近單氧直接嵌入的過度狀態反應。由上述結果(1)混價的三核銅金屬簇離子化合物相較於其他兩種金屬簇離子化合物而言，將氧原子傳遞至甲烷分子中是較有效率的。. 7.

(25) 圖 1-4: 陳長謙院士實驗室對(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物直接將氧原子嵌入甲烷分子的 DFT 計算。9. 圖 1-5: 陳長謙院士實驗室對(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物直接將氧原子嵌入甲烷分子之能階 DFT 計算。9. 8.

(26) 圖 1-6 : 陳長謙院士實驗室對(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物與甲烷進行兩步的自由基反應形成甲醇之能階高低 DFT 計算。9. 圖 1-7 : 陳長謙院士實驗室對(1) bis(3-oxo)Cu(II)Cu(II)Cu(III)三核銅金屬簇離子化合物(2) bis(-oxo)Cu(III)2 雙核銅金屬簇離子化合物(3)混價的 bis(-oxo)Cu(II)Cu(III)雙核銅離子化合物在 300K 下與甲烷反應的 KH/KD 值。9. 9.

(27) 第一個三核銅簇化物是由 Stack 與 Solomon 研究團隊合成及分析 (圖 1-8)13,14,15。雖然其混價結果與先前計算符合，但其與有機受質反應性不高。根據 parallel mode EPR(電子順磁共振光譜)、MCD(磁原二色光譜儀)及 SQUID(超導量子干涉磁量儀)等磁性分析，發現其電子基態顯示為鐵磁耦合作用 S=1，與先前的理論計算高反應性的三核銅簇化物的反鐵磁耦合不和。由此可知，反應性不只與金屬混價有關，與金屬簇離子錯化合物的電子基態自旋態也密切相關。. 圖 1-8 : Stack 與 Solomon 研究團隊發展出的混價(II ,II , III)三核銅簇錯化物. 而早先由陳長謙實驗室，也設計出一系列與理論計算相符合的三核銅簇離子化合物(其錯化物的配位基如圖 1-9)16。[CuICuICu I(L)](X) ( L= 6 or 7-Me, 6 or 7-Et々X = BF4, ClO4) ，可以和氧氣作用，進而以氧化受質如乙腈(CH3CN)的 C-H 鍵(98 Kcal/mole)，二苯基乙二銅 (Benzil)中的 C-C 鍵(51 Kcal/mole)17，以及 2,3-丁二酮(2,3-Butanedione) 的 C-C 鍵(60 Kcal/mole)。此系列三核銅簇化物，推測其反應的活性 10.

(28) 中間體應與理論計算相類似，可能為一混價 [CuIICuII(O)2CuIII(L)](X)2 (X = BF4, ClO4)，因其活性太高，無法藉由低溫 UV-Vis 光譜偵測捕捉或者獲得其晶體結構。目前只有得到其氧化受質後，形成的三核二價銅錯離子化合物 [CuIICuII(O) CuII(7-Et) ](X)2 (X = BF4, ClO4)的晶體結構(其反應過成推測與晶體結構圖 1-10)。而此三價二酮錯化物，並不具活性，卻可以經有安息香 (benzoin)當作還原劑，使其還原成原本具活性的三核一價銅簇化物 [CuICuICuI(L)](X) ( X = BF4, ClO4)，只是安息香的環環速率緩慢，加上其氧化後形成二苯基乙二酮(benzyl)，其 CC 鍵弱，在氧化反應中會被比受質優先被選擇反應。而在 pMMO 系統中，則可藉由 NADH 或 plastoquinol 迅速將反應過的銅離子還原成最初的還原態，且對銅離子不會有其他反應上的干擾。. 11.

(29) 圖 1-9 : 陳長謙院士實驗室設計出一系列與理論計算符合的三核銅簇離子化合物其配位基結構。. (a). 12.

(30) (b). 圖 1-10 : (a) 陳長謙院士實驗室研究三核銅簇離子化合物[Cu ICu ICu I(L)](X) ( L=7-Me , 7-Et々X = BF4, ClO4)與氧氣的反應機制 (b)陳長謙院士實驗室以 7-Et 當作配位基的氧化受質後所形成的晶體結構[Cu IICu II(O) CuII(7-Et) ](X)2 (X = BF4, ClO4)。. 在先前文獻中對於單氧化酵素催化的羥化反應機制已提出兩種機制。其中一種是經由自由基的反應機制(radical mechanism)，反應時氧氣會先被酵素活化而產生高活性氧原子，此氧原子會去抓取碳氫化合物上的氫原子而形成氫氧(〃O-H)的自由基，甲基自由基(〃CH3) 會與氫氧自由基在鍵結(radical-rebound)，而產生醇類 18,19。經由此機制產生的醇類，其反應後碳原子中心的立體組態，只有一部分會保持原本的立體組態，其他則會改變其立體組態。原因是反應中形成碳原子中心的自由基，氫氧自由基的再鍵結並沒有立體位向的選擇性。在可溶性甲烷單氧化酵素對甲烷的反應中，其產物指有一部分維持原本的立體組態，因此 Baik 等人提出其反應機制是進行自由基反應。 13.

(31) 而近年來，陳長謙實驗室提出另一反應機制，直接單氧嵌入機制 (concerted oxene insertion mechanism)，藉由氧氣進入，形成高氧化態的三核銅的混價 [CuIICuII(O)2CuIII]3 ，首先形成一反鐵磁耦合 (antiferromagnetic)的自旋態離子化合物，並改變氧原子自旋態，使其成為高活性的“singlet oxene”，此高活性“singlet oxene”具有兩個反平行 (antiparallel) 自由電子，易於和受質碳氫鍵中的碳和氫電子配對，而形成 C-O 鍵和 O-H 鍵(圖 1-11)21,22。此種單氧原子直接嵌入 C-H 鍵中的反應機制，可以維持其碳原子中心原本的立體組態. 12,20. ，而. pMMO 系統對於直鏈狀碳氫化合物 (C1-C5) 的羥化反應 (hydroxylation)，也具有高度立體組態選擇性，反應後醇類的立體組態會維持原本的立體組態。. 圖 1-11 : 陳長謙院士實驗室研究的三核銅簇離子化合物改變氧原子電子自旋組態形成“singlet oxene”，並嵌入甲烷分子中的過渡態示意圖。12. 14.

(32) 根據圖 1-11，氧原子被活化至 1D 狀態，是經由三核銅簇離子的自旋態所調控。而第三個銅離子的存在，經由先前 DFT 理論計算發現，在進行 C-H 鍵羥化反應時，能有效降低“singlet oxene”的活化能，使反應容易進行。而本論文中則是設計一系列三核銅離子錯化物，改變其配位基中七環上頂點位置，修飾一可行成氫氧配位的的官能基，藉由改變第三個銅離子的配位環境，可探討上端第三個銅離子在反應中如何調控電子傳遞的角色，以及探討對其在氧化催化反應中如何影響反應活化能，是增加或降低其氧化催化反應的活性。在本論文中，所使用的有機受質主要以環己烷(cyclohexane)為主。環己烷的 C-H 鍵能= 99.3 Kcal/mole，非常接近甲烷的 C-H 鍵能=104 Kcal/mole，而且在室溫下為液體，便於進行處理及實驗上的探討。此外，先前也有許多文獻提到，環己烷氧化後的產物，如環己醇 (cyclohexanol)和環己酮(cyclohexanone)可當作許多藥品製程中的中間物，像是己二醇(adaipic)、耐隆-6,6’(nylon-6,6)、聚醯胺-6(polyamide-6)、合成橡膠(urethanefoams)、與一些潤滑油中的添加劑. 24-27. 。目前市面. 上，杜邦 (Dupont) 公司發展一製程，是利用環烷酸鈷 (III)(Co(III) naphenae)在超過 150℃下，12atm 以上壓力的空氣下，將環己烷氧化。此製程雖然有高達 85%的選擇率(selectivity)，卻只有 4%的轉化率 (conversion) 23。其他文獻中也有使用各種不同氧化劑(oxidizing agent)， 15.

(33) 及過度金屬(transition metal)當催化劑催化劑(圖 1-12)。其中，近年發展出四合銅離子錯化物(圖 1-13) 28,29 其產率可高達 30%，TON 為 233，且也可以重複使用，但需加入適量的 HNO3，否則其產率剩下 0~2%，因其必須加入 HNO3 才能提高產率，使其反應機制變得複雜且不易解釋。在這些催化系統中，含銅金屬離子具有高度的潛力，因銅是地表中蘊藏豐富的金屬元素，並且也是人體中少數金屬元素的含量排行第三，且許多酵素的活性中心位置有存在著銅離子。. 圖 1-12〆各種催化環己烷的系統，其選擇性與產率。. 圖 1-13 :四核銅離子錯化物. 16.

(34) 在本實驗室發展的 7-Dipy 系統中，對環己烷有著良好的催化特性。它的配位基與先前陳長謙實驗室所設計的 7-Me 系統與 7-Et 系統整體骨架相類似，皆是具有七環在其配位基頂端，為一的差異是配位基下具有兩個三配位的 2,2’-bis(pryidlmethyl)amine(圖 1-14)，而 7-Me 系統與 7-Et 系統則是兩配位的配位基。. 圖 1-14〆陳長謙院士實驗室設計的 7-Me 和 7-Et 以及本實驗室設計的 7-Dipy 的配位基結構圖。. 在本篇實驗中的 7-Impy 與 7-MeImpy 則是針對其結構上配位基做改變，藉以改變其電子效應以探討不同配位基與銅離子之間的作用與形成三核銅簇化合物之後的催化效果。. 17.

(35) 二實驗部分 2-1 藥品與儀器藥品藥品. 廠牌. 純度. 包裝. CAS No.. Homopiperazine. Acros. 98%. 500 g. 505-66-8. Epichlorohydrin. Acros. 99%. 1L. 106-89-8. Sodium hydroxide. Osaka. 95%. 500 g. 1310-73-2. Hydrogen peroxide. Osaka. 35%. 500 mL. 7722-84-1. Copper(II) tetrafluoroborate hexahydrate. Strem. 99%. 250 g. 38465-60-0. Copper(II) perchlorate hexahydrate. Acros. 98%. 500 g. 10294-46-9. Cyclohexane. Merck. 99.5%. 1L. 110-82-7. Cyclohexanol. Aldrich. 99%. 25 mL. 108-93-0. Cyclohexanone. Acros. 99.8%. 25 mL. 108-94-1. Toluene. Merck. 99%. 20 L. 108-88-3. Alfa Aesar. 98%. 25 g. 623-37-0. Alfa. 97%. 5g. 3034-50-2. 2-aminomethyl pyridine. Acros. 99%. 25 ml. 3731-51-9. 1-methyl-2-imidazolecarboxaldehyde. Acros. 97%. 5g. 13750-81-7. 5,5-Dimethyl-Pyrroline-N-Oxide(DMPO). Sigma. 97%. 5g. 603-35-0. Tetrabutylammonium tetrafluoroborate. Aldrich. 99%. 100 g. 429-42-5. 3-hexanol Imidazole-4-carbozaldehyde. 18.

(36) 儀器 NMR. Bruker 400 AV-400. ESI-MASS. Finningan TSQ 700 GC/LC/MS. UV-Vis. Scinco S-3100. GC-MS. GC (HP 6890)-MS (HP5973). EPR. Brucker ESP 300 CW-EPR. CV. CHI 611D Electrochemical work station. Microwave. CEM Discover. 19.

(37) 2-2 3,3-(1,4-diazepane-1,4-diyl)bis(1-chloropropan -2-ol) 7-Cl 之合成. 圖 2-1〆3,3-(1,4-diazepane-1,4-diyl)bis(1-chloropropan-2-ol)之合成. 於室溫下，將 3.16 g epichlorohydrin (34.2 mmol) 溶於 15 ml CH3OH 中，緩慢地滴入 homopiperazine (1.72 g, 17.1mmol) 的 CH3OH 溶液。在-5oC 下攪拌 3 小時後，將溶液移至真空系統下抽乾，即可得到透明黏稠狀固體化合物 (4.66 g, 16.34 mmol)。 1. H NMR (CD3OD, 400 MHz): 1.72 (m, 2H, CH2), 2.55 (m, 4H,. CH2), 2.71 (m, 4H, CH2), 3.52 (m, 4H, CH2), 3.80 (m, 2H,CH) (附圖1); 13C NMR(CD3OD, 400 MHz):  70.5, 62.2, 56.7, 56.2,28.8。(附圖 2). 20.

(38) 2-3 4-(2-Pyridylmethylaminomethyl)imidazole Impy 之合成. 圖 2-2〆4-(2-Pyridylmethylaminomethyl)imidazole 之合成. 取 1.11 g imidazole-4-carbozaldehyde (11.55 mmol)，置入 100 ml 雙頸圓底燒瓶，抽灌氮氣三次後，加入 15 ml 乙醇，再將溶於 10 ml 乙醇的 1.2 毫升 2-aminomethyl pyridine (11.56 mmol)加入，於常溫下攪拌，4 小時後抽乾溶液。接下來取 1.31 g 硼氫化鈉(34.68 mmol)，置入 100 ml 雙頸圓底燒瓶，抽灌氮氣三次後，將溶於 20 ml 乙醇中的硼氫化鈉加入，於室溫下攪拌 1 小時候，抽乾得到白色固體。將 35 ml 的二氯甲烷加入白色固體中，混合後萃取三次，濾液抽乾可得到淡黃色油狀液體。 1. H NMR (CD3OD, 400 MHz):  3.77, 3.88 (s, s, 4H,. -CH2-N-CH2-), 7.00 ~ 8.49 m, 6H, Ar)(附圖 3);. 13. C NMR(CD3OD,. 400 MHz):  44.43, 53.12, 122.26, 122.65, 134.98, 148.41, 158.9(附圖 4)。 21.

(39) 2-4 MeImpy 之合成. 圖 2-3〆MeImPy 之合成. 取 1.27 g 1-methyl-2-imidazolecarboxaldehyde (11.55 mmol)，置入 100 ml 雙頸圓底燒瓶，抽灌氮氣三次後，加入 15 ml 乙醇，再將溶於 10 ml 乙醇的 1.2 ml 2-aminomethyl pyridine (11.56mmol)加入，於常溫下攪拌，4 小時後抽乾溶液。接下來取 1.31 g 硼氫化鈉(34.68 mmol)，置入 100 ml 雙頸圓底燒瓶，抽灌氮氣三次後，將溶於 20 ml 乙醇中的硼氫化鈉加入，於室溫下攪拌 20 小時候，抽乾得到白色固體。將 35 ml 的二氯甲烷加入白色固體中，混合後萃取三次，濾液抽乾可得到紅褐色油狀液體。 1. H NMR (CD3OD, 400 MHz):  4.02 (s, 3H, -CH3),  3.77,  3.88 (s,. s, 4H, -CH2-N-CH2-),  7.00 ~ 8.49 (m, 6H Ar) (附圖 5); 13C NMR (CD3OD, 400 MHz):  34.48, 65.93, 122.42, 122.62, 125.47, 128.14, 137.50, 142.73, 148.41, 153.99, 158.59 (附圖 6)。. 22.

(40) 2-5 7-Impy 之合成. 圖 2-4〆7-ImPy 之合成. (a)取化合物 7-Cl 與 2 當量的 Impy 溶於 CH3OH 中，加熱回流至 70oC，攪拌 4 小時，再將溶於 CH3OH 的 NaOH 緩慢滴入，攪拌 1 小時，形成深褐色溶液。停止加熱回流，將溶液抽乾，並使用 CH2Cl2 溶解，除去白色沉澱鹽類後，於真空下抽乾，即可得到配位基 7-Impy。 (b)取化合物 7-Cl 與 2 當量的 Impy 溶於 CH3OH 中，再加入 2 當量的 NaOH，使用微波反應器，微波條件〆高速攪拌，反應溫度 70oC，微波功率 200W，反應時間 1 小時。反應後將溶液抽乾，並使用 CH2Cl2 溶解，除去白色沉澱鹽類後，於真空下抽乾，即可得到配位基 7-Impy。 1. H NMR (CD3OD, 400 MHz):  1.86 (m, 2H, CH2), 2.51 ~ 2.96 (m,. 16H, CH2),  3.64 ~ 3.96 (m, 8H, CH2),  6.98 ~ 8.48 (m, 12H, Ar) (附圖 7); ESI-MS: 589.3 (M+H)+; 611.1 (M+Na)+ (附圖 8)。. 23.

(41) 2-6 7-MeImpy 之合成. 圖 2-5〆7-MeImPy 之合成. (a)取化合物 7-Cl 與 2 當量的 MeImpy 溶於 CH3OH 中，加熱回流至 70oC，攪拌 4 小時，再將溶於 CH3OH 的 NaOH 緩慢滴入，攪拌 1 小時，形成深褐色溶液。停止加熱回流，將溶液抽乾，並使用 CH2Cl2 溶解，除去白色沉澱鹽類後，於真空下抽乾，即可得到配位基 7-MeImpy。 (b)取化合物 7-Cl 與 2 當量的 MeImpy 溶於 CH3OH 中，再加入 2 當量的 NaOH，使用微波反應器，微波條件〆高速攪拌，反應溫度 70oC，微波功率 200W，反應時間 1 小時。反應後將溶液抽乾，並使用 CH2Cl2 溶解，除去白色沉澱鹽類後，於真空下抽乾，即可得到配位基 7-MeImpy。 1. H NMR (CD3OD, 400 MHz):  1.70 (m, 2H, CH2); 1.72 ~ 2.74 (m,. 16H, CH2);  3.60 ~ 3.88 (m, 8H, CH2);  6.80 ~ 8.47 (m, 12H, Ar) (附圖 9); ESI-MS: 617.3 (M+H)+; 639.3 (M+Na)+ (附圖 10)。. 24.

(42) 2-7 製備 Cu(I) 化合物 (a) [Cu(I)(CH3CN)4](BF4) 秤取 2.5 克的 Cu(II)(BF4)〄6H2O 以 15 毫升 CH3CN 溶解且加熱迴流，再加入 2.5 克的 Cu 粉以 70oC 迴流 1 小時，溶液轉變為白色。將溶液趁熱過濾，濾出尚未反應的銅粉，再迅速將濾液冰浴 15 分鐘，此時會逐漸析出白色的固體。最後過濾，保留白色固體，並至於真空系統下抽乾，儲存於手套箱中。 (b) [Cu(I)(CH3CN)4(ClO4) 秤取 2.5 克的 Cu(II)(ClO4)〄6H2O 以 15 毫升 CH3CN 溶解且加熱迴流，再加入 2.5 克的 Cu 粉以 70oC 迴流 1 小時，溶液轉變為白色。將溶液趁熱過濾，濾出尚未反應的銅粉，再迅速將濾液冰浴 15 分鐘，此時會逐漸析出白色的固體。最後過濾，保留白色固體，並至於真空系統下抽乾，儲存於手套箱中。. 25.

(43) 2-8 三核銅金屬簇化物之合成 (a)在手套箱中，取 7-Impy (10mg) 溶於 0.1ml CH3OH 和 1.9ml CH3CN 中，加入 3 當量[CuI(CH3CN)4](BF4) (16.0mg)，攪拌 30 分鐘得到黃色溶液，推測為[CuI CuI CuI (7-Impy)]BF4。將此產物取出手套箱，於液面底下通入高純度氧氣 5 分鐘，溶液顏色快速的由黃色轉變成綠色，再將此產物以. ESI-MS. 測定，推測得到. [CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2。. (b)在手套箱中，取 7-MeImpy (10mg) 溶於 0.1ml CH3OH 和 1.9ml CH3CN 中，加入 3 當量[CuI(CH3CN)4](BF4) (15.3 mg)，攪拌 30 分鐘得到黃色溶液，推測為[CuI CuI CuI (7-MeImpy)]BF4。將此產物取出手套箱，於液面底下通入高純度氧氣 5 分鐘，溶液顏色快速的由黃色轉變成綠色，再將此產物以 ESI-MS 測定，推測得到 [CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2。. 26.

(44) 2-9 催化產物鑑定催化反應進行後，加入內標準品 3-hexanol 0.1mmol (12.4L)，使用充填 silica gel 2 公分高的滴管過濾出不含銅金屬離子簇化物的濾液，再加入甲醇，使溶液變成勻相。使用 GC-MS 進行期測量。 GC-MS 使用的規格為 Hewlett-Packard GC (HP 6890)-MS (5973) 質量分析器。使用的分離管柱為 5% phenyl-arylene 及 95% dimethylpolysiloxane ZB-5MS，長 30m、寬 0.25mm、厚 0.25mm(購自 Phenomenex, Inc 的 ZebonTM corporation)。使用不分流注射方式，注射溫度為 280oC，升溫程式為〆先以維持 1 分鐘，接著以每分鐘升溫 15oC 的升溫低度升溫至 270oC，並維持 5 分鐘。總共耗時約 19 分鐘。. 27.

(45) 三結果與討論 3-1 微波合成微波是頻率介於範圍在300 GHz至300 MHz的電磁輻射，波長介於 1cm與1m之間。在電磁波波段中，微波介於紅外線與無線電波之間。微波加熱的方式主要是藉由偶極極化作用(Dipolar polarization)和離子傳導作用(Ion conduction mechanism)兩種途徑。偶極極化作用:原子或離子中常存在不平衡的電荷分佈，當受到外加電場作用時，物質會受到電場方向旋轉，順著電場方向排列，形成所謂的電偶極極化。在液體中具有極性的物質受到電場震盪 (Oscillation)由於本身電荷不均，產生偶極作用而高速旋轉產生熱效應。. 圖 3-1〆偶極極化作用(Dipolar polarization)。. 傳導作用〆當溶劑裡面含有離子時，離子受到電場的影響，產生遷移的現象，整個溶液呈現導電的狀態，水合離子在遷移時會與鄰近. 28.

(46) 分子產生碰撞和摩擦，並且將動能轉換成熱能。. 圖 3-2〆傳導作用(Ion conduction mechanism)。. 傳統的有機合成是以外部熱源如油浴或加熱包將熱量傳導至容器內，再經由熱對流，將能量傳遞至反應物中，此方法較費時且受熱不均，效率較差。而微波加熱是藉由輻射傳導能量，產生偶極極化作用 (Dipolar polarization)和離子傳導作用(Ion conduction mechanism)，使分子因碰撞摩擦而產生熱能，是一種內部加熱的方式，能夠減少因熱能傳遞而產生的能量損耗，節省反應時間，並且提高產率和純度。. 圖 3-3〆微波加熱(左圖)與油浴加熱(右圖)之間的問度梯度比較圖。. 在本實驗室先前的研究中，合成含氮配位基是使用加熱包加熱回流進行合成反應，反應耗時多天。在此研究中，嘗試使用微波反應來 29.

(47) 改善合成的效率。在常溫常壓下，取 7-Cl 約 0.1 克，與 2 當量的 Impy 或 MeImpy 混合溶於 4 ml 的 CH3OH 中，再加入 2 當量的 NaOH，將此配好的溶液放入微波反應器，條件設定〆高速攪拌，反應溫度 70oC，微波功率 200W，反應時間 1 小時。1 小時後即可得到產物 7-Impy 或 7-MeImpy，與原本使用加熱包合成的方式相比，省下了許多時間，並且產物的顏色也比較淺，推測是原本使用加熱包加熱反應的時間太長而產生了未知的副產物，加深了產物溶液的顏色。. 30.

(48) 3-2 三核銅金屬簇離子化合物的形成與氧氣之反應. 圖 3-4〆[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之形成。. 根據先前的研究，在高純度氮氣環境下取含氮配位基 7-Impy 與 3 當量的[CuI(CH3CN)4](BF4)，以無水 CH3CN 為溶劑，攪拌 30 分鐘，得到一黃色溶液，為三核銅金屬簇離子化合物[CuICuICuI(7-Impy)]BF4。接著在液面底下通入高純度的氧氣 5 分鐘，溶液很快的由黃色轉變成為綠色，由 ESI-MS 光譜分析可以得到三核銅金屬簇離子化合物 [CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 ，其分子量為 966.98 g/mol (圖 3-5)。. 31.

(49) 圖 3-5〆[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之 ESI-MS 光譜圖。. 圖 3-6〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之形成。. 同樣的方法適用在另一個含氮配位基 7-MeImpy 上，在高純度氮 32.

(50) 氣環境下取含氮配位基 7-MeImpy 與 3 當量的[CuI(CH3CN)4](BF4)，以無水 CH3CN 為溶劑，攪拌 30 分鐘，得到一黃色溶液，為三核銅金屬簇離子化合物[CuICuICuI(7-Imeimpy)]BF4。接著在液面底下通入高純度的氧氣 5 分鐘，溶液很快的由黃色轉變成為綠色，由 ESI-MS 光譜分析可以得到三核銅金屬簇離子化合物 [CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 ，其分子量為 995.03 g/mol (圖 3-6)。. 圖 3-7〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之 ESI-MS 光譜圖。. 33.

(51) 3-3 三核銅金屬簇離子化合物經氧氣氧化後電子吸收光譜. 圖 3-8〆各系統 UV-Vis 吸收光譜圖，濃度 2×10-3M (a)[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 (b)[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2。. 圖 3-9〆各系統 UV-Vis 吸收光譜圖，濃度 10-4M (a)[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 (b)[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2。 34.

(52) 圖 3-10〆本實驗室先前研究之 UV-Vis 吸收光譜圖 (1)[CuIICuII(O)CuII(7-OH-Me)](BF4) (2)[CuIICuII(O)CuII(7-OH-Et)](BF4) (3)[CuIICuII(O)CuII(7-OH-Dipy)](BF4)。. 圖 3-11〆本實驗室先前研究之 UV-Vis 吸收光譜圖(經稀釋過後) (1)[CuIICuII(O)CuII(7-OH-Me)](BF4) (2)[CuIICuII(O)CuII(7-OH-Et)](BF4) (3)[CuIICuII (O) CuII(7-OH-Dipy)](BF4)。. 在常溫常壓下，將三核銅金屬簇離子化合物 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 和[CuICuICuI(7-Imeimpy)]BF4 以 CH3CN 為溶劑將濃度為 2×10-3 M，通入高純度氧氣 5 分鐘，溶液由黃色轉變為綠 35.

(53) 色，對溶液做 UV-Vis 吸收光譜的測量。從圖中可以看到 UV-Vis 在約 670 nm 有吸收(圖 3-8)，再將濃度稀釋為 10-4 M 測量 UV-Vis 吸收光譜，則可以看到在約 250 nm 有吸收(圖 3-9)，與本實驗室先前研究的 [CuIICuII(O)CuII(7-OH-Me)](BF4) [CuIICuII(O)CuII(7-OH-Et)](BF4) [CuIICuII (O) CuII(7-OH-Dipy)](BF4)三種三核銅金屬簇離子化合物有著相同的 UV-Vis 吸收(圖 3-10、圖 3-11)。利用 Beer–Lambert law，計算其莫耳消光系數(molar absorptivity)。其中，[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 在波長 262 nm 最大莫耳消光系數為 9.43×103 M-1cm-1，而[CuICuICuI(7-Imeimpy)]BF4 則是在波長 261 nm 有最大莫耳消光系數為 1.54×104 M-1cm-1。. 36.

(54) 3-4 三核銅金屬簇離子化合物 CV 將 10-5 mole (10 mg)的[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 抽乾後用 CH3CN 配成 10 ml (10-3 M) 溶液並測 CV，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為-1.5 V 到+1.5 V，掃描速度 50 mV/s (圖 3-12)。. 圖 3-12〆[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 之 CV 圖，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為 -1.5 V 到+1.5 V，掃描速度 50 mV/s。. 同. 樣. 的. ，. 將. 10-5. mole. (10. mg). 的. [CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 抽乾後用 CH3CN 配成 10 ml (10-3 M) 溶液並測 CV，掃描速度 50 mV/s ，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為-1.2 V 到 1.5 V。. 37.

(55) 圖 3-13〆[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 之 CV 圖，工作電極為玻璃碳電極，參考電極為銀電極，電解質為 Tetrabutylammonium tetrafluoroborate，掃描範圍為 -1.2 V 到+1.5 V，掃描速度 50 mV/s。. 38.

(56) 3-5 三核銅金屬簇離子化合物之催化作用根據本實驗室先前研究的 7-Dipy 系統，在室溫下以無水 CH3CN 當做溶劑，以 1 當量的含氮配位基 7-Dipy 和 3 當量的 [CuICuICuI(CH3CN)4]BF4 合成出三核銅金屬簇離子化合物，加入 500 當量的 cyclohexane 做為受質(C-H 鍵能 99.3 kcal/mol)，再加入 50 當量 35%的 H2O2 做為氧化劑，可對 cyclohexane 進行氧化，產生 cyclohexanol 與 cyclohexanone，在本研究中也以相同的方法做測試。在室溫下以無水 CH3CN 當做溶劑，以 1 當量的含氮配位基 7-Impy 和 3 當量的[CuICuICuI(CH3CN)4]BF4 合成出三核銅金屬簇離子化合物，加入 500 當量的 cyclohexane 做為受質，再加入 50 當量 35%的 H2O2 做為氧化劑，氧化後加入 0.1 mmol (12.4l) 的 3-hexanol 做為定量用的內標準品，以 silica gel 過濾，除去三核銅金屬簇離子化合物後，測 GC-MS 層析圖。7-MeImpy 也使用相同的方法做測試。在層析圖中，可以觀察到在滯留時間 (Retention time) t = 1.38 min 為 CH3OH 的訊號，t = 1.43 min 為 CH3CN 的訊號，t = 169 min 為 cyclohexane 的訊號，t = 2.10 min 為內標準品 3-hexanol 的訊號，t = 2.70 min 為 cyclohexanol 的訊號，t = 2.79 min 為 cyclohexanone 的訊號。. 39.

(57) (b). (a). (d). (c). 圖 3-14〆(a)[CuI CuI CuI (7-Impy)]BF4 加入 50 當量 H2O2 氧化 500 當量 cyclohexane 之 GC 層析圖 (b)[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 加入 50 當量 H2O2 氧化 500 當量 cyclohexane 之 GC 層析圖 (c)滯留時間 t = 2.70 min cyclohexanol 的質譜圖 (d)滯留時間 t = 2.79 min cyclohexanol 的質譜圖。. 我們根據氧化劑 H2O2 的消耗量來計算轉化率 (conversion)。在 GC-MS 層析圖中，利用波峰底下的積分面積和反應後加入 0.1 mmol 的內標準品 3-hexanol 相對比例來計算轉化率與莫爾生成率。轉化率的公式如下〆 𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖𝑜𝑛(%) =. 𝑐𝑦𝑐𝑙𝑜ℎ𝑒𝑥𝑎𝑛𝑜𝑙(𝑚𝑜𝑙) + 𝑐𝑦𝑐𝑙𝑜ℎ𝑒𝑥𝑎𝑛𝑜𝑛𝑒(𝑚𝑜𝑙) × 2 𝐻2 𝑂2 (𝑚𝑜𝑙). 生成 1 當量的 cyclohexanol 需要消耗 1 當量的 H2O2，而生成 1 當量的 cyclohexnone 則需要消耗 2 當量的 H2O2 ，故在計算公式中 40.

(58) cyclohexanone 的莫爾數要乘以 2 才能代表 H2O2 的消耗量，將兩者 H2O2 的消耗量相加後除以 H2O2 的總含量就可以得到全部的轉化率。 (圖 3-15). 圖 3-15〆cyclohexanol 及 cyclohexanone 所需之氧化當量示意圖。. Products (equiv.) Catalysta. H2O2. A 50 100 150 200 50 100 150 200. 500 500 500 500 500 500 500 500. 7-Impy 7-Impy 7-Impy 7-Impy 7-MeImpy 7-MeImpy 7-MeImpy 7-MeImpy. 2.06 5.73 9.10 11.23 1.76 4.96 7.81 10.82. TONb. Total conversion (%) H2O2c. 3.36 9.16 12.61 17.96 4.12 9.84 15.01 18.15. 6.7% 9.1% 8.3% 8.9% 8.2% 9.8% 10.0% 9.0%. B 1.03 2.06 2.96 3.46 0.81 2.11 2.4 3.57. 表 3-1〆利用[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 和[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4，使用不同當量雙氧水催化 cyclohexane 生成 cyclohexanol 與 cyclohexanone 的轉換率和 TON 產物之結果。 a. 催化劑〆[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 為 1 當量(17.0 µmol)々 [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 為 1 當量(16.2 µmol)。 b 每莫耳催化劑可以產生產物的次數〆(A＋2B) / 催化反應 1 小時 c 每莫耳的雙氧水可以轉換受質形成產物的轉換率〆(A＋2B) / H2O2. 41.

(59) 從表中可以發現， [CuICuICuI(7-Impy)]BF4. 和. [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 兩者催化效果都是隨著氧化劑的增加而變得更好，其中無論是 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4. 或是. [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 生成產物的當量數都是以 cyclohexanol 為主，生成產物的當量數是 cyclohexanone 的兩倍以上。本實驗先前研究的含氮配位基 7-Dipy 與銅金屬所形成的三核銅金屬簇離子化合物催化 cyclohexane 的生成物 cyclohexanol 與 cyclohexanone 的比例接近 1: 1，與本實驗的催化結果不相同。因此可以推斷含氮配位基 7-Dipy，若將其中一個 pyridine 取代成 imidazole，能使催化反應變得有選擇性，在 cyclohexane 催化反應中，以 cyclohexanol 為主要產物。為了證實 7-Impy 與 7-MeImpy 系統確實有催化的效果，做了四組對照組，分別是(a)只有加入 7-Impy、(b)只有加入 7-MeImpy、(c)只有加入[CuICuICuI(CH3CN)4]BF4 以及(d)沒有加入 ligand 也沒有加入 [CuICuICuI(CH3CN)4]BF4，將這四組都加入 50 當量的 H2O2，對 500 當量的 cyclohexane 做氧化反應(圖 3-16)。從反應後的 GC 圖中可以看到，在沒有三核銅金屬簇離子化合物作為催化劑的情況下， H2O2 無法直接氧化 cyclohexane 產生 cyclohexanol 或 cyclohexanone。此結果證明了 7-Impy 和 7-MeImpy 確實在氧化反應中扮演了催化劑的角色。 42.

(60) (a). (b). (c). (d). 圖 3-16〆(a)只有加入 7-Impy (b)只有加入 7-MeImpy (c)只有加入 [CuICuICuI(CH3CN)4]BF4 (d)沒有 ligand 也沒有[CuICuICuI(CH3CN)4]BF4。四組實驗皆加入 500 當量 cyclohexane 和 50 當量 H2O2 進行氧化反應 1 小時。. 43.

(61) 3-6 三核銅金屬簇離子化合物催化反應時間追蹤研究在高純度氮氣環境下取含氮配位基 7-Impy (10 mg)與 3 當量的 [CuI(CH3CN)4](BF4) (16.8 mg)，溶於 0.1ml CH3OH 和 1.9ml CH3CN 中，攪拌 30 分鐘，得到一黃色溶液，為三核銅金屬簇離子化合物 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4。加入 500 當量 cyclohexane 做為受質，加入 200 當量 35%的 H2O2 當氧化劑，反應 5、10、15、30、45、90、180 分鐘，對氧化後的產物做定量分析，在氧化後加入 0.1 mmol 的內標準品 3-hexanol，並以 silica gel 去除三核銅金屬簇離子化合物後，收集溶液，測 GC-MS 計算 TON 值。. 圖 3-17〆[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 在室溫下加入 200 當量 H2O2 催化 500 當量 cyclohexane，反應 5、10、15、30、45、90、180 分鐘的 TON 對時間圖。. 44.

(62) 7-MeImpy 也做相同的實驗，在高純度氮氣環境下取含氮配位基 7-MeImpy (10 mg)與 3 當量的[CuI(CH3CN)4](BF4) (15.3 mg)，溶於 0.1ml CH3OH 和 1.9ml CH3CN 中，攪拌 30 分鐘，得到一黃色溶液，為三核銅金屬簇離子化合物[CuICuICuI(7-Impy)]BF4。加入 500 當量 cyclohexane 做為受質，加入 200 當量 35%的 H2O2 當氧化劑，反應 5、 10、15、30、45、90、180 分鐘，對氧化後的產物做定量分析，在氧化後加入 0.1 mmol 的內標準品 3-hexanol，並以 silica gel 去除三核銅金屬簇離子化合物後，收集溶液，測 GC-MS 計算 TON 值。. 圖 3-18〆[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 在室溫下加入 200 當量 H2O2 催化 500 當量 cyclohexane，反應 5、10、15、30、45、90、180 分鐘的 TON 對時間圖。. 從兩張圖中可以看到兩種系統在初始催化速度都想當快，其中 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 在 30 分鐘後，催化速率趨於平緩，而另一個 45.

(63) 系統[CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4，則是在 30 分鐘後其催化效果就變得比較不明顯。. 46.

(64) 3-7 三核銅金屬簇離子化合物與 H2O2 反應時中間物之 EPR 研究為了證明我們的三核銅簇離子化合物的反應機構是經由單氧直接嵌入(O-atom insertion)而不是經由自由基反應，所以必須設計一個實驗，可以檢測三核銅金屬簇離子化合物在反應中是否有自由基的參與。在室溫含高純度氮氣環境下取 7-Impy (10mg) 溶於 0.1ml CH3OH 和 1.9ml CH3CN 中，加入 3 當量[CuI(CH3CN)4](BF4)，攪拌 30 分鐘得到黃色溶液為[CuICuICuI(7-Impy)]BF4 。再加入對自由基想當靈敏的 5,5-Dimethyl-Pyrroline-N-Oxide (DMPO) 10 當量，和 200 當量的 cyclohexane，最後加入 50 當量 35%的 H2O2 當氧化劑，反應 20 分鐘，測試溫 EPR 訊號。. 圖 3-19〆典型 DMPO 與自由基反應的 EPR 光譜圖。 47.

(65) (a). (b). 圖 3-20〆(a) [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 加入 200 當量 cyclohexane，50 當量 H2O2， 10 當量 DMPO 後，反應 20 分鐘之室溫 EPR 光譜圖 (b) [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 加入 200 當量 cyclohexane，50 當量 H2O2，10 當量 DMPO 後，反應 20 分鐘之室溫 EPR 光譜圖。. 在圖 3-20(a)中發現，隨著時間的增加，CuII 的訊號也逐漸地變強，表示在這段時間內 [CuI(CH3CN)4](BF4) 慢慢的反應成為 [CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 ，並且將 cyclohexane 氧化成 cyclohexanol 和 cyclohexanone 而在這個反應過程中 EPR 光譜圖中並沒有偵測到 DMPO 與自由基反應所產生的 EPR 訊號。在圖 3-20(b) 中可以看到 [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 的反應速度比 48.

(66) [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 來的快速，300 sec 後訊號強度就沒有再變化，代表已經全部反應完，同樣的在這個過程當中，也沒有偵測到 DMPO 與自由基反應所產生的 EPR 訊號。 (a). (b). 圖 3-21〆(a)[CuIICuII(-O)CuII(7-impy)](BF4)2 加入，10 當量 DMPO 後之室溫 EPR 光譜 (b)[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 加入，10 當量 DMPO 後之室溫 EPR 光譜。. 在另一個實驗中，取通入高純度氧氣過後的三核銅金屬簇離子化合物[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 加入 10 當量的 DMPO，做室溫 EPR 測試，在圖 3-21(a)可以看到 DMPO 的訊號，但是這個訊號卻不屬於任何一種典型 DMPO 與自由基反應的 EPR 光譜(圖 3-19)，因此 49.

(67) 推測 DMPO 可能是和[CuIICuII(-O)CuII(7-Impy)](BF4)2 上的其中一個銅金屬有了交互作用，CuII 上的孤電子傳遞到 DMPO 上，使 DMPO 因為接收到一個電子，因此產生了可被 EPR 偵測到的訊號。在[CuIICuII(-O)CuII(7-MeImpy)](BF4)2 上也發現了相同的現象，推測是兩種含氮配位基除了 imidazle 上有無甲基的差別之外，其他的化學環境皆相同，因此才會發生相同的反應。. g=2. 250 G. 圖 3-22〆本實驗室先前之研究，室溫下[CuICuICuI(7-Dipy)]BF4 (19 mol) 加入 35% H2O2 (962 mol) 和 DMPO (190mmol) 之 EPR 光譜圖。. 在本實驗室先前的研究中，在室溫含高純度氮氣的環境下，以無水乙腈 CH3CN (1 ml)當溶劑，利用含氮配位基 7-Dipy (19 µmol)，加入 3 當量的[CuI(CH3CN)4](BF4)，形成化合物[CuICuICuI(7-Dipy)](BF4)，再加入對自由基物質相當靈敏的. 10. 當量 250 G. 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide (DMPO，190 µmol) 和 200 當量環己烷攪拌 15 分鐘，最後加入 50 當量 35%的 H2O2 (80 µl，962 µmol) 當氧 50.

(68) 化劑反應 45 分鐘，測室溫 EPR 訊號(圖 3-22)。從圖中看見的 EPR 訊號是屬於 CuII 的訊號，沒有牽涉到自由基反應，與本實驗相符合。. 圖 3-23〆推測[CuICuICuI(7-Impy)]+加入雙氧水後傳遞氧原子催化 cyclohexane 之反應機構圖。. 51.

(69) 四結論在此研究中，成功合成 7-Impy 和 7-MeImpy 兩種含氮的配位基，在無氧無水的環境下可與 3 當量的[CuI(CH3CN)4](BF4)混合後形成三核銅金屬簇離子化合物 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4. 和. [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4，並且能夠在氧化反應中扮演催化劑的角色，活化 C-H 鍵產生羥化反應，可成功的將 cyclohexane 氧化成 cyclohexanol 和 cyclohexanone。將微波合成應用在含氮配位基的合成，可有效的節省時間，使合成的效率大幅提升，並且降低因為熱而產生的副產物，微波合成出的含氮配位基顏色與本實驗室先前的研究所合成出來的含氮配位基相比變得較淺，推測是因為熱裂解產生的副產物減少而使顏色變淡。對於 7-Impy 和 7-MeImpy 的合成還有純度上的問題要克服，未來若是能再改進合成方法將這兩種含氮配位基的純度提升，則可能有更高的催化效果。在三核銅金屬簇離子化合物 [CuICuICuI(7-Impy)]BF4 和 [CuICuICuI(7-MeImpy)]BF4 的催化反應過程中加入 DMPO 測室溫 EPR 並沒有偵測到 DMPO 與自由基的反應，證實其催化的反應機制並沒有牽涉到自由基反應。. 52.

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(74) 附圖 1: 7-Cl 400MHz 1H NMR 57.

(75) 附圖 2: 7-Cl 400MHz 13C NMR 58.

(76) 附圖 3: Impy 400MHz 1H NMR 59.

(77) 附圖 4: Impy 400MHz 13C NMR 60.

(78) 附圖 5: MeImpy 400MHz 1H NMR 61.

(79) 附圖 6: MeImpy 400MHz 13C NMR 62.

(80) 附圖 7: 7-Impy 400MHz 1H NMR 63.

(81) 附圖 8: 7-Impy ESI-MS 64.

(82) 附圖 2: 7-MeImpy 400MHz 1H NMR 65.

(83) 附圖 30: 7-MeImpy ESI-MS 66.

(84)

微粒體甲烷單氧化酵素之模型 三核銅金屬簇化物之研究

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