Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4239

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(1)臺北醫學大學醫學院醫學科學研究所基礎醫學組碩士論文 Taipei Medical University College of Medicine Graduate Institute of Medical Sciences Master Thesis. 指導教授：葉光勝 (Kuang-Sheng Yeh). 在固態及液態培養基中都會產生第一型線毛的鼠傷寒沙門氏菌 ubiB 突變株特性分析 Characterization of a Salmonella enterica serotype Typhimurium ubiB mutant that constitutively produces type 1 fimbriae both in static broth and on solid agar culture conditions. 研究生：張立寰 (Li-Huan Chang) 學號：M102095020. 中. 華. 民. 國. 九. 十. 七. 年. 六. 月.

(2) 目錄目錄. ....................................................................................................2. 圖次. ....................................................................................................4. 表次. ....................................................................................................5. 中文摘要 ....................................................................................................7 英文摘要 ....................................................................................................8 縮寫表. ....................................................................................................9. 第一章. 文獻回顧 ..................................................................................10. 一、. 沙門氏菌介紹................................... 10. 二、. 沙門氏菌流行病學............................... 11. 三、. 沙門氏菌致病機制............................... 12. 四、. 沙門氏菌的線毛種類............................. 14. 五、. 第一型線毛..................................... 16. 六、. 先前研究- 突變株資料庫的建立................... 18. 七、. 本實驗研究方向................................. 19. 第二章. 材料與方法 ..............................................................................21. 一、. 第一型線毛的測定............................... 21. 二、. 突變株回覆試驗................................. 23. 三、. 觀察 ubiB 沙門氏菌突變株 fim 基因組的表現量 ...... 24. 四、. 生長曲線....................................... 27. 五、. 觀察 ubiB 突變株線毛的表現情形.................. 27. 第三章. 結果 ..........................................................................................29. 一、. 第一型線毛的測定............................... 29. 二、. 觀察 ubiB 沙門氏菌突變株 fim gene cluster 的表現量30 ~2~.

(3) 三、. 生長曲線....................................... 30. 四、. 電子顯微鏡觀察................................. 31. 第四章. 討論 ..........................................................................................32. 參考文獻 ..................................................................................................38. ~3~.

(4) 圖次. Fig. 1. Genetic organization of the S. Typhimurium fim gene cluster. ......................................................................................44. Fig. 2. The regulatory network of fim genes in S. Typhimurium. .45. Fig. 3. The structure of vitamin B12 and coenzyme B12. .................46. Fig. 4. The recombinant plasmid pTA-ubiB . ..................................47. Fig. 5. RT-PCR for fim transcription. ..............................................48. Fig. 6. Growth curve of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB and S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) grown in shaking LB broth at 37℃ for 24 hours.................................49. Fig. 7. S. Typhimurium LB5010 produced type 1 fimbriae when cultured in LB static broth at 37℃ for 48 hr.......................50. Fig. 8. S. Typhimurium ubiB strain produced type 1 fimbriae when cultured in LB static broth at 37℃ for 48 hr.......................51. Fig. 9. S. Typhimurium ubiB strain produced type 1 fimbriae when grown on LB agar at 37℃ for 24 hr......................................52. Fig. 10. S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) produced type 1 fimbriae when grown in LB static broth at 37℃ for 48 hr.................53. Fig. 11. S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) did not produce type 1 fimbriae when grown on LB agar at 37℃ for 24 hr. ...........54. ~4~.

(5) 表次. Table 1 Characteristics of Salmonella fimbriae ................................55 Table 2 Strains and plasmids used in this study................................56 Table 3 The primers used in this study. .............................................57 Table 4 Agglutination of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB and S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) .........................58 Table 5 Dilution of Agglutination .......................................................59 Table 6 The fimbrial length of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB, S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) ......60. ~5~.

(6) 誌謝. 在北醫唸完四年的保健營養系後，很高興能夠順利考上北醫的醫科所，並進入到恩師葉光勝老師的實驗室裡，展開兩年的碩士班生活。感謝葉老師這兩年來不論是在課業上、生活上都能夠幫我指點迷津，給我想法。再來感謝台灣動物科技研究所的林俊宏博士和臺北醫學大學商惠芳老師百忙之中參加我的畢業口試，並在論文上給予我指導。實驗室的成員，學長克銓、學姐上勤、嘉惠和嘉純，謝謝你們很有耐心的帶著我做實驗，讓我學習到各種不同的實驗技術和一些技巧，生活上也是可以互相分享心得的好對象。微免科的好同學毓玲、筱喬、兼豪、逸璉、韻潔、愛漂、耀正、明莉，醫科所的好朋友淑娟、振剛、尚誠、婉榕、佳紋、皓耘、佩珊、宗樺、金燕，學弟妹昱良、益民、郁文、怡伶，感謝你們豐富了我的碩士班生活。還要感謝我的父母和弟弟還有小蕓的支持，讓我可以專心在課業上，順利完成我的論文。要感謝的人太多了，最後來謝天吧！. 張立寰敬誌於臺北醫學大學醫學科學研究所中華民國九十七年七月十一日. ~6~.

(7) 中文摘要. 鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)第一型線毛的 fim 基因組會受到環境的影響而進行表現與否。本實驗設計兩種培養環境，靜置培養液與固態培養基，當野生株鼠傷寒沙門氏菌在此兩種環境下生長時，在靜置培養液的菌株會表現第一型線毛；反之，在固態培養基上則沒有表現。目前，除了調控第一型線毛已知的基因 fimZYWU 和構成線毛的基因 fimAICDFH 外，在本實驗室先前的研究結果發現，突變株 S. Typhimurium ubiB 也會影響到第一型線毛的表現，在兩種培養環境下皆會產生第一型線毛。UbiB 是一 NADP(H) reductase，參與 coenzyme B12 的合成。利用回復試驗所建立的 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB)，可以確定 ubiB 會影響第一型線毛的表現。接著，使用 RT-PCR 來個別增幅 ubiB 影響調控基因 fimZYW，結果發現當 S. Typhimurium ubiB 生長在 agar 上，正向調控第一型線毛的 fimZ 有被表現出來，而 fimY 和 fimW 則沒有表現。在電子顯微鏡觀察下， S. Typhimurium ubiB 在固態及液態培養基均表現第一型線毛。利用震盪培養來觀察 S. Typhimurium ubiB 生長曲線，發現 ubiB 突變株之生長速率較野生株與回復株緩慢許多。在之前的研究發現，沙門氏菌存活在嚴峻的環境下，傾向會表現出線毛以適應環境。我們的研究顯示 ubiB 會影響第一型線毛的表現，更深入的研究值得進一步探討。. ~7~.

(8) Abstract Salmonella is an important food-borne pathogen of public health concern. Salmonella enterica contains more than 2,500 serotypes among which Typhimurium is an important etiology of gastroenteritis. Adhesion of bacteria to the host epithelial cells is a prerequisite step in establishing infection, while fimbriae are the primary structures implicated in such an adherent event. The type 1 fimbriae are the most commonly found fimbrial appendages on the outer membrane of Salmonella enterica serotype Typhimurium.. The strongly fimbriate-phase bacteria can be isolated fol-. lowing serial passage every 48 hours in static broth culture, while non-fimbriate bacteria are obtained by growth on solid agar media.. The phenotypic expression of type. 1 fimbriae in S. Typhimurium is the result of the interaction and cooperation of several genes in the fim gene cluster. A transposon insertion mutagenesis has revealed that several genes outside the fim gene cluster may also involve in the expression of type 1 fimbriae both in static broth and on solid agar culture conditions. One S. Typhimurium mutant ubiB constitutively produced type 1 fimbriae in both culture conditions.. The ubiB gene could encode a NAD(P)H-flavin reductase. Southern hy-. bridization indicated that the transposition event occurred once in this mutant strain. Transforming the plasmid pTA-ubiB that contained the coding sequence of ubiB conferred the ubiB mutant back to the type 1 fimbrial phenotype as seen in the parental strain as indicated by yeast agglutination and electron microscopy.. Reverse tran-. scription polymerase chain reaction (RT-PCR) indicated that the fimA expression of the ubiB mutant strain obtained from the static broth was about 1.2% of that obtained from the solid agar culture.. When ubiB strain harbored the plasmid pTA- ubiB, the. fimA expression from broth was about 34 fold of that from the solid agar. As a control, 16S rRNA was constantly expressed in all the strains tested.. Growth curve. analysis suggested that ubiB mutant had a slower growth rate in the log phase than the parental strain and the ubiB (pTA- ubiB) strain. How ubiB gene product affects type 1 fimbrial expression in S. Typhimurium is of interest and warrants further investigation. Key Words: Salmonella enterica serotype Typhimurium, type 1 fimbriae, ubiB. ~8~.

(9) 縮寫表. Amp: ampicillin bp: base pair DEPC : diethylpyrocarbonate Kan: Kanamycin kbp: kilobase pair kDa : kilodalton LB: Luria-Bertani µl：microliter ml: milliliter nm: nanometer PBS : phosphate-buffered saline PCR : polymerase chain reaction RT-PCR : reverse transcriptase polymerase chain reaction rpm : revolutions per minute ddH2O: double distilled water TEM: Transmission Electron Microscope. ~9~.

(10) 第一章文獻回顧. 一、沙門氏菌介紹. 沙門氏菌(Salmonella）屬於革蘭氏陰性（Gram-negative）菌，菌體大小為 0.7~1.5 × 2.0~2.5µm，不產芽孢，具兼性厭氧性 (facultative anaerobic)，無法代謝乳糖。沙門氏菌屬於中溫菌，適合生長溫度在 35~40℃間。沙門氏菌的分類相當歧異，因此 WHO 按照 Kauffmann-White Scheme 的分類方式(67)，利用菌體上的脂多醣 ( lipopolysaccharide ) (O)抗原和鞭毛蛋白質抗原(H)的不同，將沙門氏菌作為分類。沙門氏菌屬 (Salmonella genus)包含了下列兩個種 (species) Salmonella enterica 和 Salmonella bongori，前者主要感染溫血動物，後者主要感染冷血動物。其中 Salmonella enterica 又可分為六個亞種，(i) Salmonella enterica subsp. arizonae、(ii) Salmonella enterica subsp. diarizonae、(iii) Salmonella enterica subsp. enterica、(iv) Salmonella enterica subsp. houtenae 、(v) Salmonella enterica subsp. indica 和(vi) Salmonella enterica subsp. salamae。(8) 本篇論文採用血清型的命名方式來書寫，如 Salmonella enterica serotype Typhimurium ＝ Salmonella typhimurium ＝ Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium)。其他血清型以此類推。根據世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 的統計，截至 2004 年，屬於腸內細菌科( Family of Enterobacteriaceae)的沙門 ~ 10 ~.

(11) 氏菌屬 (Salmonella spp.)，共有 2,541 種不同的血清型被分離出來 (49)。少部份的沙門氏菌血清型只會感染特定宿主，例如 S. Typhi 主要感染靈長類；S. Dublin 主要感染牛隻；S. Choleraesuis 主要感染豬隻。而大部分的沙門氏菌血清型可跨族群感染，其中 S. Enteritidis（腸炎沙門氏菌）和 S. Typhimurium (鼠傷寒沙門氏菌)會經由動物途徑來感染人類。S. Enteritidis 會造成人類全身性感染，而 S. Typhimurium 主要會造成胃腸炎的症狀。但 S. Typhimurium 在老鼠身上會造成全身感染，反而不會出現胃腸炎的症狀，類似於人類被 S. Typhi 或 Paratyphi A、B、C 感染所引起的傷寒熱( typhoid fever)的症狀。因此，S. Typhimurium 適合當作研究人類傷寒疾病的模型(55, 63) 。. 二、沙門氏菌流行病學. 在全世界中造成人類胃腸炎原因之中，沙門氏菌是最常見的食因性病原菌之一。根據 WHO 估計，每年約有 200 萬人死於因食物污染所造成的腹瀉疾病。因此，WHO 在西元 2000 年，成立了 Global Salm-Surv (GSS)，專職負責全球沙門氏菌的監控、分離、鑑定和抗藥性的研究，主要目的是控制沙門氏菌所造成的影響(48)。根據行政院衛生署疾病管制局的沙門氏菌參考實驗室，在 2007 年第三屆沙門氏菌研討會暨其他人畜共通疾病研討會上所公佈的資料，在 2004～2006 年間台灣地區分離出的沙門氏菌血清型排序為， S. Enteritidis(24.7%)、S. Typhimurium(22.6%)、S. Stanley(10.3%)、S. ~ 11 ~.

(12) Newport(5.9%)。美國疾病管制局 (the Centers for Disease Control and Prevention, CDC) 所發行的 Salmonella Surveillance: Annual Summary, 2005 資料顯示，當年度美國所分離出的血清型排序為，S. Typhimurium(19.3%)、S. Enteritidis(18.6%)、S. Newport(9.1%)、S .Heidelberg (5.3%)、S .Javiana(3.7%)。其中值得注意的是，S. Typhimurium 在 2000 年時，也位居第一名(6) 。沙門氏菌通常會隨著食物，如肉類、蛋類、奶類或是飲用水進入人體內，菌量通常需要達到 105~108 個以上才可能造成食物中毒，引起臨床上的症狀，多數病例是發生在小孩、老人或是抵抗力低的病人身上。不同的菌種則會產生不同的臨床症狀。人類常見的感染可略分成三型，傷寒型感染( typhoid fever )、副傷寒感染(paratyphoid fever)、菌血症( bacteremia）或小腸直腸炎( enterocolitis )，也很常出現混合型的感染。目前在我國，傷寒被認定為法定傳染病之一。另外，在牧場內包含牛隻、雞隻、豬隻等，也常受沙門氏菌感染，受感染的動物所排出的糞便是常見的傳染途徑，導致病原菌擴散，進而污染環境，造成公共衛生上嚴重的影響(14, 15, 32, 38, 42, 50)。. 三、沙門氏菌致病機制. 沙門氏菌藉由受污染的水源或食物，來進行口糞途徑傳染。當沙門氏菌由口進入後，必須耐過胃酸環境，再進入到寄主的腸道。腸道內，沙門氏菌藉由線毛吸附在腸道上皮細胞或是M (microfold-bearing) ~ 12 ~.

(13) 細胞上，M細胞是一種腸道上皮細胞，位於Peyer’s patches上方，沙門氏菌與M 細胞上G receptor具有極高的親和力，吸附後可藉由M細胞的運送進入循環系統。在菌體內的染色質上，有一些致病基因群集，被稱作Salmonella pathogenicity islands (SPI)，這些致病基因會受到氧氣濃度、pH值和滲透壓等環境變化所調控，入侵的過程中，以SPI1 和SPI2最為重要。SPI1和SPI2皆會轉譯出第三型分泌系統( Type III secretion system, TTSS)。在沙門氏菌入侵腸道上皮細胞之前，SPI1會先轉譯出TTSS，沙門氏菌並藉由SPI-1 TTSS進行類似注射的方式，將effector proteins (SipA, SipC)送入宿主細胞的細胞質內，調控宿主細胞的actin polymerization，改變細胞骨架，使得上皮細胞的細胞膜表面產生皺摺(cell membrane ruffling)，並驅動入侵的作用，如被胞飲入細胞內(16, 26, 28, 34, 71)。另外，SPI-1 TTSS也會引起腸胃道發炎反應。相同的情況，在腸道細胞或是M細胞都會出現(27, 47)。沙門氏菌被寄主細胞胞飲後，由細胞膜所構成類似小泡狀的結構(membrane-bound vacuole)，稱作Salmonella-containing vacuole (SCV)，沙門氏菌可在SCV內存活並增生。沙門氏菌所分泌Salmonella effector proteins，會增強chemotactic factors的表現，如pathogen-elicited epithelial chemoattractant (PEEC)會從上皮細胞的頂端(apical)分泌出來，而IL-8則是由上皮細胞的基質 (basal)分泌(41)。受感染一小時後，經過PEEC和IL-8的刺激，巨噬細胞和嗜中性白血球會在上皮細胞基層進行吞噬作用。一部分被巨噬細胞吞噬後，仍存活的沙門氏菌，可隨著巨噬細胞在血液裡流動，而到全身各臟器內，SPI-2 TTSS 則可以幫助沙門氏菌在巨噬細胞內存活 ~ 13 ~.

(14) 下來，並改變宿主細胞的通透性作用，而沙門氏菌可分泌SipB會活化 caspase-1造成巨噬細胞的死亡，然後釋放IL-1β增強發炎反應(7, 29, 43, 54, 66)，進而造成全身性感染。然而，嗜中性白血球則不會死亡。感染1～3小時後，嗜中性白血球會分泌到腸壁細胞外的腸腔，增加發炎反應的細胞和蛋白質。強烈的發炎反應，會使得大量的嗜中性白血球分泌到腸腔，導致上皮細胞和基質分離，同時有大量的液體被分泌到腸腔，造成腹瀉。受感染24～48小時後，由於發炎反應細胞釋放出蛋白質分解酶和其他中間產物，進而導致大量的表面黏膜壞死。壞死的細胞碎片可提供細菌生長所需的物質，便利細菌生長並且隨著腹瀉被排到體外，造成環境污染，並且伺機感染下個寄主。. 四、沙門氏菌的線毛種類. 吸附 (adherence) 是沙門氏菌入侵宿主細胞的第一步，沙門氏菌距離宿主細胞 50 nm 時，會利用凡德瓦力（van der Waal’s attractions）以拉近菌體與標的細胞的距離。當兩者距離接近約 10～20 nm，在菌體和標的細胞上，除了凡德瓦力外吸引的力量外，另外會出現帶負電的庫倫力 (Coulombic forces)非特異性極性互斥，產生同性相斥，拉遠距離。此時，沙門氏菌利用線毛，會緊密結合沙門氏菌與細胞，可以有效突破此電子屏障，再拉近兩者間距離。因此，線毛在吸附作用中扮演著重要的角色(13, 51)。 ~ 14 ~.

(15) 線毛(fimbriae，又可稱 pili)是蛋白質的組成物，長度約 2~8nm，大小約 14~ 30kDa，似髮狀結構附著在菌體的周圍，數量遠多於鞭毛 (flagella)，但線毛不能幫助菌體運動，每一隻沙門氏菌上約有 100~ 1000 根線毛，類似的結構也出現在大腸桿菌 (Escherichia coli)上。線毛會吸附在紅血球或是動物、植物、真菌的表面上(18)，而線毛的吸附作用，也會與生物膜(biofilm)的形成有關，當沙門氏菌存在於缺乏營養、低滲透壓或低溫的環境，可以表現出線毛，形成生物膜，使之長期的存活在寄主之外的環境，並等待下一次的入侵(68)。沙門氏菌的線毛原本是依照 1966 年 Duguid 等人的分類方法 (18)，以型態學和凝集的能力來做分類。然而隨著科學的進步，越來越多線毛被發現，有的線毛型態表現很類似，有的不會產生凝集反應。依照線毛特性的不同來做分類，如 Table 1 所示。在 2003 年 S. Typhimurium 的基因序列被 McClelland 等人所定序完成(40)，藉由所定序出來的圖譜，經比對之後，又發現許多基因也具有類似線毛的操作組結構，像是 stb 、stc 、std 、sth 、sti 和 stj。因此，目前 S. Typhimurium 上線毛的分類，可依操縱組(operon)分為下列 13 種， pefBACD、 bcfABCDEFG、 stiABCD、 stfACDEFG、 safABCD、stbABCDE、 fimAICDHF、agfBACagfDEFG、 safABCD、 stdABCD、lpfABCDE、stiABCDE、stbABCDE (3, 20, 26, 31, 40, 64)。其中 agf、 fim、 stc 在 E. coli 上，也可以被發現到許多相似的操作組(62)。在 S. Typhimurium 上，三個線毛操作組 agf (thin aggregative fimbriae)、pef (plasmid-encoded fimbriae)和 lpf (long polar fimbriae)會吸附在哺乳類動物的腸道上(4, 5, 57)，而 bcf (bovine colonization factor) 則會吸附在牛隻腸道組織中(64)。而其他的線毛，如 sti、stf、saf、stb、 ~ 15 ~.

(16) stc、std、stj 和 stb 則尚未完全被研究清楚(30, 31)。. 五、第一型線毛. 由 fim gene cluster 轉譯出來的的第一型線毛(Type 1 fimbriae)，早在西元 1959 年，由 Duguid 等人所發表(17)，大部分的腸道菌( Enterobacteriaceae ) 都可表現出第一型線毛。在沙門氏菌上的第一型線毛，具有甘露糖(mannose)感受性的特性 (mannose sensitive)，第一型線毛會與酵母菌(Yeast)或是紅血球產生凝集的現象(18)。而加入 D-mannose 之後，則會抑制凝集的產生。這是因為甘露糖會與第一型線毛結合，因此使得沙門氏菌的第一型線毛無法再與酵母菌連結，形成凝集的片段。1968 年時 Old 等人觀察到，第一型線毛受到環境的影響，會產生線毛表現的差異，稱為線毛的相變化(fimbrial phase variation) (45)。當沙門氏菌培養在靜置的 LB 液態培養基時，大部分的細菌菌體周圍會大量表現第一型線毛；而培養在 LB 固態培養基大部分的細菌則不會表現線毛(45, 46)。與第一型線毛表現有關的基因是由位於染色質上的 fim gene cluster 所組成，可分成構成線毛結構的基因，fimA、fimI、fimC、fimD、 fimH、fimF，及調控線毛表現的基因 fimZ、fimY、fimW、fimU (69)。 fim gene cluster 如 Fig 1，第一型線毛調控機制如 Fig 2 所示。當沙門氏菌處在適合表現線毛的環境時，如靜置的 LB broth，會使得屬於 DNA-binding protein 的 FimZ 和 FimY 進行協同作用(60)，結合上 fimA 的啟動子(promoter)，活化 fimA 表現出 FimA(70)，所以 ~ 16 ~.

(17) fimY、fimZ 為第一型線毛的正向調控因子(positive regulator)。fimU 則是一個 arginine tRNA，會辨認 UCU 密碼子(codon)，而 fimY 上具有 5 個 UCU 密碼子(58)，可能在轉譯的過程中，影響 FimY 的表現，進而調控 FimA 的表現。反之，若 S. Typhimurium 培養在不利於第一型線毛表現的環境， FimW 則會大量表現，並且與 FimZ 進行蛋白質交互作用( protein-protein interaction )，與 FimZ 互相結合，影響 FimZ 活化 fimA，因而抑制了 FimA 的表現，使得第一型線毛無法表現出來。因此 fimW 為第一型線毛的負向調控因子(negative regulator) (12, 60)。第一型線毛的分子量大小，約 35 kDa (59)。 FimA 是第一型線毛結構中最主要的線毛次單元蛋白質結構(12, 30, 59)，分子量大小約為 21 kDa，其他類似的次要的線毛蛋白質結構還有 FimI (18kDa)、 FimF (18kDa)和 FimH (36kDa)，但表現量都較 FimA 少。經過轉錄轉譯後，細胞膜間的 FimC 是一種 chaperone，線毛的次單位蛋白質會與 FimC 結合並運送到細胞膜外。FimD 則是一種 usher protein，FimD 則負責引導 FimA 輸送出細胞膜。FimA 在細胞表面會堆積成線狀。因此，FimC 和 FimD 是屬於運輸和合成的作用。而 FimH 會接合在線毛周圍，具有甘露糖感受性(mannose -sensitive)，此位置主要是負責與寄主細胞做吸附的作用，因為當 fimH 被剔除掉後，會使得第一型線毛無法吸附在寄主細胞上(35, 59)。. ~ 17 ~.

(18) 六、先前研究- 突變株資料庫的建立. 1. 建立目的第一型線毛的表現受到 fim 操作組的調控，而本實驗室想要探討除了 fim 操作組外的基因，還有哪些基因，也會影響第一型線毛的表現。因此，本實驗室利用 Salmonella Typhimurium LB5010 建立了一個突變株資料庫(11)。. 2. 建立方法首先利用電穿孔的方式，將攜帶抗藥性基因(kanamycin, KAN-2)的跳躍子(transposon)送入 Salmonella Typhimurium LB5010 的基因體中，以進行插入性突變。將完成電穿孔的菌液，塗在含有抗生素的固態培養基上(kanamycin 50µg/ml)，篩選出成功將 KAN-2 插入基因體的菌株，此步驟一共建立了七千多株突變株。接著靜置培養在液態培養基上 48 小時，固態培養基上 24 小時，利用凝集試驗的方式，篩檢出線毛表現異於 parental strain 的菌株。然後再經由南方點墨法(southern blotting)，篩檢出只有一個基因被跳躍子插入的突變株。利用 DNA Walking SpeedUp™ Premix Kit 將細菌菌體的 DNA 做 PCR，以套組中所附的引子和特殊的引子 Kan-5(TSP1)、 Kan(TSP2)、Kan(TSP3)經過三次的 PCR 後，將產物委外定序，以判定所被突變的基因位置，最後整理出一個突變株資料庫(11) 。. ~ 18 ~.

(19) 3. 建立結果經過以上步驟，在靜置的液、固態培養基皆會表現線毛的突變株共四十四株；反之，皆不表現線毛的突變株共三十八株。. 七、本實驗研究方向. 本實驗挑選上述突變株資料庫中(11)，被突變的基因並非會直接調控線毛表現的基因的突變株之一，Salmonella Typhimurium ubiB 作為研究的主題。S. Typhimurium ubiB 在凝集試驗的表現，在靜置的固、液態培養基皆會表現線毛。ubiB 的功能被認為是轉譯成 NADP(H) reductase 或 flavin reductases(25)，其蛋白質結構上面，擁有四個相同的 domain，每個 domain 是由一個 FAD-binding_6 domain 和一個 NAD(P)H-binding_1 domain 所組成，與 Porphyrin 和 Chlorophyll 代謝有關，參與 coenzyme B12 的合成。 B12 ( Cyanocobalamin，CNCbl)是構成 coenzyme B12 的基本架構，而 coenzyme B12 的結構可分為三個部份，一個 central ring、一個 adenosyl moiety 和一個 nucleotide loop(52)。位於 B12 的 corrin 環中心帶有三價的鈷離子(Co3+)。Co3+經由 cob(III)alamin reductase 和 cob(II)alamin redutase 的兩次單一電子還原後形成 Co1+(65)，利用 ATP:co(I)rrinoid adenosyltransferase (CoA)與 5’-deoxyadenosyl (Ado) group 結合成 C-Co 的 beta ligand (upper ligand)，而 ubiB 參與第一次還原的過程，協助將 Co3+還原成 Co2+。接著，Ado-Cbi 再與 5, 6-dimethybenzimidazole (DMBI) 合成 coenzyme B12 (Adenosylco~ 19 ~.

(20) balamin, Ado-Cbl)，如 Fig. 3 所示 (24, 52)。因此，ubiB 基因受損則會影響到 coenzyme B12 的回收再利用(24)。當 ubiB 被利用跳躍子 Kan-2 基因插入而造成突變之後，使得原本不會表現第一型線毛的環境(固態培養基)，卻大量表現線毛。本實驗主要是探討沙門氏菌 ubiB 突變株的特性以及與 fim 基因表現的關聯性。. ~ 20 ~.

(21) 第二章材料與方法. 本實驗所使用之菌株、質體及引子，如 Table 2、3 所示。. 一、第一型線毛的測定. 比較 S. Typhimurium ubiB 在靜置培養的 LB 液態培養基中，與 LB 的固態培養基中，第一型線毛的表現凝集試驗. A. 3%白色念珠球菌(Candida albicans)製備. 自-80℃冰箱取出白色念珠球菌的保存株，均勻地塗滿 YM agar (Difco, Franklin Lakes, NJ USA)，在 30℃的環境下培養 48 小時。利用無菌的接種環，將已長滿的白色念珠球菌自 agar 上全數刮下，懸浮入含 10 ml 1× phosphate buffer saline (PBS:13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 10.14 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4) 的 15ml 離心管中，混合均勻後離心 10 分鐘，倒掉上清液，此洗淨步驟共重複三次。三次洗淨後，依照念珠菌的體積，加入適當量的 PBS，配製成 3% (vol/vol)的白色念珠球菌液。. ~ 21 ~.

(22) B. 3%甘露糖(mannose)製備. 取 0.3 g 甘露糖(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的粉末，溶入 10 ml 的 ddH2O 中。將甘露糖溶液利用過濾膜(filter) 過濾。. C. 培養細菌條件. 在 37℃環境下，將單一菌落分別接種在 LB 液態培養基（Acumedia Inc., Lansing, MI, USA）靜置培養 48 小時、LB 固態培養基（Acumedia）中培養 24 小時。. D. 凝集試驗方式. 將培養好的細菌，皆以 300µl 的 1×PBS 製備成懸浮液。在玻片上利用油漆筆畫出左右等大的兩個圓圈，分別滴入 30µl 的 3%白色念珠菌液、30µl 的待測菌液，或者 30µl 的 3%甘露糖的溶液當作控制組。菌液混合完全後，震盪搖晃觀察混合液是有否出現凝集現象。. E. 序列稀釋菌液進行凝集試驗. 將待測菌液利用 PBS 進行二倍稀釋 (2-fold dilution)來進行凝集試驗，觀察凝集的片段的差異。 ~ 22 ~.

(23) 二、突變株回覆試驗. A. 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction). 利用 PCR 的方式將 ubiB 自 S. Typhimurium LB5010 的 genomic DNA 中，利用引子 ubiB-F, R 增幅出來。取 1μl DNA 做為模板 ( template )，加入 10 μM ubiB-F 及 ubiB-R 兩段引子，再加入 5 μl 10 × GeneTaq Buffer，1 μl 2.5 mM dNTPs，2U DNA 聚合酶 (GeneTaq DNA polymerase, Gene Mark, Taiwan)，加入 SDDW 使最後總體積為 50 μl。放入 PCR 加熱反應循迴器（GeneAmp® PCR System 2700, Applied Biosystems, Foster, CA, USA）上，設定 PCR 反應程式為：第一階段 94℃2 分鐘，第二階段以 94℃變性 DNA 1 分鐘 reaction， 52.6℃引子黏合 1 分鐘，72℃延展 1 分鐘，共 30 個循環，最後第三階段再以 72℃15 分鐘完成 PCR 反應。. B. 建立 pTA-ubiB. T4 DNA 接合酶(T4 DNA ligase)黏合 TA vecotor 和 ubiB 插入在 lacZ 中間，使得原本 TA vector 上的 lacZ 無法表現，進而無法代謝乳糖，pTA-ubiB 如 Fig 3 所示。接著，將建立好的質體 (pTA-ubiB)，轉型送入 E. coli DH5α 內。接著取 100µl IPTG (100mM) 和 40µl X-gal （20mg/ml）塗滿含有抗生素的固態培養基 (Ampicillin, 100µg/ml)。再將 E. coli DH5α-ubiB 塗滿上述固態培養基，隔日挑選白色的菌落，此菌落表示 insert 有成功的插入 vector 中。 ~ 23 ~.

(24) C. 建立回覆試驗菌株 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB). 取 S. Typhimurium ubiB 單一菌落接種在 3ml 的 LB-Kan 液態培養基中 (Kanamycin, 50µg/ml)，震盪培養在 37℃環境下，超過 16 小時。再取 30µl 菌液加入到 3ml 的 LB-Kan 液態培養基中，37℃ 環境下震盪培養，直到 OD600 = 0.2~0.4。以 13,000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 500µl 0.1M CaCl2，放在冰上 10 分中。加入 pTA-ubiB 1µl，輕輕搖晃使之混合，再放在冰上 45 分鐘。在 42℃ 水浴機加熱 2 分鐘後，快速放回冰上。待降溫之後，取出所有溶液，加入 5ml 的 LB 液態培養基中（LB broth），37℃環境下震盪培養大於 1 小時。離心 10 分鐘去除上清液，取剩下的些微菌液接種在 LB-Kan 固態培養基上，在 37℃環境下培養 16 小時。最後用凝集試驗來測試 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB)第一型線毛的表現情形。. 三、觀察 ubiB 沙門氏菌突變株 fim 基因組的表現量. A. 菌株. 取 S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB, S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)，接種在液態培養基和固態培養基中，先利用酵母菌凝集試驗來測試第一型線毛的表現，確認仍維持原來的表現型後，進行抽取 RNA 的步驟。 ~ 24 ~.

(25) B. 總 RNA 的製備. 1. 利用 RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）來抽取細菌的 RNA。先將細菌在 4℃環境下，離心(5,000 × g)5 分鐘，去除上清液後加入 100µl lysozyme-TE buffer(含 2 μl 的 20 mg/ml lysozyme)。室溫靜置 3~5 分鐘後，加入 350μl RLT(含 3.5μl βmercaptoethanol)（Amersco, Solon, OH, USA）)混合。高速 (13,000 rpm) 離心 2 分鐘，加入 250μl 酒精(99.5%)混合完全，將所有溶液轉移到 RNeasy spin column 內，以 10,000 rpm 離心 15 秒，去掉濾出的液體。加入 700μl RW1，再以 10,000rpm 離心 15 秒，去掉濾出的液體。加入 500μl RPE，以 10,000rpm 離心 15 秒，去掉濾出的液體，此步驟共重複兩次，第二次離心時間加長為 2 分鐘。高速(13,000 rpm)離心 1 分鐘，去除殘餘的酒精。以 1.5ml 微量離心管取代收集管，在 spin column 內加入 30~50μl 無 RNase 的水(0.1% DEPC 水)，以 10,000 rpm 離心 1 分鐘。. 2. 使用分光光度計(WPA BiowaveII, Isogen, Netherlands)以 OD260/280 測定 RNA 純度，用 OD260 計算 RNA 的濃度。. 3. 將等量的 RNA 利用取 1μl RQ1 DNaseI(1 U/μl, Promega, Madison, WI, USA)處理，去除可能存在的 DNA，避免干擾之後 RNA 反轉錄實驗的進行。. ~ 25 ~.

(26) C. 反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). 取定量 DNaseI 處理過的總 RNA (0.1µ g)，加入欲測的上下游引子 10µM，加入到 Fast-RunTM HotStart RT-PCR (AMV) kit （Protech, Taipei, Taiwan）的 RT-PCR Tube 中，並加入 RNase free 的 SDDW，使體積達到 20µ l。將處理好的 tube，放入 PCR 加熱反應循環器（GeneAmp® PCR System 2700, Applied Biosystems, Foster, CA, USA）上。. 1. 合成第一股 cDNA 先加熱至 58℃5 分鐘使 RNA 變性，42℃合成 cDNA 30 分鐘，94℃去除 AMV RT 活性以及變性 RNA、cDNA、引子 2 分鐘。. 2. PCR 反應 94℃30 秒變性 cDNA，50-65℃ (依不同引子而改變)引子黏合 30 秒，72℃伸展 1 分鐘，共 35 個循環，再以 72℃作用 5 分鐘使反應完全。. ~ 26 ~.

(27) 四、生長曲線. A. 分別取單一菌落的 S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB, S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)，各自培養在 3ml 的 LB、 LB-Kan(Kanamycin, 50µl/ml)、LB-Amp（Ampcillin, 100µl/ml）液態培養基中，在 37℃環境下震盪培養 18 小時。. B. 將已培養好的菌液，利用分光光度計 OD600 測定菌液濃度。利用 LB 液態培養基調整菌液成為相同濃度後，各取 1ml 加入 50 ml LB 液態培養基內，每隔兩個小時測定一次吸光值 OD600，連續測 24 小時。此實驗重複三次，取各吸光值平均做比較。. 五、觀察 ubiB 突變株線毛的表現情形. A. 穿透式電子顯微鏡樣品製備. S. Typhimurium LB5010、 S. Typhimurium ubiB、 S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)個別培養在液態培養基 48 小時，固態培養基 24 小時後。離心沈澱後，去除上清液，再用 1× PBS 懸浮菌液，取適量的菌液加入 2% Paratormaldehyd、2.5% Gluardialdehyd 和 0.2M cacodylate。混合均勻後，再用 1× PBS 清洗一次，取適量菌液滴在碳膜強化的銅網上，利用濾紙吸去 ~ 27 ~.

(28) 多餘水分。加入 1% phosphotungstate（PTA），染色 10 秒鐘，利用濾紙吸去多餘的染液，待乾後即可用穿透式電子顯微鏡 (Transmission electron micrographs, TEM, Hitachi H-600, Tokyo, Japan)觀察沙門氏菌的線毛。. ~ 28 ~.

(29) 第三章結果. 一、第一型線毛的測定. A. 凝集試驗. S. Typhimurium LB5010 培養在靜置液態培養基 LB broth 48 小時，會產生第一型線毛，使之與 Candida albicans 產生凝集的片段。反之，培養在固態培養基 LB agar 24 小時，則不會出現凝集片段。而 S. Typhimurium ubiB 在兩種不同的培養環境下，卻發現皆與 Candida albicans 產生凝集的片段。S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)在經過凝集試驗後的結果，發現在靜置液態培養基下，會產生凝集片段，而在固態培養基則無。凝集結果如 Table 4 所示。. B. 序列稀釋凝集試驗. 將不同細菌株依序列稀釋後，來做凝集試驗，觀察凝集的反應。結果發現，培養在 broth 環境下的菌株，S. Typhimurium LB5010 和 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB)皆在稀釋到第 16 倍時凝集反應就消失; 在 agar 上則沒有凝集的產生。S. Typhimurium ubiB 不論在 broth 或 agar 在稀釋第 4 倍的時候，就發現沒有凝集的現象。序列稀釋凝集結果如 Table 5 所示。 ~ 29 ~.

(30) 二、. 觀察 ubiB 沙門氏菌突變株 fim gene cluster 的表現量. S. Typhimurium ubiB 在固態培養基上測出有第一型線毛的表現，認為 ubiB 被突變之後，會影響 fim gene cluster 的表現。因此利用 one-step RT-PCR 比較 S. Typhimurium ubiB 的 fim 基因 RNA 的表現量是否與 S. Typhimurium LB5010 有差異。結果發現，培養在 broth 中的 S. Typhimurium LB5010、 S. Typhimurium ubiB、 S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)的 fimA 皆會表現。然而，在 agar 上卻只有 S. Typhimurium ubiB 會表現 fimA。調控 fimA 的 regulator 基因，fimZ、fimY、fimW。在 broth 中，三株 fimZ、fimY RNA 的表現皆相似。在 agar 上，S. Typhimurium LB5010 和 S. Typhimurium ubiB 所轉錄出的 fimZ 較 S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)多，但 fimY 則都沒有測到有 RNA 的表現。fimW 則是只有在 broth 環境下的 S. Typhimurium LB5010 有些微出現，其他則都沒有測得 fimW 的 RNA，RT-PCR 的結果如 Fig 4 所示。. 三、. 生長曲線. 培養細菌的過程中發現，S. Typhimurium ubiB 生長的速度相較於 S. Typhimurium LB5010 慢許多，而且有沉澱的現象。故利用 S. Typhimurium LB5010、S. Typhimurium ubiB 和 S. Typhimurium ubiB (pTA -ubiB)分別養在 100mL LB broth 上，震盪培養在 37℃的環境下，每兩. ~ 30 ~.

(31) 個小時取 1mL 出來利用分光光度計測吸光值 OD600，比較吸光值是否有產生差異。結果發現，S. Typhimurium LB5010 的生長速度在時間點第 2 小時進入對數生長期，第 12 小時進入平原期。S. Typhimurium ubiB (pTA -ubiB)在剛開始測量的第 4、6、8 小時，生長較 S. Typhimurium LB5010 慢，但之後的幾個小時與 S. Typhimurium LB5010 有相似的結果。而 S. Typhimurium ubiB 則在時間點第 6 小時進入對數生長期，之後呈現緩慢的增殖，所測得的 OD 值在第 6~16 小時間出現平緩的上升，第 18 小時進入平原期，相較於 S. Typhimurium LB5010 晚了 2 個小時。結果見 Fig. 5。. 四、. 電子顯微鏡觀察. 利用穿透式電子顯微鏡(TEM)，觀察線毛表現的情形。分別觀察 S. Typhimurium LB5010、S. Typhimurium ubiB 和 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB)的線毛表現情形。結果發現，在靜置液態培養基中，三株菌株菌體外均有表現線毛，如 Fig. 6、7、9 所示。然而，在固體培養基上則只有 S. Typhimurium ubiB 會表現線毛，如 Fig. 8 所示。其他菌株則沒有線毛表現，如 Fig. 10 所示。利用拍照後的照片，依照比例尺來按比例計算三隻菌株線毛表現平均的長度。自每隻菌株上，隨機取 10 根線毛，計算其平均線毛長度，結果如 Table 6 所示。. ~ 31 ~.

(32) 第四章討論. 大部分細菌所表現的線毛，與紅血球、植物、真菌細胞具有很強的親和力，因此在同一培養環境下的同一菌株，即使只有少部份的細菌有表現線毛，仍然很容易可以用血清凝集試驗測得到(18, 19)。而第一型線毛也很容易吸附在細胞上，在 1966 年時的 Duguid 等人發表的報告顯示，隨著同一環境下繼代培養的菌株，表現第一型線毛的細菌群體會增加(18)。本篇論文主要研究 S. Typhimurium ubiB 表現第一型線毛與 S. Typhimurium LB5010 的差異，可發現第一型線毛在靜置的 LB borth 和 LB agar 皆可表現出第一型線毛。利用載體 pTA 將 ubiB 完整的基因送回突變株後，發現回復成與 S. Typhimurium LB5010 相同的表現型，也就是在靜置 LB broth 中會表現第一型線毛，而在固態培養基不表現第一型線毛，因此可確定突變 ubiB 的確是會影響第一型線毛的表現。然而將細菌株依序列稀釋，發現 S. Typhimurium ubiB 突變株凝集現象在稀釋到第 4 倍時，卻看不出來有凝集的現象，但 S. Typhimurium LB5010 和 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB)在稀釋到第 16 倍時才看不見凝集的現象。因此，推測可能是 S. Typhimurium ubiB 表現第一型線毛的量較少，所以到了第 4 倍稀釋之後，沒有足夠的線毛與酵母菌結合，因此無法產生足夠的凝集現象可被觀察。然而，利用穿透式電子顯微鏡觀察線毛的結果卻發現，在 broth 中，三隻菌株線毛的平均長度皆相似。在 agar 上，只有 S. Typhimurium ubiB 表現線毛，但其線毛長度為在 broth 上線毛長度二分之一左右。由於具有 mannose. ~ 32 ~.

(33) sensitive 特性的 FimH 會平均散佈在線毛上，若線毛越短，則能與酵母菌進行凝集的 FimH 也較少，因此可能出現當細菌菌株依序列稀釋後，S. Typhimurium ubiB 凝集片段較少的趨勢。然而，在 1999 年 Thankavel 等人所做的第一型線毛模型卻指出(59)，FimH 只有在第一型線毛的頂端才具有 mannose sensitive 的特性，所以凝集試驗的強弱，會依線毛表現的多寡而產生差異。因此，需利用 RT-PCR 來確定 FimH 的表現量。之前的研究指出，第一型線毛會增強 E. coli 的致病力(13)。當第一型線毛表現在 E. coli 時，會使 E. coli 增加老鼠尿道感染的機會，並且誘發免疫反應。反之，缺乏第一型線毛或缺乏第一型線毛上 FimH 蛋白質的 E. coli，則會大幅降低 E. coli 在尿道上的存活率，並且減少發炎反應(13)。然而在 S. Typhimurium 上，第一型線毛負向調控因子 fimW 基因受 transposon 插入時，會使得第一型線毛持續表現，會增加入侵寄主細胞的作用，但卻發現 fimW 失去功能後，則會降低沙門氏菌 SP1-TTSS 所分泌的蛋白質 SipB、SipC 的分泌，FimW 影響 SipB、 SipC 的機制目前還不清楚，相關的研究還在進行(22)。利用 RT-PCR 的方式，將 fim gene cluster 上的基因增幅出來，觀察表現的差異。S. Typhimurium LB5010 和 S. Typhimurium ubiB (pTA-ubiB)，只能在 broth 表現 fimA，agar 上沒有表現。而 S. Typhimurium ubiB 卻可在 broth 和 agar 上表現大量的 fimA 的 RNA。利用 TEM 可看到，S. Typhimurium ubiB 在 agar 上有出現類似頭髮的線狀構造，並且又可利用凝集試驗觀察到凝集現象。因此，可判定 S. Typhimurium ubiB 的第一型線毛可在 agar 上表現。在測定 RNA 表現上，利用 RT-PCR 所測得的結果可得知，fimA ~ 33 ~.

(34) 在 broth 中，三株菌株皆表現出來，S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) 甚至高於 S. Typhimurium LB5010 約 1.36 倍；但在 agar 上的表現，S. Typhimurium ubiB 的 fimA 表現得比其他兩株多，其他兩株甚至不表現。這可確認 S. Typhimurium ubiB 的 fimA 在 agar 上確實有被表現出來，再加上凝集試驗的結果，可知 S. Typhimurium ubiB 的第一型線毛的確在 agar 上有被表現出來。正向調控 fimA 表現的基因 fimZ 在 broth 中三株菌株都可利用 RT-PCR 測得，但在 agar 上，則是 ubiB 突變株的 fimZ 表現較其他兩株多，這可能說明 S. Typhimurium ubiB 在 agar，表現較多的 fimZ，可使得 fimZ 正向調控 fimA 的表現，所以 fimA 因此而表現較多。同樣也是正向調控 fimA 表現的 fimY 在 broth 上，三株皆會表現，但在 agar 則皆不表現，此結果與之前的研究不同。在之前的研究指出，FimZ 會和 FimY 進行協同作用，結合上 fimA 的啟動子上，正向調控 fimA 的表現(70)。若是將 fimZ 或 fimY 任一基因剔除，則不表現第一型線毛。S. Typhimurium ubiB 的 fimZ 有表現，原本要和 FimZ 進行協同作用的 FimY 沒表現，推測可能是其他蛋白質可取代 FimY 蛋白質的功用，因此讓第一型線毛可以在 agar 的培養條件表現出來。負向調控 fimA 表現的 fimW，只有在培養在 broth 上的 S. Typhimurium LB5010 有表現出來，其他菌株皆沒有表現；在 agar 則三株皆沒有產生 fimW，推測 FimW 對第一型線毛表現的影響可能有限，可能是在第一型線毛表現時，才會被表現出來，藉以限制第一型線毛表現過多。自然界中，只有細菌或古生菌(archaea)可以使用且合成 B12，動物只能利用 B12 不能自行合成 B12，植物和真菌則不產生及不利用 B12 (52)。Coenzyme B12(adenosylcobalamin，AdoCbl)的中心，是含鈷(Co) ~ 34 ~.

(35) 的 terapyrrolidine 或 pyrroline 環狀結構。Pyrroline 只在原核生物合成，其生合成(biosynthesis)可分為有氧合成(aerobic or oxygen-dependent pathway)，與無氧合成(anaerobic or oxygen -independent pathway)，負責進行有氧合成 B12 的基因稱為 cob；反之，則稱為 cbi。有無氧合成的差異在 Co2+插入 corrin 環的時間(有氧，Co2+進入 corrin 環較晚；無氧 Co2+進入 corrin 環較早)(39)。有趣的是，在本實驗室之前所建立的突變株資料庫中，cbiA 也是參與 coenzyme B12 的合成，此突變株培養在本實驗設定的兩種環境下，皆會產生第一型線毛，但 CbiA 與 UbiB 參與製造 coenzyme B12 的途徑並不相同。不同於 ubiB 製造 coenzyme B12 的途徑，是以 Cbi 所構成的 B12 會經由下列三步驟合成 coenzyme B12。 1. 自細包膜外汲取 Cbi S. Typhimurium 在細胞外汲取 corrinoids(如 cobinamide，Cbi 或 cobyric acid，Cby)，利用革蘭式陰性菌特殊的 B12 uptake system (BtuBFBCD)運送 corrinoids 到細胞內，作為形成 B12 的 central ring (2)。 2. Cbi 與 Ado 形成 upper ligand CobA(ATP:co(I)rrinoid adenosyltransferase)幫助 Cbi 與 Ado 合成 AdoCbi，產生 upper ligand(9, 23, 56)。接著 CobU 會給與 GDP 使之成為 AdoCbi-GDP。 3. AdoCbi-GDP 與 DMBI 合成 lower ligand DMBI 來自 FMN，經由 CobS(AdoCbi-5’-P)與 AdoCbi-GDP 結合會形成 lower ligand(37)，最後形成具活性的 Ado-Cbl (coenzyme B12)。 ~ 35 ~.

(36) 因此，當 cbiA 基因受損時，則也會影響到 coenzyme B12 的合成途徑之一。上述 coenzyme B12 合成的途徑，經由突變 cbi family 的方式，可個別阻斷，可推測 coenzyme B12 製造與否，可能會影響到線毛的表現。 Coenzyme B12 主要在細胞膜內作用，主要有兩個具活性的型態， AdoCbl 和 MethCbl，可參與多項生化反應。大部分的腸道菌(除了 E.coli 外)，對 1,2-propanediol、ethanolamne 和 glyerol 行無氧發酵作用時，必須要 coenzyme B12 的參與(1, 36)。其中，在部份細菌裡 1,2-propanediol 和 ethanolamne 的發酵作用，可分別產出 propionyl-CoA 和 acetyl-CoA，可行呼吸作用產出能量(44)。因此，當 UbiB 或 Cbi 無法正常在細胞膜內表現時，可能會影響 coenzyme B12 的再生或生成 (21, 24)，使產生能量的途徑出現缺陷，進而導致 S. Typhimurium ubiB 突變株的生長速率較 S. Typhimurium LB 5010 慢。在許多細菌中，如 Salmonella、Klebsiella、 Shigella、Yersinia、 Listeria、 Lactobacillus 和 Lactococcus 的生長是分解體內的 1,2-propanediol，來製造生長所需的能量(33, 61)，而 1,2-propanediol 是植物細胞壁、細菌外多醣體(exopolysaccharides)和腸道上皮細胞 glycolconjugate rhamnose 上常見的醣類 rhamnose 和 fucose 發酵作用後的產物(44)。1,2-propanediol 在無氧的環境下分解，動物大腸腸道、河水沉積物和深層土壤裡等地，適合此發酵作用的進行。然而， 1,2-propanediol 分解成 propionaldehyde，需要 coenzyme B12 的參與，並且在 microcompartments 內進行，以避免分解後具毒性的產物 propionaldehyde，會對細菌產生毒性(53)。因此，當 coenzyme B12 缺乏時，會使得 coenzyme B12-dependent diol dehydratase 產生能量的 ~ 36 ~.

(37) 1,2-propanediol 分解作用會受到影響，使得細菌處於嚴峻的環境。之前的研究指出，當沙門氏菌處在嚴峻的環境下，為了存活下來，會導致線毛的表現，甚至會形成生物膜(biofilm)以達到在沒有或稀少養分的環境下存活的目的(68)。 ubiB 會影響到 coenzyme B12 的再生，可能因此而影響到第一型線毛的表現。之前的研究指出，當 S. Typhimurium 處在壓力下的環境，可能會使得線毛表現出來，推測 UbiB 會間接或影響第一型線毛的表現與否，但是能量代謝與第一型線毛表現的相關機制，是否還有其他基因參與目前還不清楚，研究應持續進行下去。. ~ 37 ~.

(38) 參考文獻 1.. Abeles, R. H., and H. A. Lee, Jr. 1961. An intramolecular oxidation-reduction requiring a cobamide coenzyme. J Biol Chem 236:2347-50.. 2. Bassford, P. J., Jr., and R. J. kadner. 1977. Genetic analysis of components involved in vitamin B12 uptake in Escherichia coli. J Bacteriol 132:796-805. 3. Baumler, A. J., A. J. Gilde, R. M. Tsolis, A. W. van der Velden, B. M. Ahmer, and F. Heffron. 1997. Contribution of horizontal gene transfer and deletion events to development of distinctive patterns of fimbrial operons during evolution of Salmonella serotypes. J Bacteriol 179:317-22. 4. Baumler, A. J., R. M. Tsolis, F. A. Bowe, J. G. Kusters, S. Hoffmann, and F. Heffron. 1996. The pef fimbrial operon of Salmonella typhimurium mediates adhesion to murine small intestine and is necessary for fluid accumulation in the infant mouse. Infect Immun 64:61-8. 5. Baumler, A. J., R. M. Tsolis, and F. Heffron. 1996. The lpf fimbrial operon mediates adhesion of Salmonella typhimurium to murine Peyer's patches. Proc Natl Acad Sci U S A 93:279-83. 6. Bishop, R., P. Fields, and C. R. Braden. 2007. Salmonella Surveillance: Annual Summary, 2005. Centers for Disease Control and Prevention Division of Foodborne, Bacterial and Mycotic Diseases, Atlanta, Georgia: US Department of Health and Human Services. 7. Brennan, M. A., and B. T. Cookson. 2000. Salmonella induces macrophage death by caspase-1-dependent necrosis. Mol Microbiol 38:31-40. 8. Brenner, F. W., R. G. Villar, F. J. Angulo, R. Tauxe, and B. Swaminathan. 2000. Salmonella nomenclature. J Clin Microbiol 38:2465-7. 9. Buan, N. R., and J. C. Escalante-Semerena. 2005. Computer-assisted docking of flavodoxin with the ATP:Co(I)rrinoid adenosyltransferase (CobA) enzyme reveals residues critical for protein-protein interactions but not for catalysis. J Biol Chem 280:40948-56. 10. Bullas, L. R., and J. I. Ryu. 1983. Salmonella typhimurium LT2 strains which are r- m+ for all three chromosomally located systems of DNA restriction and modification. J Bacteriol 156:471-4. 11. Chen, Y.-T. 2006. Analysis of the genetic elements that may affect the type 1 fimbrial phase variation in Salmonella enterica serotype Typhimurium. master thesis, Taipei Medical University 12. Clegg, S., L. S. Hancox, and K. S. Yeh. 1996. Salmonella typhimurium fimbrial. ~ 38 ~.

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(44) Fig. 1. Genetic organization of the S. Typhimurium fim gene cluster.. The predicated size of the Fim polypeptides are given in kilodaltons (kDa), under the arrows. The functions of the genes are indicated as follows: fimA: major fimbrin, fimI: minor fimbrin, fimC: chaperone, fimD: usher, fimH: adhesion, fimF: minor fimbrin, fimZ: regulator, fimY: regulator, fimW: regulator, fimU: arginine tRNA.. ~ 44 ~.

(45) Fig. 2. The regulatory network of fim genes in S. Typhimurium.. ~ 45 ~.

(46) Fig. 3. The structure of vitamin B12 and coenzyme B12. (Martens et. al, 2002). ~ 46 ~.

(47) Fig. 4. The recombinant plasmid pTA-ubiB .. ~ 47 ~.

(48) Fig. 5. RT-PCR for fim transcription. RT-PCR assays were used. to monitor fimA, fimY, fimZ, fimW, and 16S rRNA transcription in the S. Typhimurium LB5010, ubiB mutant, and ubiB(pTA-ubiB) strains under static broth and solid agar culture conditions. The intensities of the bands for each strain were determined by densitometry and express (Arabic number) relative to the value of respective fim transcription obtained from static broth culture condition.. The intensities of 16S rRNA shown. indicate that equivalent amounts of total RNA were used in the experiment. ~ 48 ~.

(49) Fig. 6. Growth curve of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium. ubiB and S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) grown in shaking LB broth at 37℃ for 24hours. ~ 49 ~.

(50) Fig. 7. S. Typhimurium LB5010 produced type 1 fimbriae when. cultured in LB static broth at 37℃ for 48 hr.. ~ 50 ~.

(51) Fig. 8. S. Typhimurium ubiB strain produced type 1 fimbriae when. cultured in LB static broth at 37℃ for 48 hr.. ~ 51 ~.

(52) Fig. 9. S. Typhimurium ubiB strain produced type 1 fimbriae when. grown on LB agar at 37℃ for 24 hr.. ~ 52 ~.

(53) Fig. 10 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) produced type 1 fimbriae when grown in LB static broth at 37℃ for 48 hr.. ~ 53 ~.

(54) Fig. 11 S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) did not produce type 1 fimbriae when grown on LB agar at 37℃ for 24 hr.. ~ 54 ~.

(55) Table 1 Characteristics of Salmonella fimbriae. Fimbrial class. Fimbrial name. nation reaction. determinant Operon. Location. fim. C. R. MS. Type 3. F. MRTE. Type 4. F. MRTE. F. NH. agf. C. R. ?. lpf. C. ?. pef. P. saf. C. Type 1. GVVPQ. NC. NC NC. F1. Morphology. Genetic. Haemaggluti-. Thin aggregative fimbriae Long polar fimbriae Plasmid-encoded fimbriae Atypical fimbriae. NC, not classified; R, rod shaped; F, fimbrillar; MS, mannose-sensitive; MRTE, mannose-resistant with tanned erythrocytes; MRFE, mannose-resistant with fresh erythrocytes; C, chromosome; P, plasmid. ~ 55 ~.

(56) Table 2 Strains and plasmids used in this study. Strain or plasmid. Genotype or relevant features. Reference or source. LB5010. Wild Type. (10). ubiB. LB5010 ubiB:kan, Kanr. This study. ubiB(pTA-ubiB). LB5010 pTA-ubiB, Ampr. This study. F- (80d lacZ M15)(lacZYA-argF) U169 hsdR17(r- m+)recA1 endA1 relA1 deoR. RBC, Taiwan. 988 bp DNA fragment containing. This study. S. Typhimurium. E. coli DH5α. Plasmid pTA-ubiB. ubiB cloned into yT&A; Ampr yT&A Clon-. Cloning vector Apr, lacZα gene. ing Vector. ~ 56 ~. RBC, Taiwan.

(57) Table 3 The primers used in this study.. Name. Sequence (5’-3’). ubiB-F. GATCTCGCGGATCCGGTCGTCCTATTGTTAAAGATCCTGA. ubiB-R. GTGAACATGCATGCCGCAATACAAAGCCTGTAGATATTCA. 16S1. TTCCTCCAGATCTCTACGCA. 16S2. GTGGCTAATACCGCATAACG. fimA1. ACTATTGCGAGTCTGATGTTTG. fimA2. CGTATTTCATGATAAAGGTGGC. fimW2-1 AAAGTGAAAGTAAAGCGG fimW2-2 AAGAGATAGATAATGCCG fimY1. GAGTTACTGAACCAACAGCT. fimY2. GCCGGTAAACTACACGATGA. fimZ2-1. CGGCAATTTCTTTGTT. fimZ2-2. CTGTTATCATTATGGACGA. ~ 57 ~.

(58) Table 4 Agglutination of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB and S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB). Strains. Broth. Agar. S. Typhimurium LB5010. ＋. －. S. Typhimurium ubiB. ＋. ＋. S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB). ＋. －. ＋: Yeast agglutination test positive －: Yeast agglutination test negative. ~ 58 ~.

(59) Table 5 Dilution of Agglutination. Strains Dilution Strains. 1×. 2×. 4×. 8×. 16×. & culture condition S. Typhimurium. Broth. ＋＋＋. ＋＋＋. ＋＋. ＋. －. LB5010. Agar. －. －. －. －. －. S. Typhimurium. Broth. ＋＋＋. ＋＋＋. －. －. －. ubiB. Agar. ＋＋＋. ＋＋. －. －. －. S. Typhimurium. Broth. ＋＋＋. ＋＋. ＋. －. ubiB(pTA-ubiB). Agar. －. －. －. －. ＋: Agglutination test positive －: Agglutination test negative. ~ 59 ~. －.

(60) Table 6 The fimbrial length of S. Typhimurium LB5010, S. Typhimurium ubiB, S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB) strains. culture condition. S. Typhimurium LB5010. Broth Broth Agar Broth Agar. S. Typhimurium ubiB S. Typhimurium ubiB(pTA-ubiB). ~ 60 ~. Average fimbrial length (nm) 950 927.8 502.9 882.1 No expression.

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