探討C型肝炎病毒蛋白及細胞因子PTB對C型肝炎病毒複製機制之調控

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

探討 C 型肝炎病毒蛋白及細胞因子 PTB 對 C 型肝炎病毒複製

機制之調控

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC93-2314-B-039-029-

執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日

執行單位： 中國醫藥大學醫事技術學系

計畫主持人： 鄭如茜

計畫參與人員： 黃景堂 葉維洲

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 10 月 31 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

■ 成 果 報 告

□期中進度報告

探討 C 型肝炎病毒蛋白及細胞因子 PTB 對 C 型肝炎病

毒複製機制之調控

The functional role for the interaction between hepatitis C

viral protein and polypyrimidine binding protein in HCV

replication

計畫類別：■ 個別型計畫

□ 整合型計畫

計畫編號：NSC 93－2314－B－039 －029－

執行期間：2004 年 8 月 1 日至 2005 年 7 月 31 日

計畫主持人：鄭如茜

計畫參與人員：黃景堂、葉維洲（碩士班研究生兼任助理）

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告

□完整報告

中文摘要

關鍵字：C 型肝炎病毒、複製酶、細胞因子 PTB

C 型肝炎病毒的基因體為一正向單股線狀的 RNA 分子，約 9.5 kb，除 5

’

端及

3’

端非轉譯

區外，只含有一個開放編閱架構，可轉譯出一條約 3010 個胺基酸的多蛋白質先驅分子，經由

宿主和病毒自身蛋白酶切割成結構性蛋白質(core, E1, E2, p7)與非結構性蛋白質(NS2, NS3,

NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)。其中 NS5B 蛋白質為 C 型肝炎病毒進行複製的主要酵素，可與

病毒基因體

3’

端結合，進行病毒起始複製。細胞因子 PTB 曾被證實可結合於病毒基因體 5’

端

及

3’

端，本實驗室之前的研究證明，細胞因子 PTB 可與 NS5B 蛋白質結合。因此，本研究則

進一步探討，C 型肝炎病毒非結構性蛋白質 NS5B 與細胞因子 PTB 結合，在病毒複製中所扮

演的角色。

Abstract

Key Words: Hepatitis C virus, replicase, cellular factor PTB

Hepatitis C virus (HCV) is a single-stranded RNA virus and is a major pathogen for non-A,

non-B hepatitis. Structural analysis of the 9.5 kb HCV RNA genome indicates that, in addition to the

5’

-

a

nd

3’

- untranslation regions, there is only one open reading frame encoding an approximate

3010 amino acid polyprotein precursor that can be cleaved by the proteases originated from HCV

and host cells into structural (core, E1, E2, and p7) and non-structural (NS2, NS3, NS4A, NS4B,

NS5A, and NS5B) proteins.

Among the non-structural proteins, the NS5B protein has been shown

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HCV

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nds

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o

t

he

3’

-end of the HCV genome and initiates

virus replication.

We have demonstrated recently NS5B binds to a cellular protein PTB.

In this

study, we continue the efforts to characterize the functional significance of such protein interaction

of NS5B in HCV replication.

前言

細胞蛋白質 PTB 為 hnRNP 家族中的成員之一，又稱為 hnRNP I，分子量大約 57 kDa (1)，

可出現於細胞質或細胞核 (2)。其在水溶液中多以雙倍體或多倍體存在 (1)，每個單倍體具有

4 個辨識 RNA 的 motifs (3)。 PTB 具有運送 RNA 的功能 (2,4)，並參與 mRNA splicing 和 internal

ribosome entry site (IRES)轉譯作用 (1)。PTB 會與其他細胞蛋白質形成複合物(5)， 也與

poliovirus 、hepatitis A virus (6)、hepatitis C virus (7)等 IRES 有特異性結合，並調控病毒的轉

譯作用進行；與 mouse hepatitis virus RNA 結合可影響病毒轉錄但非轉譯作用(8)。

PTB 除了會與 C 型肝炎病毒 5’ 端非轉譯區產生交互作用，實驗顯示，PTB 也與 C 型肝炎病毒 3’ 端的 X 區域產生交互作用，並調控病毒的轉譯作用進行 (4,9) 。本研究室以 GST-NS5B 進行 pull down 實驗，結果顯示 PTB 確可與 NS5B 形成交互作用。進一步進行細胞內試驗，與細胞內生性 PTB 蛋白質 進行免疫沉澱試驗，之後以 FLAG 抗體進行西方墨點試驗，結果顯示，HCV NS5B 與 PTB 在細胞內依 然具有直接交互作用。 研究目的與重要性 目前已知 HCV NS5B RNA polymerase 單獨存在下便具有體外複製的能力，然此能力與模板的專 一性無關（10,11），其中 NS5A 的表現影響 NS5B 的聚合活性(12)，NS3 與 NS5B 及 NS5B 形成 oligomer 可協助 NS5B 辨認 RNA 模板(13 )。至於細胞因子參與病毒複製的角色則仍不清楚，有待進 一步的研究。我們的研究結果暗示， 與 HCV 基因體最 3’端保守區域 X 結合力最強的 PTB 可能藉由與 NS5B 結合的方式，將 NS5B polymerase 帶到病毒基因體複製起始位置，進行複製。此外，最近的研究發現，與 HCV 基因體 3’ 端 U rich 結合的 La 蛋白質可與 NS5A 形成交互作用，而 NS5A 與 NS5B 具交互作用，並被認為應該 與 HCV 複製調控有關（14）。由於病毒的複製一般需要病毒蛋白質間甚至病毒與宿主細胞因子之間的 協同作用才能完成 (15)，本研究進一步釐清 PTB 是否也與病毒複製起始複合物中其他蛋白質具交互作 用。

研究方法

以 Coimmunoprecipitation assay 探討 NS5B 與 PTB 在 HCV replicon stable cells 中交互作用的表現 及 HCV NS5B 與 PTB 交互作用的區域

為證明細胞因子的表現確實可影響 HCV NS5B 的酵素功能，本研究將選取細胞因子 PTB 之適當區 域設計，構築 RNAi 質體，轉染至病毒感染細胞或 replicon 細胞，以實驗室已建立的 real-time RT-PCR 技術，偵測細胞中 HCV RNA 量的改變，並試圖瞭解是否影響病毒複製或病毒轉錄。

研究結果

PTB 與 HCV 複製複合物共同坐落於 lipid raft 區域

PTB 與 NS5B 結合的位置在 N 端 1-329 個胺基酸

抑制 PTB 的表現可影響 HCV 的複製

Total RNA minus strand plus strand

R el at iv e ra ti o o f H C V R N A pU6 pU6-PTB43

3.

tract-binding protein: distinct nuclear localization and association with hnRNAs Nucleic Acids Res. 20:3671-3678.

4.

3'-untranslated region of the hepatitis C virus RNA genome. J Virol. 71: 8698-8706.

5.

protein interacts with HnRNP L. FEBS Lett. 425:401-406.

6.

nontranslated region of hepatitis A virus RNA. J Virol. 67: 6716-25

7.

of the hepatitis C virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation. J Virol. 69: 6367-6375

8.

translation of mouse hepatitis virus RNA. Virology. 303:58-68.

9.

virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence. Virology.

254:288-296

10.

RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. EMBO. 15:12-22

11.

polymerase capable of copying the full-length viral RNA. J. Virol. 73:7694-7702.

12.

virus NS5A binds RNA-dependent RNA polymerase NS5B and modulates RdRP activity. J. Biol. Chem.

277 :11149-55

13.

Rathnachalam R, Kirkegaard K, Colacino JM. 2002. Oligomerization and cooperative RNA synthesis

activity of hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J Virol 76:3865-3872

14.

phage display. Biochem Biophys Res Commun. 309:695-701.

15.

virus genome replication. J Virol.77:8181-8186.

計畫成果自評