山苦瓜萃取物暨其區分物對於痤瘡桿菌誘導發炎反應的影響

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(1)國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系碩士論文. 山苦瓜萃取物暨其區分物對於痤瘡桿菌誘導發炎反應的影響 Effects of wild bitter melon extracts on Propionibacterium acnes-induced inflammation 指導教授：蔡帛蓉博士研究生：李宥苡. ( Po-Jung Tsai, Ph.D.) ( You-Yi Li ). 中華民國 101 年 02 月.

(2) I.

(3) 誌謝從一開始什麼都懵懵懂懂，到現在對實驗小有心得，轉眼間研究所生涯也即將結束，過程中曾經因為走到死胡同、繞遠路而多花一些時間，但終究是走到了終點，雖然這兩年半並不是很順遂，甚至有時候走得有些坎坷與心酸，但在需要的時候還是能夠得到其他人的幫助，在此感謝這些在我生命中適時伸出援手的朋友。先感謝指導教授蔡帛蓉教授這兩年多的指導，不論是在學術研究抑或是待人處事都讓我學會了很多事情；感謝吳文惠教授與黃青真教授在論文撰寫的提點；也感謝蔡宗憲醫師、鄒嘉倫醫師與台大獸醫系切片室的曾姐在病理切片方面的協助。感謝學姐聰蓉在我進實驗室初期於實驗方面的引領，也感謝佑家在我最趕著做實驗的那一個月給予協助，讓我發現以前做實驗時忽略的細節，謝謝仲潔和育亭在需要的時候幫忙實驗的進行，也謝謝貼心的學妹鈺涵和雅欣，能夠有妳們這樣的學妹真的很幸運，也謝謝學長文程不吝惜分享做實驗的經驗，在此祝福你們往後的實驗都能順利圓滿。對於研究所期間一同努力、分享生活的好朋友佩郁和若涵，在此恭喜妳們也畢業了，能夠往人生下一個階段邁進，也祝福葵蓉和盈堤，都能夠順利完成自己的目標。另外要發自內心感恩陸續陪伴我將近四個月的小白和小小白們，從祢們身上觀察到很多有趣的現象，很抱歉讓祢們感覺到死亡的威脅而顫抖著，只能在心裡感激祢們的犧牲，希望祢們在另一個世界過的安穩。最後要感謝親愛的豐安，從大學到現在給予實質上的幫助、精神上的鼓舞、傾聽與陪伴，讓我有一個能夠真正傾訴心事、宣洩情緒的臂彎，也總是盡量撥空到實驗室陪我做實驗，真的很謝謝你，沒有覺得我很麻煩，總是很有耐心的陪我。感謝我的媽媽、爸爸和家人的支持，讓我覺得就算再累也有一個家在等我回去，也謝謝我們家的胖楓葉鼠大寶和小寶，在家修改論文的這段時間，每天用湯匙挖你們、餵你們吃東西總是帶給我很多樂趣。謝謝淑娟老師、柳錦老師和莫主任對我的關心，給了我很多鼓勵與繼續往前走的勇氣，也謝謝七王爺在我困惑的時候指點迷津，讓數度站在十字路口猶豫下一步該往哪個方向與遭逢低潮時一度感到灰心的我能夠找到該走的路，並且繼續走下去。「庭前葉落暮秋時，順風相送寶船歸」，過去兩年幾乎每天在實驗室待超過 8 小時甚至 12 小時以上的生活，現在想起來還真像一場夢般的虛幻，如今，句點即將畫下，再次感謝這段期間接觸的所有人、事、物，給予我許多成長與反思的機會。宥苡 III. 2012/02/12.

(4) 中文摘要痤瘡 (acne) 俗稱青春痘，其致病因子複雜。過度皮脂生成 (sebaceous hyperproduction)、毛囊過度角質化(follicular hyperkeratinization)、痤瘡桿菌增生 (Propionibacterium acnes colonization) 和發炎反應 (periglandular dermal inflammation)是重要的致病因子。其中痤瘡桿菌(P. acnes)被認為在痤瘡發展過程中扮演重要的角色， P. acnes 藉由活化單核球細胞 (monocytes) 與角質細胞 (keratinocytes)的 toll-like receptor，啟動下游的訊息傳遞路徑產生發炎介質誘導痤瘡發炎情形；另外 P. acnes 誘發產生活性氧分子(reactive oxygen species, ROS) 與基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMP) 亦參與發炎反應。苦瓜 (Momordica charantia)萃取物具有抗發炎、抗氧化能力。因此，本研究欲探討台灣山苦瓜(Momordica charantia Linn. var. abbreviata Ser.; wild bitter melon)萃取物是否具有抑制 P. acnes 生長與其誘發之發炎反應的效用。製備數種山苦瓜萃取物，收集山苦瓜樣品(育種之花蓮 1~4 號，67-11 品系與野生品種)之不同部位(果實、葉、藤)，果實以溶劑(乙醇、正己烷、乙酸乙酯和水)進行萃取，而葉以甲醇進行萃取。以 broth dilution method 實驗的結果發現 67-11 與野生品種葉、藤甲醇萃物能抑制痤瘡桿菌生長。以 P. acnes 刺激 THP-1 monocytes 的模式發現山苦瓜果實乙酸乙酯和乙醇萃取物與葉子甲醇萃物具 in vitro 抗發炎作用。為進一步探討山苦瓜果實萃取物之區分物(fractions)的抗發炎作用，取得皂化物、非皂化物、 oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, conjugated-linolenic acid, phytol 和 lutein，結果顯示不皂化物和 lutein 抑制 cytokine 和 MMP-9 表現量，皆具有 in vitro 抗發炎作用，而長鏈脂肪酸(oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, CLN)僅降低 IL-1β 濃度。另發現中鏈脂肪酸(capric acid 和 lauric acid)能夠減少 P. acnes 刺激 THP-1 monocytes 的 cytokines 產生。在 in vivo 抗發炎實驗，將 P. acnes 注射至 ICR 小鼠耳朵測試樣品的抗發炎能力，結果顯示山苦瓜果實 EA 萃物、capric acid、山苦瓜葉子甲醇萃物與總多酚萃取物能夠抑制 P. acnes 誘發的發炎反應與耳朵腫脹情形。綜合論述，山苦瓜果實 EA 萃物與葉子甲醇萃物在 in vitro and in vivo 實驗中顯示具有抑制 P. acnes 誘發的促發炎介質與小鼠耳朵腫脹情形，而果實 EA 萃物中含的 lutein 與葉子中含的總多酚可能是抗發炎的有效成份。關鍵詞：痤瘡、痤瘡桿菌、山苦瓜、發炎 IV.

(5) Abstract Acne vulgaris is a common skin disease involving pilosebaceous follicle. The pathogenesis of acne vulgaris is multifactorial, including increased sebum production, comedogenesis and Propionibacterium acnes proliferation. P. acnes plays an important role not only in the process of inflammation but in the formation of comedones. Previous studies have shown P. acnes would activate monocytes to secrete pro-inflammatory cytokines, some studies have found that matrix metalloproteinases (MMPs) will participate in the progression of acne. Wild bitter melon (Momordica charantia Linn. var. abbreviata Ser.) possesses numerous pharmacological actions such as antibacterial, antioxidant, anti-diabetic, and anti-inflammatory activities. The aim of this study was to evaluate the anti-microbial activity as well as in vitro and in vivo inhibitory effect of wild bitter melons extracts and carpic acid on P. acnes-induced inflammation. Our results showed that leaves and vine extracts from #67-11 and wild varirties of wild bitter melons effectively inhibited the growth of P. acnes. The ethyl acetate and ethanol extract from WBM fruit significantly reduced IL-8, TNF-α, IL-1β and MMP-9 levels by P. acnes-stimulated THP-1 cells. We further evaluated the fractions and composition of WBM fruit EA extract, the results showed that saponification and unsaponification fractions of WBM fruit, phytol, lutein, capric acid, and lauric acid can reduce cytokine levels. Unsaponification fraction of WBM fruit, lutein, and lauric acid can reduce MMP-9 protein levels. Fatty acids including oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid and conjugated linolenic acid reduced IL-1β production. In addition, ethyl acetate extract of WBM fruit, capric acid, methanolic extract and total phenol extract of WBM leaves reduced P. acnes-induced inflammation of mice ear and then showed in vivo anti-inflammatory activity. Our results suggested that wild bitter melon extracts have anti-inflammatory effects against P. acnes and may be useful in the adjuvant treatment of acne. Key words: acne, Propionibacterium acne, Momordica Charantia, inflammation. V.

(6) 目錄第一章緒論...............................................................................................1 壹、研究動機 ...................................................................................................... 1 貳、研究目的 ...................................................................................................... 2 . 第二章文獻探討 ......................................................................................3 第一節皮膚結構 ....................................................................................................... 3 第二節痤瘡的致病機轉 ........................................................................................... 5 壹、痤瘡的成因.................................................................................................. 5 貳、痤瘡桿菌與發炎反應.................................................................................. 7 (一) 細胞外基質(Extracellular matrix, ECM) .................................................. 10 (二) 基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) .............................. 10 參、誘發發炎的訊息傳遞路徑........................................................................ 12 肆、痤瘡與基質重塑(Matrix remodeling) ..................................................... 16 第三節痤瘡的治療 ................................................................................................. 18 第四節實驗材料 ..................................................................................................... 19 一、山苦瓜........................................................................................................ 19 二、脂肪酸........................................................................................................ 23. 第三章材料與方法 ................................................................................30 第一節實驗架構 ..................................................................................................... 30 (一) 抗菌與抗發炎評估.................................................................................... 30 (二) 萃物暨其區分物抗發炎評估.................................................................... 30 第二節樣品製備 ..................................................................................................... 31 第三節研究材料 ..................................................................................................... 32 一、藥品與試劑................................................................................................ 32 二、儀器設備與耗材........................................................................................ 34 三、細胞培養.................................................................................................... 35 四、細菌培養.................................................................................................... 36 第四節實驗方法 ..................................................................................................... 38 一、抑菌實驗.................................................................................................... 38 二、細胞存活率測定 (MTT) .......................................................................... 38 三、抗發炎活性評估........................................................................................ 39 四、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NFκB)活化分析 ................................ 40 VI.

(7) 五、 MMP-9 蛋白質表現量評估 ...................................................................... 42 六、動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估) ....................................................... 46 七、脂肪酸成分分析........................................................................................ 50 八、總多酚含量測定........................................................................................ 51 九、 Maximum inhibition(%)計算 .................................................................... 52 十、統計分析.................................................................................................... 52 . 第四章結果與討論 ................................................................................53 第一節山苦瓜萃取物之抑菌與抗發炎作用 ........................................................... 54 壹、山苦瓜萃取物之萃取率............................................................................ 54 貳、抑菌實驗.................................................................................................... 54 參、細胞存活率測定........................................................................................ 54 肆、 In vitro 抗發炎活性評估........................................................................... 55 伍、討論............................................................................................................ 63 第二節評估山苦瓜果實萃物暨其區分物之抗發炎作用 ....................................... 66 壹、 In vivo anti-inflammatory effect of WBM EA extract ............................... 66 貳、皂化物與不皂化物之成分........................................................................ 67 參、細胞存活率測定........................................................................................ 67 肆、 In vitro 抗發炎活性評估........................................................................... 68 伍、討論............................................................................................................ 87 第三節評估山苦瓜葉甲醇萃物與其多酚萃物之抗發炎作用 ............................... 94 壹、總多酚含量測定........................................................................................ 94 貳、細胞存活率測定........................................................................................ 94 參、 In vitro 抗發炎活性評估........................................................................... 95 肆、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NFκB)活化分析 ................................ 95 伍、 In vivo anti-inflammatory effect ................................................................ 96 陸、討論.......................................................................................................... 105 第四節評估 capric acid 之抗菌、抗發炎作用 ..................................................... 107 壹、抑菌實驗.................................................................................................. 107 貳、細胞存活率測定...................................................................................... 107 參、 In vitro 抗發炎活性評估......................................................................... 107 肆、 In vivo anti-inflammatory effect .............................................................. 108 伍、討論.......................................................................................................... 115. 第五章綜合討論 ..................................................................................118 第六章參考文獻 ..................................................................................127 第七章 . 附錄(動物實驗同意書) ........................................................137 VII.

(8) 圖目錄圖 2-1 皮膚結構圖(摘自 Tortora, 2005) ...................................................................... 3 圖 2-2 發炎性痤瘡病變發展 (Farrar, 2004) ............................................................... 6 圖 2-3 P. acnes 誘發角質細胞產生 ROS and IL-8 的分子機制 (Grange, 2009) ...... 9 圖 2-4 Toll-like receptor signaling. (Miller, 2007) ...................................................... 13 圖 2-5 發炎性痤瘡與真皮損傷之病理生理學假設模型 (Kang et al., 2005) ......... 15 圖 2-6 山苦瓜果實 (A)花蓮 1 號 (B)花蓮 2 號 (C)花蓮 3 號 (D)花蓮 4 號 ....... 20 圖 2-7 Arachidonic acid 代謝產生 eicosanoids 的途徑 (Calder, 2006) .................... 27 圖 4-1 山苦瓜葉、藤萃取物抑制 P. acnes 生長效果 ............................................. 58 圖 4-2 以 MMT 方法測試不同濃度之苦瓜萃取物處理 THP-1 cell 之細胞存活率。 …………………………………………………………………………………59 圖 4-3 山苦瓜果實萃物抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成 ..... 60 圖 4-4 山苦瓜葉甲醇萃取物抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成 ...................................................................................................................................... 61 圖 4-5 不同時間下 live P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ................ 62 圖 4-6 山苦瓜果實 EA 萃物對 P. acnes 引起小鼠耳朵腫脹與重量變化之影響 ... 69 圖 4-7 山苦瓜 EA 萃物、皂化物與不皂化物脂肪酸成分分析 .............................. 71 圖 4-8 以 MMT 方法測試山苦瓜果實皂化物、不皂化物處理 THP-1 cell 之細胞存活率。.......................................................................................................................... 72 圖 4-9 以 MMT 方法測試 fatty acids, phytol 與 lutein 處理 THP-1 cell 之細胞存活率。.............................................................................................................................. 73 圖 4-10 山苦瓜果實皂化物與不皂化物抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成 ............................................................................................................. 74 圖 4-11 Oleic acid 和 linoleic acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成.............................................................................................................................. 75 圖 4-12 α-linolenic acid 和 Conjugated linolenic acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成 ................................................................................................ 76 圖 4-13 Phytol 與 lutein 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成 ..... 77 圖 4-14 山苦瓜果實 EA 萃物抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ...................................................................................................................................... 78 圖 4-15 山苦瓜果實皂化物抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 79 圖 4-16 山苦瓜果實不皂化物抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ...................................................................................................................................... 80 圖 4-17 Oleic acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ................ 81 圖 4-18 Linoleic acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ........... 82 VIII.

(9) 圖 4-19 α-linolenic acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ....... 83 圖 4-20 Conjugated linolenic acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量.................................................................................................................................. 84 圖 4-21 Phytol 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ...................... 85 圖 4-22 Lutein 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ...................... 86 圖 4-23 Phytol 和 lutein 結構式.................................................................................. 92 圖 4-24 山苦瓜葉甲醇萃物與總多酚萃取物之總多酚含量測定 ........................... 97 圖 4-25 以 MTT 方法測試葉總多酚萃取物處理 THP-1 cell 之細胞存活率。 ..... 98 圖 4-26 山苦瓜葉總多酚萃取物抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成.................................................................................................................................. 99 圖 4-27 山苦瓜葉甲醇萃物抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 .................................................................................................................................... 100 圖 4-28 山苦瓜葉總多酚萃物抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 .................................................................................................................................... 101 圖 4-29 山苦瓜葉甲醇萃物與總多酚萃取物 NFκB 分析結果 ............................. 102 圖 4-30 山苦瓜葉甲醇萃物與總多酚萃取物對 P. acnes 引起小鼠耳朵腫脹與重量變化之影響.................................................................................................................... 104 圖 4-31 Capric acid 和 lauric acid 抑制 P. acnes 生長結果 ..................................... 109 圖 4-32 以 MMT 方法測試不同濃度之 Capric acid 與 lauric acid 處理 THP-1 cell 之細胞存活率。........................................................................................................ 110 圖 4-33 Capric acid 與 lauric acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 cytokines 生成................................................................................................................................ 111 圖 4-34 Capric acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ............ 112 圖 4-35 Lauric acid 抑制 P. acnes 誘導 THP-1 cells 產生 MMP-9 表現量 ............ 113 圖 4-36 Capric acid 對 P. acnes 引起小鼠耳朵腫脹與重量變化之影響 ................ 114 圖 4-37 Lauric acid 對 P. acnes 引起小鼠耳朵發炎反應之影響 (引用自 Nakatsuji et al., 2009) .................................................................................................................... 117 圖 5-1 脂肪酸影響免疫細胞功能的機制 ................................................................ 119 圖 5-2 山苦瓜萃取物抑制 P. acnes 誘導之發炎反應可能機制(引用自 Kang et al., 2005) .......................................................................................................................... 121 圖 5-3 以 P. acnes 誘發之小鼠耳朵發炎反應之動物實驗模式比較(引用自 Nakatsuji et al., 2008 (A); Nakatsuji et al.,2009 (B); 連, 2010(C)，本研究(D)) .................... 124. IX.

(10) 表目錄表 2-1 基質金屬蛋白酶分類 (Lagente, 2005) .......................................................... 11 表 2-2 以 P. acnes 誘導不同細胞之 MMPs 表現 ..................................................... 17 表 2-3 苦瓜萃取物抗發炎活性與成分 ..................................................................... 21 表 2-4 苦瓜萃取物的抗氧化活性與細胞保護效應 ................................................. 22 表 2-5 中鏈脂肪酸 ..................................................................................................... 24 表 2-6 Long-chain n-3 fatty acids 抗發炎特性 (Calder, 2006) .................................. 26 表 4-1 各種苦瓜萃取物的回收率 ............................................................................. 56 表 4-2 山苦瓜果實萃取物抑制 P. acnes 生長效果 ................................................. 57 表 4-3 山苦瓜葉藤、苦瓜水萃取物抑制 P. acnes 生長效果 ................................. 58 表 4-4 山苦瓜果實不同溶劑之萃取物對促發炎介質之影響 ................................. 65 表 4-5 山苦瓜果實 EA 萃物、皂化物與不皂化物中脂肪酸成分分析 .................. 70 表 4-6 苦瓜果實 EA 萃物脂肪酸組成 (中國醫藥大學趙蓓敏教授實驗室分析結果，由趙蓓敏教授所提供) ................................................................................................ 88 表 4-7 脂肪酸濃度換算 ............................................................................................. 89 表 4-8 皂化物主要含有之三種長鏈脂肪酸百分比與濃度 ..................................... 90 表 4-9 樣品 PPAR 活性與抗發炎結果...................................................................... 93 表 4-10 山苦瓜葉甲醇萃物及其總多酚萃物 IC50 比較 ......................................... 105 表 4-11 山苦瓜葉甲醇萃物中 TPE 含量 ................................................................ 105 表 5-1 山苦瓜果實 EA 萃物與葉甲醇萃物抑制促發炎介質之抑制率比較 ........ 122 表 5-2 樣品對 P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生之促發炎介質影響 ....................... 126. X.

(11) 第一章緒論壹、研究動機痤瘡(acne vulgaris)，是一種毛囊皮脂腺(pilosebaceous follicle)的慢性發炎疾病，在皮膚相關疾病中相當常見，大部分好發於 11~30 歲的青少年與年輕成年人，約有 90%的青少年有痤瘡的困擾，而幾乎 100%的青少年都會經歷不同程度的粉刺形成(Olutunmbi, 2008)。雖然痤瘡並不會造成生命的威脅，但假使不治療也可能會造成嚴重的身體和心理方面的影響。重度痤瘡可能會造成永久性的疤痕產生，而使青少年因為過度焦慮而影響人格發展(Grange, 2010)。目前痤瘡之病理生理學狀態仍未完全了解，但一般相信與多餘的皮脂(sebum) 產生、毛囊角質化過度(follicular hyperkeratinization)、痤瘡桿菌(Propionibacterium acne)繁殖與其引起的發炎反應有關(Thiboutot, 2002)。其中痤瘡桿菌，一種存在於正常皮膚毛囊中革蘭氏陽性厭氧菌，會誘發產生免疫反應，進而加重痤瘡發炎的情況，被認為在痤瘡的發炎病程中扮演重要的角色(Grange, 2010)。目前抗生素是治療痤瘡的主要治療方式(Coates, 2002)，藉著減少皮膚與皮脂腺毛囊微生物數量達到改善痤瘡的目的，但是臨床上發現長期使用抗生素會增加痤瘡桿菌的抗藥性(Espersen, 1998)，而使用 A 酸雖然也能夠顯著降低粉刺或是輕微的發炎性痤瘡，但也可能造成皮膚乾燥、脫屑等問題，因此需要尋找抗生素與 A 酸以外的治療方式。苦瓜含有活化 PPARα 及 γ 的成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗發炎和抗氧化等功效。研究也發現山苦瓜(Momordica charantia Linn. var. abbreviata Ser.) 萃取物能夠抑制 LPS-刺激巨噬細胞之 PGE2 生成，被認為具有抗發炎作用(Huang, 2002; 趙哲毅, 2008)，而山苦瓜的水萃取物或乙醇萃取物也被證實具有抗氧化及捕捉自由基的能力(Kumar, 2010)。由於苦瓜萃取物能夠減少 LPS 誘發發炎介質 1.

(12) 產生，具有抗發炎的功效，因此，本研究希望能夠進一步探討山苦瓜萃取物與其區分物是否具有減緩發炎性痤瘡的可能潛力。. 貳、研究目的本研究欲探討山苦瓜果實與葉子萃取物是否具有抑制痤瘡桿菌生長的作用，也探討果實EA萃取物暨其區分物、葉子甲醇萃物與總多酚萃物、capric acid和 lauric acid對於P. acnes誘導THP-1 monocytes產生之促發炎介質的抑制作用，並將 P. acnes注射至ICR小鼠耳朵，測試樣品in vivo抗發炎效果。. 2.

(13) 第二章文獻探討. 第一節皮膚結構皮膚是人體最大的器官，除了疼痛、溫度及觸覺的感覺之外，也能夠防護寒暑陽光、磨擦等物理性刺激，是人體最外圍的一道防線。皮膚構造是由表皮層 (epidermis)、真皮層(dermis)、及皮下組織(hypodermis)構成(圖 2-1)。. 圖 2-1 皮膚結構圖(摘自 Tortora, 2005). 表皮層(epidermis) 表皮位於皮膚最外層，由角質細胞和樹枝狀細胞組成，能夠阻擋外來物入侵，防止外界環境中的病菌、化學物質侵入人體內部。由外向內可分為五層，即角質層(stratum corneum)、透明層(clear layer)、顆粒層(granular layer)、棘層(stratum spinosum)和基底層(basal layer)。角質層(stratum corneum)是由十多層扁平的死亡 3.

(14) 細胞組成，由角質蛋白連結許多已角質化的細胞，達到保護皮膚、防止水分蒸發的功能。透明層僅存在於手掌和腳底，是由數層透明細胞組成，能反射陽光並防止水分被吸收和散失。棘層是表皮中最厚的一層，包含許多感覺神經末梢，能感知刺激。而基底層具有分裂繁殖能力，會進行有絲分裂與複製，是表皮各層細胞分化的源頭。. 真皮層(dermis) 真皮位於表皮和皮下脂肪組織之間，由結締組織縱橫交織構成，其中的膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)和網狀纖維能夠維持皮膚的張力與彈性，另外，真皮也含有毛細血管、毛細淋巴管網和感覺神經末梢，能夠傳遞觸覺、溫覺等感覺訊息。. 皮下組織(hypodermis) 皮下組織中的皮脂層具有彈性，能夠緩衝外來衝擊，達到保護體內組織的功用。皮脂是由皮脂腺所分泌的一種酸性有機混合物，包括飽和與不飽和的游離脂肪酸、甘油酯類、固醇類及角鯊烯等脂質。皮脂能夠在皮膚表面形成一層脂質膜，幫助潤滑皮膚與維持水分，防止皮膚因乾燥而皸裂，但在青春期會因為荷爾蒙增加，刺激皮脂分泌造成毛囊阻塞，而產生粉刺(Tortora, 2005)。. 4.

(15) 第二節痤瘡的致病機轉壹、痤瘡的成因痤瘡病灶發生位置在毛囊皮脂腺單位(pilosebaceous unit, PSU)，在臨床上可分為非發炎與發炎病變，包括開放性與閉鎖性粉刺(open and closed comedones)、膿皰(pustule)、囊腫(cyst)、結節(nodule)，一般好發於臉部、胸部、上背部與上臂(Olutunmbi, 2008)。雖然對於痤瘡之致病機制並不是完全清楚，但目前廣被接受的4個基本致病因子(fundamental etiopathogenic factors) 包括：皮脂過度生成 (sebaceous hyperproduction)、毛囊過度角質化(follicular hyperkeratinization)、痤瘡桿菌增生 (increase of Propionibacterium acnes colonization) 和發炎反應 (periglandular dermal inflammation) (Costa, 2010)。當雄性激素(androgen)促進皮脂腺，促使皮脂細胞(sebocyte)增生與分化造成皮脂分泌增加(sebaceous hyperplasia)，皮脂分泌過多加上 IL-1α 增加使毛囊漏斗部過度角質化 (follicular hyperkeratinisation) ，阻塞毛囊漏斗部形成粉刺，促進毛囊中痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes)增生(colonization)，並透過CD4+T-cell調控的特異性途徑或非特異性途徑啟動發炎反應，增加角質細胞產生促發炎細胞激素，發炎反應會因為巨噬細胞與嗜中性白血球的活化而增加。其中P. acnes增生與其誘發的發炎被認為是重要的致病因子(圖2-2) (Farrar, 2004; Thiboutot, 2002)。痤瘡桿菌 (P. acnes) 是一種革蘭氏陽性厭氧菌 (Gram-positive anaerobic bacterium)，屬於皮膚正常菌叢之一。皮脂腺分泌的皮脂是一種包含角鯊烯 (squalene)、蠟酯(wax esters)、三酸甘油酯(triglycerides)、游離膽固醇和脂肪酸的脂質混合物，P. acnes 能夠利用這些脂質與脂肪酸作為生長的主要養分，代謝三酸甘油酯所產生的游離脂肪酸則會吸引嗜中性白血球聚集，誘發後續的發炎反應(Webster, 2002)。事實上，P. acnes 與痤瘡病程發展的研究已超過 100 年，早在 1896 年即提出此種在痤瘡中發現的微生物會直接造成痤瘡。Strauss 等人(1960)將 P. acnes 注入 5.

(16) 無菌的角質囊腫，發現會造成囊腫破裂並產生發炎，證實 P. acnes 發炎的特性。另在痤瘡病患的 PSU 中也發現 P. acnes 顯著地增加。而臨床上也發現使用抗生素 (如：erythromycin 和 clindamycin)能減少皮膚表面的 P. acnes，進而改善痤瘡 (Holland, 1978)。也有研究證實以甲醛殺死的 P. acnes 無法誘發正常人類角質細胞產生 IL-1α，活的 P. acnes 能夠誘發人類角質細胞產生 IL-1α, tumor necrosis factor (TNF)-α (Graham, 2004; Ingham, 1998; Walters, 1995)，這些研究皆證實 P. acnes 在痤瘡病程中扮演重要的角色。. 圖 2-2 發炎性痤瘡病變發展 (Farrar, 2004). 6.

(17) 貳、痤瘡桿菌與發炎反應皮膚是人體與環境的初級屏障，當皮膚受到創傷等因素造成皮膚屏障受損，可能會進一步造成致病微生物入侵。因此，為了抵禦微生物病原體，除了皮膚的屏障功能之外也需要完整的免疫系統共同防護。皮膚的宿主防禦包括先天免疫反應，當病原體入侵皮膚時會啟動先天免疫反應，以清除致病的病原體，雖然發炎是正常的反應，但是當發炎反應過度產生會造成慢性發炎，促進發炎調節因子生成並損傷組織而加重發炎的情況。在痤瘡中，P. acnes 會誘發皮膚產生保護的抗菌反應以消滅 P. acnes，但是當發炎反應失衡之後，會因為釋出的多種發炎介質而增加發炎的情況，造成更嚴重的痤瘡(Kupper, 2004)。由於毛囊中 P. acnes 之增殖是引起痤瘡發炎反應的主要因素，因此，在發炎型痤瘡中 P. acnes 便成為治療的主要目標。P. acnes 能藉由數種機制造成毛囊上皮損傷而引起後續的發炎反應，首先，P. acnes 會產生 lipase, proteases 與 hyaluronidases，造成組織受損與發炎(Hoeffler, 1977)，也會產生嗜中性白血球趨化因子(neutrophil chemotactic factors)吸引嗜中性白血球(neutrophils)聚集至毛囊，雖然嗜中性白血球能夠吞噬毛囊中的 P. acnes 或是產生活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS)去毒殺 P. acnes，但其所釋放的水解酶(hydrolases)會瓦解毛囊組織，與過量產生的 ROS 共同促使發炎反應惡化。另外，P. acnes 會活化 Toll-like receptors (TLRs) 調控的先天性免疫系統，誘發促發炎細胞激素 (proinflammatory cytokines) 的合成，像是 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1α, IL-8, and IL-1β (Kim et al., 2002; Grange, 2010; Vowels, Yang, & Leyden, 1995)。P. acnes 也會藉由活化 T helper 1 (Th1) lymphocytes 啟動適應性免疫反應(Mouser, Baker, Seaton, & Chu, 2003)，當免疫細胞辨識到 P. acnes 會誘發宿主防禦機制以抵禦感染，然而活化抗菌胜肽(antimicrobial peptides)、發炎細胞激素(inflammatory cytokines)與凋亡酵素(proapototic enzymes)卻會造成組織受損與形成疤痕 (Nagy, 2005)。以下將分別討論痤瘡桿菌誘發產生的發炎反應與疤痕. 7.

(18) 形成之間的關連性。. 一、痤瘡桿菌誘導之促發炎細胞激素由單核球細胞(monocytes)與巨噬細胞(macrophages)產生的細胞激素會調控感染和受傷時全身性的反應。許多文獻皆指出 P. acnes 會誘發促發炎細胞激素的產生(Kim, et al., 2002; Grange, 2010; Vowels, et al., 1995)，也會增加血管與真皮黏附因子的表現(Frank et al., 1995)。IL-8 是一種化學趨化因子(chemotactic factors) 會吸引嗜中性白血球聚集到毛囊皮脂線單位，嗜中性白血球分泌的溶解酶會造成更嚴重的發炎反應；IL-1α 會造成毛囊細胞漏斗部過度角化而形成粉刺；IL-1β 是發炎反應重要的調節因子，會藉由正向調控氧化 LDL 受器而增加 macrophages 對膽固醇的吸收造成 foam cell 形成；TNF-α 參與朗格罕細胞(Langerhans cells)的成熟與遷移，在發炎病變早期可能會造成 T 細胞的浸潤；IL-12 會促進 Th1 調控的免疫反應，當 Th1 cytokines 這類型的細胞激素 IL-12 過度產生會造成組織受損 (Dessinioti, 2010; Ishibashi et al., 1990)。. 發炎性痤瘡與活性氧分子(Reactive oxygen species) 活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS)是 half-life 短暫的小分子，在正常有氧代謝會不斷少量的產生，大量時可能導致細胞損傷和組織損傷(Cullen et al, 2003) 。 ROS 包括氧源分子 (oxygen-derived molecules) 中的氧自由基 (oxygen radicals)，像是超氧陰離子(superoxide anion, O2-)、氫氧自由基(hydroxyl)、過氧化自由基(peroxyl radicals)與非自由基的次氯酸(hypochlorous acid, HOCl)、臭氧 (ozone, O3)、單氧(1O2) 與過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)。除此之外，氮源分子(nitrogen-derived molecules)如一氧化氮(nitric oxide, NO)會和 O2-結合形成亞硝酸鹽陰離子(peroxinitrites)，對生物分子造成亞硝殘留。細胞內的 ROS 主要來自於粒線體，少量產生時能傳遞訊息促進細胞增生。在一般發炎反應與先天免疫中，巨噬細胞(macrophage)能夠利用 ROS 作為細胞毒性介質以殺死微生物，但是當過 8.

(19) 多的 ROS 無法經由酵素或是抗氧化物清除，便會產生氧化壓力，破壞蛋白質結構甚至造成細胞死亡(Grange, 2010)。在發炎性痤瘡中，氧化物增加造成的氧化壓力會影響痤瘡的病理發展。研究發現痤瘡病患嗜中性白血球產生的 ROS 明顯增加，且產生的量與痤瘡的嚴重度相關(Fattah et al, 2008; Sarici et al, 2009)，而在一項 2009 年的研究中更證實 P. acnes 不僅會誘發巨噬細胞產生 ROS，也會辨識角質細胞膜上的 CD36，CD36 會透過 NADPH oxidase pathway (NOX)誘發超氧陰離子的合成，並和 NO 結合形成 peroxinitrites，活化 MAPKs, p38 和 ERK，促進 IL-8 的產生而增強發炎，顯示 ROS 造成的氧化損傷在痤瘡病變中可能扮演重要角色(Grange, 2009)。在痤瘡發炎的過程中，嗜中性白血球與巨噬細胞會產生 ROS 以消滅 P. acnes，當巨噬細胞為了破壞 P. acnes 而產生過量的 ROS 時，會同時刺激並破壞毛囊周圍健康的組織，增加氧化壓力，除此之外，ROS 會藉由 TLR4 活化 THP-1 細胞內的 NF-κB，促進 IL-8 的合成，進而加重痤瘡發炎的情況(圖 2-3) (Grange, 2009; Ryan, 2004; Sarici, 2010)。. 圖 2-3 P. acnes 誘發角質細胞產生 ROS and IL-8 的分子機制 (Grange, 2009) 9.

(20) 二、基質金屬蛋白酶 (一) 細胞外基質(Extracellular matrix, ECM) 真皮層包含多種細胞外基質蛋白質(extracelluLar matrix proteins, ECMs），如：第一型及第三型膠原蛋白（type I and III collagens）、彈力蛋白(elastin）、fibronectin 等，主要是由纖維母細胞（fibroblast）分泌。ECMs 會在分解與合成的過程中保持動態平衡，而降解 ECMs 的調控主要是受到基質金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinases, MMPs)以及組織中 MMPs 專一性的抑制劑（tissue inhibitor of MMPs, TIMP）二者相互作用。. (二) 基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) 基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一群含鋅的內切酶 (zinc-dependent endopeptidases)，根據受質特異性(substrate specificity)與 primary structure 分成 collagenases, gelatinases, stromelysins 與 membrane type MMPs 等(表 2-1)。MMPs 中的 collagenase subgroup 包括 collagenase-1 (or fibroblast collagenase, MMP-1), collagenase-2 (or neutrophil colagenase, MMP-8), 與 collagenase-3 (MMP-13)；而 gelatinase subgroup 包括 gelatinase A (72-kDa gelatinase, MMP-2) 與 gelatinase B (92-kDa gelatinase, MMP-9)。MMPs 的生理功能為分解細胞外基質 (extracellular matrix)，在傷口癒合、真皮纖維化與腫瘤細胞轉移中扮演關鍵的角色，對於發炎時的基質重塑(remodeling)與過度增生的皮膚疾病亦有重要的影響。 MMPs 能夠由多種不同類型的細胞產生，如纖維母細胞(fibroblasts)、角質細胞 (keratinocytes)、巨噬細胞(macrophages)、內皮細胞(endothelial cells)等，其活性主要受到 tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs)調控。大部分 MMPs 在皮膚並不會持續表現，但是當存在外來訊息如不同的細胞激素(IL-1, IL-6, TNF-α)、表皮生長因子(epidermal growth factors, EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)時會誘發不同細胞 MMPs 的表現(Kahari,. 10.

(21) 1997; Chakraborti, 2003)。表 2-1 基質金屬蛋白酶分類 (Lagente, 2005) Table 2-1 The family of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases. Subgroup. MMP. Collagenases. Gelatinases. Elastases. (kDa). Known substrate(s). Interstitial collagenase-1. 55. 45. MMP-18 Interstitial collagenase-4 (Xenopus) MMP-8 Neutrophil collagenase MMP-13 Collagenase-3 MMP-15 Xenopus collagenase MMP-21 Collagenase-4. 53. ?. 75 60 55 72. 58 Collagens I, II, III, V, VII, VIII, X; gelatin; aggrecan; α-proteinase 48 inhibitor; fibronectin ? Collagens I, II, III, IV; gelatin; aggrecan; perlecan; tenascin ? (see MMP-24). MMP-3. Stromelysin-1. 57. 45. MMP-10 Stromelysin-2. 57. 44. MMP-19 RASI or MMP-18 (human) MMP-20 Enamelysin. 57. ?. 54. ?. Amelogenin; enamel. MMP-2. Gelatinase. A. 72. 66. MMP-9. Gelatinase. B. 92. 86. Collagens I, IV, V, VII, X, XI, XIV; gelatin; elastin; fibronectin; aggrecan; perlecan; versican; ß-amyloid; pro-TNF; α-proteinase inhibitor; MMP-9, 13 Collagens IV, V, VII, X, XIV; gelatin; elastin; aggrecan; versican; fibronectin; nidogen; α-proteinase inhibitor; pro-TNF. MMP-7. Matrilysin (PUMP-1). 28. 19. MMP-26 Matrilysin-2 or endometase. 30. ?. MMP-12 Macrophage metallo-elastase. 54. 45/22. 44 59. ? ?. MT1-MMP. 66. 56. MT2-MMP MT3-MMP MT4-MMP MT5-MMP or MMP-21. 72 64 67 70. ? 52 ? ?. 63. ?. MMP-23. ?. MMP-28 Epilysin. Membrane type MMPs MMP-14. MMP-15 MMP-16 MMP-17 MMP-24. MT-MMP-6 or MMP-25 leukolysin. TIMP-4. mass. Active. cAMP metalloproteinase. Tissue inhibitor of MMPs. Molecular Latent. MMP-1. Stromelysins. Enzyme. TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3. Collagens I, II, III, VII, VIII; gelatin; aggrecan; versican; proteoglycan link protein; casein; α-proteinase inhibitor; α-macroglobulin; ovostatin; nidogen; pro-TNF; L-selectin; MMP-2; MMP-9. Collagens III, IV, IX, X; gelatin; aggrecan; versican; perlecan; fibronectin; laminin; elastin; casein; fibrinogen, α-macroglobulin; ovostatin; pro-TNF; MMP-1, 7, 8, 9, 13 Collagens III, IV, V; gelatin; casein; aggrecan; elastin; fibronectin; MMP-1, 8; α-proteinase inhibitor Aggrecan and cartilage oligomeric matrix protein; amelogenin matrix;. aggrecan. Collagens I, II, III; gelatin; aggrecan; fibronectin; laminin; entactin; elastin; casein; transferring; α-proteinase inhibitor; pro-TNF; MMP-1, 2, 9 Collagen type IV; fibronectin; fibrinogen; beta-casein; type I gelatin; α-1 proteinase inhibitor. Is also able to activate pro-gelatinase B Collagen IV; gelatin; elastin; α-proteinase inhibitor; fibronectin; vitronectin; laminin; pro-TNF ?. Casein Collagens I, II, III; gelatin; casein; elastin; fibronectin; laminin ß chain; vitronectin; aggrecan; dermatan sulfate proteoglycan; MMP-2, 13; pro-TNF MMP-2; gelatin; fibronectin; tenascin; nidogen; laminin MMP-2 Fibrin; pro-TNF; activation of pro-gelatinase A. Does not hydrolyze collagen types I, II, III, IV, and V, gelatin, fibronectin, laminin, decorin nor α1-antitrypsin Specifically activates pro-gelatinase A and proteoglycans, such as dermatan sulfate and chondroitin sulfate proteoglycans. Cleaves partially fibronectin, but not collagen type I, nor laminin. Activation of pro-gelatinase A. 28.5 (glycosylated) All MMPs except MMP-14, MMP-19. Binds to pro-MMP-9 21 (unglycosylated) All MMPs. Binds to pro-MMP-2 27 (glycosylated) All MMPs. Binds to pro-MMP-2 and pro-MMP-9 24 (unglycosylated) 23 (unglycosylated) MMP-1, 2, 3, 7, 9. Binds to pro-MMP-2. MMP = matrix metalloproteinase; TIMP = specific tissue inhibitor of MMP; TNF = tumor necrosis factor.. 11.

(22) 參、誘發發炎的訊息傳遞路徑一、 Toll-like receptors (TLRs) Toll-like receptors (TLRs)是一種模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，能辨別微生物與引起的免疫反應中與病原體相關的分子模式，參與多種對抗致病微生物的宿主防禦反應(Iwasaki, 2004)。先天免疫系統(innate immune system) 被認為是非特異性，包括早期發炎反應，像是 neutrophil 和 monocyte/macrophage 的吞噬作用(phagocytosis)與補體活化(complement activation)；適應性免疫系統 (adaptive immune system)會透過辨識外來抗原，促使 T 淋巴細胞與 B 淋巴細胞(T and B lymphocytes)產生與增殖，進而誘發細胞與抗體調控免疫反應，故具有特異性。TLRs 被認為在先天免疫反應的特異性中扮演重要的角色，而在之後的適應性免疫反應中也有重要的影響。目前已知有十種 TLRs，每一種都會辨識一種特定的微生物組成成分，例如： TLR2 能辨認細菌的 peptidoglycan (PGN), lipopeptides 與 lipoteichoic acid；TLR4 能辨認革蘭氏陰性菌之內毒素(LPS)。當 TLRs 被誘發之後會啟動數個訊息傳遞路徑，包括 nuclear factor-κB (NF-κB) 的活化，最後會導致 cytokines, chemokines, antimicrobial peptides 的合成，並促進參與先天與適應性免疫反應的刺激與黏附因子合成(圖 2-4) (Medzhitov, 2001; Medzhitov, 2000; Miller, 2007)。近年來的研究指出 P. acnes 是藉由 Toll-like receptors (TLRs)誘發 cytokines 的反應。P. acnes 引起的反應是藉由活化毛囊周圍皮脂腺巨噬細胞表面的 TLR2 進一步活化下游的 NF-κB。另外，研究發現除了 TLR2 knockout 的小鼠之外，在野生型、 TLR6 knockout 和 TLR1 knockout 小鼠取出的腹腔巨噬細胞中都因為 P. acnes 的誘發而產生了 IL-6 (Kim, 2002)。在人類初代單核球細胞(primary human monocytes) 中 P. acnes 會誘導 IL-12 和 IL-8 的產生，而這些 cytokines 的生成會因為 anti-TLR2-blocking antibody 而被抑制(Kim, 2005)。這些研究都證實 P. acnes 可藉由 12.

(23) 活化 TLR2 誘導促發炎細胞激素的合成。. 圖 2-4 Toll-like receptor signaling. (Miller, 2007). 在痤瘡病程中，MMPs 分解毛囊之基質(matrix)的同時可能吸引巨噬細胞聚集而增加毛囊發炎的情況(Dessinioti, 2010; Kahari, 1997; Chakraborti, 2003)，Trivedi 等人為了探討參與痤瘡病程發展的基因，從 6 位痤瘡病患之痤瘡病灶與其他部位的正常皮膚進行組織切片分析，發現相較於正常皮膚組織，痤瘡病灶有 211 基因的表現量是顯著的提高，其中大多是發炎反應和基質重塑有關的基因，例如 MMP-1 (增加 92 倍)、MMP-3(增加 64 倍)、IL-8(增加 52 倍)、抗菌胜肽 human β-defensin 4 (DEFB4, 增加 33 倍) (Trivedi, 2006)。近年來有不少研究發現 TLRs 會參與調節多種 MMPs 的表現，也發現 P. acnes 含有 peptidoglycan 與 lipoteichoic acid 的 membrane fraction 能夠促進角質細胞的增生，而且將人類角質細胞與 P. acnes fractions 共同培養之後發現會增加角質細胞 MMP-9 的表現，且是透過 TLR2 和 TLR4 pathway (Jugeau, 2005; Jarrousse, 2007;. 13.

(24) Isard, 2009)。而 P. acnes 也會誘發 monocytes 產生 MMPs，Jalian 等人將 P. acnes 與 monocytes 共同培養，發現會誘發 monocytes MMP-9 與 MMP-1 mRNA 的表現，但是當使用 TLR2-neutralizing antibody 之後，MMP-9 mRNA 的表現量卻降低，另外測定 TIMP-1 的表現量時亦發現 P. acnes 會增加 TIMP-1 的表現，由於 TIMP-1 是調控 MMP-9 的主要調節因子，證實 P. acnes 能透過 TLR2 的 pathway 誘發 MMP-9 的產生(Jalian, 2008)。目前研究認為發炎性痤瘡造成真皮層受損的可能機制是透過痤瘡發炎過程中活化 NF-κB，並進一步活化 NF-κB 下游調控的發炎細胞激素基因(如 TNF-α 與 IL-1β)，這些初級細胞激素作用於內皮細胞的黏附因子(如 ICAM-1)以吸引發炎細胞進入皮膚。TNF-α 與 IL-1β 也會促進二級細胞激素的產生，如 IL-8 這類的趨化因子以吸引發炎細胞。藉由作用於細胞表面的 receptors，TNF-α 與 IL-1β 不僅會藉由 autocrine 的方式促進 TLRs pathway 與放大 NF-κB 的訊息傳遞路徑，增加更多促發炎細胞激素的合成，也會活化 MAP kinases 促進 AP-1 調控的基因轉錄，AP-1 活化的結果會增加 MMPs 的合成，伴隨嗜中性白血球(polymorphonuclear leukocytes, PMNs)帶來的 MMP-8 與中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase)會一同分解基質，造成不完整的基質合成與修復。當 MMPs 過度增加會造成基質結構與成分隨著時間出現顯著的降解，被分解的膠原蛋白片段會抑制新膠原蛋白片段的合成，在過度分解與合成不足的情況下便會形成臨床上痤瘡顯而易見的凹陷疤痕(圖 2-5) (Kang, 2005)。. 二、 Proteinase-activated receptor (PAR) 目前已知部份蛋白酶可透過 proteinase-activated receptor-2 (PAR-2)來調控發炎與免疫反應。在皮膚中，角質細胞可大量表現 PAR-2，被認為能夠對內源性 (endogenous)與外源性(exogenous)的絲氨酸蛋白酶(serine proteases)產生反應，進而調控滲透屏障的穩定(permeability barrier homeostasis)、發炎、搔癢(pruritus)、色素 14.

(25) P. acnes. 圖 2-5 發炎性痤瘡與真皮損傷之病理生理學假設模型 (Kang et al., 2005) 沉著(pigmentation)與傷口癒合(Hansen, 2008)。多種細胞皆會表現具功能性的PAR-2，例如毛囊角質細胞、皮脂腺、纖維母細胞、血管內皮細胞(endothelium)、傳入神經元(afferent neuron)與發炎細胞等(Rattenholl, 2003)。當皮膚發炎時，PAR-2會被白血球彈性蛋白酶(leukocyte elastase)與肥大細胞類胰蛋白酶(mast cell tryptase)等內源因子活化，藉由正向調控(up-regulated)發炎介質而增強發炎反應(Rattenholl, 2008)。在痤瘡病變中亦發現蛋白酶活性與PAR-2表現有增加的現象，P. acnes培養的上清會藉由PAR-2誘發角質細胞鈣離子的訊息傳遞(calcium signaling)，並促進角質細胞的IL-1α, IL-8, TNF-α, human beta defensin (hBD)-2, LL-37, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9與MMP-13 mRNA的表現，而當給予絲氨酸蛋白酶抑制劑與選擇性PAR-2特定拮抗劑(selective PAR-2 specific antagonist)時則會顯著抑制上述各類MMP等 mRNA的表現，證實P. acnes分泌的胞外蛋白酶(extracellular proteases) 不僅能夠分. 15.

(26) 解基質與水解毛囊角質細胞，也會活化角質細胞的PAR-2，進而釋放發炎介質，誘發並增強痤瘡發炎的情況(Lee, 2010)。. 肆、痤瘡與基質重塑(Matrix remodeling) 臨床上發現若未適當控制痤瘡發炎會造成疤痕(scarring)，而疤痕是痤瘡最遺憾的後遺症，因為疤痕形成之後無法藉由藥物的方式治療，必須透過侵入性手術如化學換膚、雷射換膚或磨皮等方式才能改善，而這些手術不僅價格昂貴，也可能進一步增加疤痕或色素沉積的風險，因此預防疤痕形成也是治療發炎痤瘡的重要目標之一 (Kang, 2005)。近年來， MMPs 在痤瘡病程發展中可能扮演重要的影響角色 ( 表 2-2) ， Papakonstantinou 等人從痤瘡病患取得的臉部皮脂發現會表現 MMP-1, MMP-9, MMP-13, TIMP-1 與 TIMP-2，由於這些 MMPs 和 TIMPs 分別來自角質細胞與皮脂腺細胞，證實 MMPs 會參與痤瘡病程發展(Papakonstantinou, 2005)。Jalian 等人(Jalian, 2008)證實 P. acnes 會誘發人類 monocytes 產生 MMP-9, MMP-1 與 TIMP-1。Lee 等人(2010)也證明在痤瘡病程中角質細胞是 MMPs 的重要的來源，且 P. acnes 的蛋白酶能夠透過 PAR-2 的活化誘導 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 與 MMP-13 的表現，藉由免疫組織化學分析也觀察到在發炎性痤瘡中 MMP-1, MMP-2, MMP-3 和 MMP-9 的表現顯著增加(Lee et al., 2010)。Kang 等人也發現在發炎性痤瘡病灶中 MMP-1, MMP-3 與 MMP-9 會顯著增加 (Kang et al., 2005)。雖然在痤瘡病灶之皮膚組織切片中觀察到 MMP-1 表現量顯著增加，但是在其他發炎性皮膚疾病如乾癬 (psoriasis)與毛囊炎(folliculitis)的皮膚切片亦發現毛囊病灶的毛囊上皮 MMP-1 表現量增加，證實 MMP-1 可能參與普遍的發炎反應而不是痤瘡的特定表現(Trivedi, 2006)。另外研究發現異維 A 酸(isotretinoin)能降低角質細胞與 SZ95 皮脂腺細胞 MMP-9 和 MMP-13 的 mRNA，使用 all-trans retinoic acid 除了能夠顯著降低. 16.

(27) monocytes MMP-9 mRNA 基礎表現量之外，對於 P. acnes 誘發產生的 MMP-1 與 MMP-9 也有抑制效果，但對於 MMP-1 和 MMP-3 mRNA 基礎表現量則無影響(Jalian, 2008; Papakonstantinou, 2005)。此外，MMP-1 會將細胞外基質內的 fibrillar collagens 分解形成 gelatin，再由 MMP-2 與 MMP-9 進一步分解與破壞，顯示 MMP-2 與 MMP-9 在基質重塑中扮演重要的角色 (Kahari, 1997)，加上研究證實常用於痤瘡治療的 all-trans retinoic acid 能夠降低 MMP-9 的表現量，顯示抑制 MMP-9 能夠緩解痤瘡 (Jalian, 2008)，因此本研究亦探討 P. acnes 誘發 THP-1 細胞 MMP-9 的表現。. 表 2-2 以 P. acnes 誘導不同細胞之 MMPs 表現 MMP 表現. 實驗模式. 文獻. In vivo study 含來自角質細胞與皮脂腺細胞的從痤瘡病患取得臉部皮脂. MMP-1, MMP-13, TIMP-1 與. Papakonstantinou, 2005. TIMP-2，且明顯表現 MMP-1, MMP-3 與 MMP-9 顯著痤瘡病灶皮膚組織切片增加，且 PMNs 會分泌 MMP-8. Kang, 2005. MMP-1、MMP-3 基因表現量顯著 Trivedi, 2006. 痤瘡病灶皮膚組織切片增加 In vitro study MMP-1 與 MMP-9 mRNA 與蛋白以 P. acnes 刺激 monocyte. Jalian, 2008 質表現量顯著增加 MMP-1,. 以 P. acnes 刺激角質細胞. MMP-2,. MMP-3,. MMP-9 與 MMP-13 mRNA 的表 Lee, 2010 現量增加. 17.

(28) 第三節痤瘡的治療痤瘡目前的臨床治療方式包含荷爾蒙與非荷爾蒙治療，在決定治療痤瘡的處方時，必須考慮到病患的個別情況，包含疾病狀態(主要病變類型和嚴重程度)、所需要的治療模式(如：局部治療或是口服藥物)和內分泌情形，最後根據病患痤瘡的嚴重程度分別給予適當的治療方式。輕度痤瘡如粉刺，局部使用 A 酸(retinoids)或抗生素；中度發炎時局部使用 A 酸、抗生素或是口服抗生素；假使嚴重發炎，先採取中度發炎時的治療方案，如果沒有改善，則給予口服異維 A 酸(isotretinoin)。非荷爾蒙治療藥物包含局部和全身 A 酸(尤其是異維 A 酸)與局部和全身性抗生素 (通常是 doxycycline 和 minocycline）。研究與臨床經驗顯示合併使用局部 A 酸與抗生素的治療效果比單獨使用更好。基本上，針對輕微粉刺型痤瘡同時使用局部 A 酸 (tretinoin, adapalene, tazarotene) 與抗生素的治療效果佳。全身性的抗生素 (doxycycline, minocycline, amoxicillin)則是用來治療中至重度痤瘡。全身性的 A 酸、異維 A 酸對於治療嚴重發炎、結節囊腫型痤瘡非常有效，研究發現 all-trans retinoic acid 能夠抑制單核球細胞(monocyte)表面的 TLR2，進而減少因 P. acnes 誘發產生的促發炎細胞激素，如 IL-12 與 TNF-α (Jalian et al., 2008)。但塗抹 A 酸可能會對皮膚產生刺激而造成乾燥和脫屑等問題，長期服用也會有致畸的副作用，因此使用上必須更加謹慎(Olutunmbi, Paley, & English, 2008) 。而在皮膚表面的自我抗菌防禦功能中，游離脂肪酸(Free fatty acids, FFAs)與抗菌胜肽(antimicrobial peptides)扮演部份角色，能夠對抗微生物增殖(Drake et al., 2008)。有多種游離脂肪酸已經被證實具有抗菌的特性，能夠對抗一些革蘭氏陽性菌(Drake et al., 2008)，其中的 lauric acids(C12:0)，雖然在皮脂含量中占少數，但已被證實是最有效的抗菌飽和脂肪酸(Wille & Kydonieus, 2003)，文獻中也確認 lauric acids 在 in vitro 的實驗中具有抑制 P. acnes 生長的能力，並且對於 P. acnes 誘發的 in vivo 發炎反應也具有抑制的效果(Nakatsuji et al., 2009)。. 18.

(29) 第四節實驗材料一、山苦瓜苦瓜(Momordica charantia, bitter melon, bitter gourd)可生食、煮食、燉湯、醃製或熬煮成苦瓜茶，是中國、印度、亞洲和非洲等亞熱帶國家常見的植物，除了食用之外也被當作是藥用植物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗胃潰瘍、抗瘧、抗發炎和抗氧化等效果 (Grover, 2004; Jittawan, 2008 )。中國傳統中草藥醫學認為苦瓜全株皆可入藥，本草綱目即記載：苦瓜，微苦、寒、無毒，具有除邪熱、解勞乏，清心明目之效，苦瓜籽則可意氣壯陽，屬寒性食物。山苦瓜(Momordica charantia L, wild bitter melon, wild bitter gourd)為葫蘆科苦瓜屬一年生或多年生之草質藤本植物，瓜形較一般栽培之苦瓜為小。山苦瓜因含苦瓜素(momordicine)故帶有苦味，經烹煮後則成苦甘味，有促進食慾、解渴、清涼、解毒及之效用。近年來台灣培育出數種山苦瓜品種，例如「花蓮 1 號」及「花蓮 2 號」的山苦瓜品種富含維生素 C 及葉酸；「花蓮 3 號」其口感介於栽培種大苦瓜與野生小苦瓜之間，適合鮮食、煮湯及炒食，分析成份發現每 100 公克含維生素 C 171.2 mg、葉酸 167.2 μg，且抗氧化能力強；新品種「花蓮 4 號」山苦瓜為雜交一代品種，果皮呈深綠色，果面具珍珠突起及尖銳突起，長橢圓形，大小約 30 g，口感接近野生苦瓜，適合煮湯及炒食，分析成份發現每 100g 樣品含維生素 C 99.86 mg、葉酸 200.4μg，抗氧化能力佳(圖 2-6)。而傳統上，也將山苦瓜的葉子磨碎取其汁液塗抹於皮膚上可以治療蚊蟲叮咬、蜂螫、燒傷、接觸型皮疹和傷口(Wu & Ng, 2008)。台灣阿美族除了食用山苦瓜的果實之外亦食用其嫩莖和葉片(吳， 2006)。. 19.

(30) (A). (B). (C). (D). 圖 2-6 山苦瓜果實 (A)花蓮 1 號 (B)花蓮 2 號 (C)花蓮 3 號 (D)花蓮 4 號. 藥理及生理活性 (1) 抗發炎(表 2-3) 研究發現花蓮 4 號山苦瓜乙酸乙酯萃取物能夠降低 LPS 刺激 RAW264.7 macrophages 產生的促發炎介質 PGE2，且分析區分物中有效抑制 PGE2 的三酸甘油酯(TGs)是由中短鏈脂肪酸和 dicarboxylic acids 組成，其中的 capric acid (10:0)與 lauric acid (12:0)能夠抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2，又以 capric acid 的抑制效果最好 (Huang, 2002; Wu, 2009) 。苦瓜萃取物能抑制因 lipopolysaccharide (LPS)誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 TNF-α，進一步以 butanol-soluble fraction 實驗顯示能夠有效抑制 LPS 刺激 RAW 264.7 cells 產生的 TNF-α 以及和發炎相關的基因表現，如 IL-1α 與 IL-1β 等，並且能夠抑制上游訊息傳遞因子 NF-κB 與 MAP Kinases (MAPKs)，分析成分確認為 1-R-linolenoyllysophosphatidylcholine. (LPC),. 2-R-linolenoyl-LPC,. 20. 1-lynoleoyl-LPC. 與.

(31) 2-linoleoyl-LPC (Kobori, 2006; Kobori, 2008)。以熱水、95% ethanol 與 ethyl acetate 萃取苦瓜(bitter gourd)與野生山苦瓜(wild bitter gourd)，發現相較於苦瓜萃取物，野生山苦瓜乙醇萃取物能夠顯著降低 LPS-stimulated RAW264.7 macrophages 產生的 nitric oxide (NO)、prostaglandin E2 (PGE2) 合成、nitric oxide synthase (iNOS)與 pro-interleukin-1beta (pro-IL-1β)的表現，且是透過調控 NF-κB 活化而抑制 LPS 誘發的發炎反應，其抗發炎的效果可能是來自於酚類化合物(Lii et al., 2009)。將苦瓜經體外消化後，處理單核細胞與進行動物實驗的研究，發現苦瓜萃取物能減少發炎介質的產生，具有抗發炎反應的效果(Manabe, 2003)。分析山苦瓜的乙酸乙酯萃取物確認含有可以活化 PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor α) 與 PPARγ 之成分，推測山苦瓜中可能含有能抑制發炎反應的成分而具有抗發炎之功效(Chao, 2003)。. 表 2-3 苦瓜萃取物抗發炎活性與成分實驗模式. 結果. 文獻. 花蓮 4 號山苦瓜乙酸乙酯萃取物能夠 LPS-stimulated RAW264.7 macrophage LPS-stimulated RAW264.7. 抑制 PGE2 生成，活性成分為 capric acid 與 lauric acid 苦瓜萃取物能夠抑制 TNF-α 生成. Huang, 2002; Wu, 2009. Kobori, 2006. macrophages 苦瓜萃取物 butanol-soluble fraction 有 LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. 效抑制 TNF-α 的產生和發炎相關的基 Kobori, 2008 因表現(IL-1α 與 IL-1β). LPS-stimulated RAW264.7. 野生山苦瓜乙醇萃取物能夠顯著降低. macrophages. NO、PGE2、iNOS 與 pro-IL-1β. 21. Lii, 2009.

(32) (2) 抗氧化 (表 2-4) 苦瓜萃取物能夠抑制大鼠因為 immobilization stress 引起的脂質過氧化(lipid peroxidation) (Chaturvedi, 2009)。以 hydrogen peroxide (H2O2)與 hypoxanthin-xanthin oxidase (HX-XO)誘發 rat cardiac fibroblasts (RCFs), NIH 3T3 和 keratinocyte (A431) 細胞，發現苦瓜總水萃取物(total aqueous extract, TAE) 與總酚類萃取物(total phenolic extract, TPE)能捕捉自由基，具有抗氧化的能力，也發現能夠抑制氧化劑而具有細胞保護的效果，並推測其所含的有效抗氧化活性成分為酚類及黃酮類物質(gallic acid, tannic acid, (t)-catechin) (Kumar et al., 2010)。Ibrahim 等人測試苦瓜清除 DPPH 自由基的能力，結果顯示苦瓜萃取物清除 DPPH 的效果會隨著萃物濃度的增加而提升，在 2500 μg mL-1 的濃度下抑制 DPPH 能力可達 82.8±0.57%，之後以 HPLC 分析苦瓜中的 phenolic acid 發現含有沒食子酸(gallic acid)、咖啡酸(caffeic acid) 和鄰香豆酸(o-coumaric acid)，gallic acid 為苦瓜中主要的酚類化合物 (Ibrahim, 2010)。. 表 2-4 苦瓜萃取物的抗氧化活性與細胞保護效應實驗模式. 結果. 文獻. 以壓力刺激大鼠產生脂質苦瓜萃取物能夠抑制大鼠因為壓力引 Chaturvedi, 過氧化. 起的脂質過氧化. 2009. 以 H2O2 與 HX-XO 刺激 rat 苦瓜 TPE 與 TAE 能清除自由基並具有 cardiac fibroblasts (RCFs), 細胞保護的效果，抗氧化活性成分為 Kumar et al., NIH 3T3 和 keratinocyte 酚類及黃酮類物質(gallic acid, tannic 2010 (A431)細胞. acid, (t)-catechin). (3) 抗癌多項使用苦瓜粗萃物及其各種純化之區分物(包含 MAP-30)進行的 in vitro 與 in 22.

(33) vivo 初步研究，證實對於淋巴性白血病(lymphoid leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、絨毛膜上皮癌( choriocarcinoma)、黑色素瘤(melanoma)、乳腺癌( breast cancer)、前列腺癌( prostatic cancer)、膀胱癌(human bladder carcinomas)等具有抗癌能力 Pitchakarn 等人藉由體內與體外試驗發現苦瓜葉萃取物不僅能夠抑制癌細胞 (rat prostate cancer cell line, PLS10) MMP-2 與 MMP-9 mRNA 也能顯著增加抑制 MMP-2 活性之 TIMP-2 mRNA 的表現，指出苦瓜葉萃取物也具有抑制癌細胞轉移的能力(Pitchakarn, 2010 )。. (4) 抗糖尿病苦瓜最廣泛研究的是抗糖尿病功效，而且苦瓜所有部分(果肉、種子、葉和全株)在正常動物體內均顯示具有降血糖的活性(Cakici et al., 1994; Sarkar et al., 1996; Jayasooriya et al., 2000)，對於 alloxan 或 streptozotocin 誘發與糖尿病基因模式有抗高血糖的效果(Sitasawad et al., 2000; Miura et al., 2001; Grover et al., 2002; Kar et al., 2003)。在一項臨床試驗中，苦瓜果實的水溶性萃物能顯著降低 9 名非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM)患者進行口服葡萄糖耐受試驗（Oral Glucose Tolerance Test，OGTT）後血糖濃度(Leatherdale et al., 1981)。. 綜合以上文獻證實山苦瓜萃取物具有抗發炎和抗氧化等活性，因此我們選用台灣山苦瓜(品系：花蓮 1-4 號)萃取物檢視是否具有抑制 P. acnes 生長與其誘發之發炎反應的效用。. 二、脂肪酸脂肪酸對免疫系統的影響在過去 30 年被廣泛討論，其修飾免疫系統的機制包. 23.

(34) 括抑制花生四烯酸(arachidonic acid)代謝、誘發 resolvin family 中的抗發炎調節因子、修飾細胞內脂質與活化 nuclear receptors (Calder, 2006)。脂肪酸及其相對應的 triacylglycerols 可區分為 short chain (<4 carbons)、medium chain (MCFA or MCT; 6-12 carbons)或 long chain (LCFA or LCT; >14 carbons)，本研究使用中鏈脂肪酸 (capric acid, lauric acid)與長鏈脂肪酸(oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, conjugated-linolenic acid)，分段敘述如下。. 中鏈脂肪酸中鏈脂肪酸(Medium-chain fatty acid, MCFA)包括 caproic acid (hexanoic acid, C6:0), caprylic acid (octanoic acid, C8:0), capric acid (decanoic acid, C10:0)和 lauric acid (dodecanoic, C12:0) (表 2-5)。表 2-5 中鏈脂肪酸碳數. 學名. 俗名. 熔點(oC). 6. n-Hexanoic. Caproic acid. -8.0. 8. n-Octanoic. Caprylic acid. 12.7. 10. n-Decanoic. Capric acid. 29.6. 12. n-Dodecanoic. Lauric acid. 42.2. 食物來源牛奶脂肪大部分牛奶和某些種子 triacylglycerols 大部分牛奶和某些種子 triacylglycerols 某些種子(棕櫚核仁或椰子油)油脂中的主成分. 不同長度碳鏈的脂肪酸(C8-C18)能夠抑制革蘭氏陽性菌顯示具有抗菌的能力 (Drake et al., 2008)。lauric acids(C12:0)在過去研究中被證實具有抗菌效果(Wille & Kydonieus, 2003)，在 in vitro 的實驗中具有抑制 P. acnes 生長的能力，對於 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵的 in vivo 發炎反應也具有抑制作用，並且能夠減少 P. acnes 的菌數(Nakatsuji et al., 2009)。 Medium-chain triglycerides (MCTs)是 MCFA 甘油酯化產物，從 1950 年代開始， 24.

(35) MCTs 便因為其代謝特性而運用在吸收不良症狀的營養治療(Babayan, 1987)。商業用 MCT 主要包括 C8:0-C10:0 的脂肪酸，在臨床上使用濃度 5 mmol/L 的 MCTs 會增加 β2-integrin 調節的人類白血球(human phagocyte )黏著與細胞膜流動，降低發炎情形(Wanten et al., 2000; Wanten et al., 2001)，而 MCFAs 也會增加脂肪細胞中 PPARγ 和其他轉錄因子的表現(Han et al., 2002)。除此之外，lauric acid 與 capric acid (10:0)在文獻中發現能夠抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2，顯示可能也具有抗發炎的能力(Wu, 2009)。鄭等人將不同濃度的 capric acid 與 LPS 共同處理 18 小時，capric acid 能夠抑制 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2 且呈劑量效應，再以 capric acid 預處理 RAW264.7 macrophages3 小時後，加入 LPS 活化 15 小時，PGE2 生成量也顯著低於對照組，且當 capric acid 濃度為 1μM 時可顯著抑制 TNF-α 及 IL-6 生成量(鄭, 2011)。. 長鏈脂肪酸根據飽和程度與碳原子數量，脂肪酸可作為促發炎與抗發炎的調節因子，飽和脂肪酸(palmitic acid)會誘導 RAW 264.7 Cells 之 COX-2 的表現，而不飽和脂肪酸 (C18:1n-9, C18:2n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, and C22:6n-3) and conjugated linoleic acid (cLA)不會促進 COX-2 的表現，且對於飽和脂肪酸誘導 RAW 264.7 Cells 產生的 COX-2 具有抑制作用，此外，docosahexaenoic acid (C22:6n-3) 能夠抑制 LPS 誘導 RAW 264.7 Cells 產生之 COX-2, iNOS 與 IL-1α (Lee et al., 2001)。增加攝取 long-chain n-3 PUFA 如 eicosapentaenoic acid (EPA; 20:5n-3)與 docosahexaenoic acid (DHA; 22:6n-3)，能夠增加其在發炎細胞磷脂質中的比例，進而減少從 arachidonic acid 代謝產生的 eicosanoids (Healy et al., 2000)。許多研究已證實 n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) 在抗發炎中扮演的角色， Eicosapentaenoic acid (EPA)能夠抑制 LPS 誘導 THP-1 細胞 TNF-α 與 NF-κB 的表現. 25.

(36) (Zhao et al., 2004)，也能夠降低 LPS 誘導產生的 IL-6、IL-1 (Weldon et al., 2007)與 COX-2 表現(Lee et al., 2003)。在細胞實驗中也看到 EPA 和 DHA 能抑制 monocytes 因 LPS 誘導產生的 IL-1β 與 TNF-α (Babcock et al., 2002; Novak et al., 2003; Zhao et al., 2004)。表 2-6 Long-chain n-3 fatty acids 抗發炎特性 (Calder, 2006). 脂肪酸也可能透過調控其他參與調節免疫反應之化合物的代謝而產生影響，例如：從 arachidonic acid (AA)衍生的 eicosanoids 會增加 arginase I enzyme 的表現而減少可利用的 arginine 含量，進而降低免疫能力，從 EPA 衍生的 eicosanoids 則有相反的作用 (Bansal et al., 2005) 。 Arachidonic acid 在代謝過程中會產生 eicosanoids ，包含前列腺素 (prostaglandin) 、前列凝素 (thromboxanes) 、白三烯 (leukotrienes)與其他氧化衍生產物，會參與發炎反應的強度與時間長短的調控(圖 2-7)。發炎細胞通常含有 n-6 PUFA arachidonic acid (20:4 n-6)的比例較多而其他 20 碳 PUFAs 比例較少，由 20 碳多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids) 衍生而來的 Eicosanoids 在 PUFAs 與發炎之間扮演關鍵的連結，作為發炎反應的調節者與監控者。PGE2 近年來已被證實會誘導 fibroblasts cells 中 cyclooxygenase 2 (COX-2) 的表現、誘發 macrophages 產生 IL-6 (Bagga et al., 2003)。因此，作為合成 eicosanoids 先質的 arachidonic acid 也佐證飲食中的 n-6 PUFA 會影響發炎的過程。 26.

(37) 圖 2-7 Arachidonic acid 代謝產生 eicosanoids 的途徑 (Calder, 2006) 在控制的臨床研究指出飲食中的 α-linolenic acid (ALA)能夠減少罹患高膽固醇血症的男性和女性血清中的脂質、脂蛋白和發炎心血管危險因子。(Zhao et al., 2004) 飲食中含有豐富 ALA 能夠減少三種促發炎細胞激素 IL-6, IL-1β 和 TNF-α 的產生。飲食中的 oleic acid 能夠藉由內皮細胞活化達到直接的抗動脈粥狀硬化效果 (Carluccio et al., 1999)，而飲食中的 conjugated linoleic acids 能夠藉由減少發炎介質產生，如：prostaglandin E2, IL-6, IL-1β, TNF-α, and the inflammatory agent nitric oxide 達到抗發炎的功效(Yu et al., 2002)。而苦瓜種子中富含的特殊脂肪酸 cis9, trans11, trans13-conjugated linolenic acid (9c, 11t, 13t-CLN)，研究中被證實能夠抑制 azoxymethane 誘發的小鼠大腸癌(colon carcinogenesis)並藉由正向調控 GADD45, p53 和 PPARγ 誘導大腸癌細胞株 Caco-2 cells 細胞凋亡(Kohno et al., 2004; Yasui et al., 2005) 。. 27.

(38) Wanten 和 Calder (2007)歸納脂肪酸可能藉由下列機制，例如調控細胞訊息傳遞與基因表現，進而影響免疫細胞的功能 (Wanten, 2007)。分別敘述於下： (一)調控細胞訊息傳遞脂肪酸能誘發細胞膜組成改變進而改變磷脂質衍生的第二傳訊因子 (phospholipid-derived second messengers)特性來參與細胞訊息傳遞。飽和脂肪酸與多元不飽和脂肪酸相異的調節途徑參與先天與適應性免疫的協調。前者參與 Toll-like receptors (TLRs)調控，當微生物侵入時會藉由辨識病原體相關的分子模型傳遞訊息(Underhill & Ozinsky, 2002)，如 TLR-4 是微生物 lipopolysaccharide 的接受器。飽和脂肪酸會活化 TLR-4 調控的促發炎途徑，促進 NFκB 與 cyclooxygenase-2 而增加促發炎因子表現，而 very-long-chain n-3 PUFAs 則會抑制上述發炎作用(Lee et al., 2001; Lee et al., 2003) ，因此，不同 TLR 類型的促進作用可能對先天免疫有其特異性。. (二)調控基因表現脂肪酸會藉由調控基因表現與作為核接受器的配體 (ligand) 負向調控 (down-regulated)下游因子而影響細胞反應。舉例來說，very-long-chain n-3 PUFAs 會活化轉錄因子如 peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) 與抑制 sterol-regulatory-element binding proteins(SREBP) (Deckelbaum et al., 2006)。PPARs 屬於核接受器家族成員之一，目前已知有三種形式：PPARα, PPARβ/δ 和 PPARγ。 PPARα 在肝臟、小腸、腎臟和棕色脂肪組織(brown adipose tissue)中高度表現，在調控脂肪酸轉運和氧化、細胞增生和 inflammatory crosstalk 有重要的影響(Tan et al., 2003)。PPARβ/δ 主要參與脂質代謝、表皮細胞增生與傷口癒合(Grimaldi, 2005)。 PPARγ 在葡萄糖恆定、脂質代謝、細胞週期、發炎和致癌作用(carcinogenisis)扮演重要的角色，也是脂肪細胞分化因子(Feige et al., 2006)。PPARs 能夠藉由調控目標基因表現與 DNA 結合並參與發炎反應、脂質代謝與能量利用的調控，例如透過抑 28.

(39) 制 NFκB 活化(Deckelbaum et al., 2006)。因為脂肪酸影響許多基因，它們對於細胞反應的影響也很多樣化，從改變細胞表面黏著因子(adhesion molecule)表現到改變細胞激素的產生。. 29.

(40) 第第三章材料料與方法法. 第一一節實驗架構實構 (一)) 抗菌與抗抗發炎評估估製備山苦苦瓜萃取物. 抑菌實實驗. 抗發發炎活性評估估. (二)) 萃物暨其其區分物抗抗發炎評估估皂化物果實實 EA extracct 不皂化物物山苦瓜山萃萃取物葉. Methanolic extract Total pheno oc extract. 抗發炎活活性評估. in vitrro. in vivo. 30. Fattyy acids analy ysis.

(41) 第二節. 樣品製備. 1. 山苦瓜粗萃物製備由花蓮農改場全中和先生提供不同品種之育種山苦瓜，並從宜蘭冬山鄉取得野生山苦瓜，將山苦瓜果實(全果)洗淨後冷凍乾燥，葉與藤洗淨後以37oC烘乾，再利用桌上型粉碎機(原泰奇機械，台北市)將樣品打成粉末冰存在-20oC備用。果實粉末以1：20 (w/v)比例分別以乙醇、正己烷、乙酸乙酯和冷水進行萃取，葉與藤粉末同樣以1：20 (w/v)比例以甲醇和冷水進行萃取。萃取方法是將粉末與溶劑混合，於室溫震盪24小時，抽氣過濾收集萃取液，剩餘粉末再與同體積之溶劑於室溫震盪24小時進行第二次萃取。甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯等有機溶劑萃取液進行減壓濃縮後獲得該萃取物，並以DMSO回溶，即得stock solution；水萃取液經冷凍乾燥後獲得水萃取物(aqueous extracts)，以PBS回溶後即得stock solution以進行後續實驗。. 2. 山苦瓜葉總多酚萃取物製備參考 Kumar 人的研究，將花蓮 1 號葉以 37oC 烘乾磨成粉末之後，每 5 克重加入 mL methanol/HCL(100:1, v/v)溶液，之後將混合液用 5,000 rpm 轉速離心，上清以減壓濃縮乾燥(45-50oC)，殘留物以 25 mL water/ethanol (80:20, v/v)溶液回溶之後，再用 25 mL ethyl acetate 萃取 4 次。取得有機層，以無水硫酸鈉(anhydrous sodium sulfate)脫水 30-40 分鐘，以 Whatman-40 filter 過濾後，在真空狀態下蒸發乾燥 (45-50oC)，即為總多酚萃取物(total phenoic extract, TPE) (Kumar et al., 2010)。萃取物以絕對酒精回溶成 stock solution 以進行後續實驗。. 3. 山苦瓜果實皂化物（S fraction）. 31.