行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
前濃縮流體注入快速氣相層析質譜、單蟲之微量分析及毛細
電泳質譜之發展與應用
計畫編號：NSC 88-2113-M-002-005
執行期限：87 年 8 月 1 日至 88 年 7 月 31 日
主持人：何國榮 台灣大學化學系
一、摘要
Part A: 薄膜送樣結合樣品前濃縮／快 速氣相層析質譜儀之研究 薄膜送樣系統結合快速氣相層析 質譜儀具有直接分析水中濃度低至 ppt 範圍之揮發性有機化合物的能力，於一 般操作條件下，其分析速度可以達到每 小時 20 個樣品以上，所以並不會喪失 其線上 及時分析的特性。在不經過任 何樣品前處理步驟的情形下，可以將水 溶液樣品中的三鹵甲烷與內標準物— 甲苯（或氘化的甲苯）於 40 秒內完全 分離測得，而其對三鹵甲烷分析的偵測 極限更是可以達到 2~8 ppt 的濃度範 圍，顯示本分析系統確實保存了薄膜送 樣質譜技術所具有的快速、靈敏特性， 並兼具了快速分離待測物的能力。研究 中雖然發現分析結果會受到來自穿透 薄膜之水分子的干擾，但是這干擾可以 藉由控制層析溫度或控制注入溫度來 加以克服。 本分析系統大體上來說，不但具有 良好的再現性，也具有極高的靈敏度。 在分離各種待測物的同時，不會喪失其 原有及時分析的特性，所以應能實際應 用在一些需要高準確度的分析領域，例 如在工廠或環境上對水中揮發性有機 化合物進行線上 及時分析監測等，特 別是當各分析物中具有相同的裂解離 子時。 P a r t B : 毛 細 電 泳 - 電灑游離離子化 質譜法於單隻昆蟲毒素偵測 之應用。 本實驗建立 Polybrene 塗佈毛細電泳 (CE)管柱配合酸性緩衝液作為磷脂 A2 的電泳分離條件，添加β-環糊精對 於完整 PLA 不同醣形式的分離可得最 佳結果。於未添加β-環糊精的電泳條件 中，我們利用胰蛋白 將 PLA 水解成 醣 來增加不同醣形式的分離解析 度，水解程度不一導致的醣 群造 成分析上的困難，利用篩離分子量為 3000 的過濾離心管可將醣 群與其 他 群分離，醣 群的雙硫鍵還 原後可得單獨醣 與其他 群， 此 時 不 同 醣 形 式 的 醣 分 子 量 為 1~3 kDa，於未添加β-環糊精的電泳條 件下可以將醣 與其他 群分離 開來並且解析部份的醣形式。毛細電 泳質譜可以清楚監測到 8 種不同醣形 式的醣 ，利用選擇離子偵測的模 式下來定量估計不同醣形式的含量比 例，可以得到變異係數~1%的結果。 關鍵詞：薄膜送樣、快速氣相層析、 質譜儀、三鹵甲烷、毛細電 泳、電灑游離，磷脂 A2二、緣由與目的
Part A: 薄膜送樣結合樣品前濃縮／快 速氣相層析質譜儀之研究 傳 統 上，分 析 水 中 揮 發 性 或 半揮 發 性 的 有 機 化 合 物，大 都 是 利 用 溶 劑 ( 如 C H 2C l2) 萃 取 或 吹 氣、捕 集 ( p u r g e a n d t r a p ) 技 術 來 做 分 離、濃 縮，然 後 再 以 氣 相 層 析 儀 ( g a s c h r o m a t o g r a p h y, G C ) 或 氣 相 層 析 質 譜 儀 (gas chrom atograph y/ mass s p e c t r o m e t r y, G C / M S ) 來 進 行 定 性、定 量 分 析，雖 然 這 是 一 種 分 析 水 中 揮 發 性 或 半 揮 發 性 有 機 化 合 物 的 有 效 方 法，但 是 在 整 個 分 析 過 程 中， 需 要 花 費 很 多 時 間 在 樣 品 前 處 理 上，因 此，不 論 是 在 環 境 污 染 源 的 監 測 或 是 在 工 業 流 程 的 監 測，都 無 法 提 供 立 即 而 有 效 的 分 析 結 果 來 作 為 判 斷 處 理 的 依 據。 薄 膜 送 樣 質 譜 分 析 技 術 ( m e m b r a n e i n t r o d u c t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y, M IM S ) 自 從 1 9 6 3 年 由 G e o r e g H o c h 及 B e s s e l K o k 提 出 以 後，經 過 一 段 時 期 的 沈 寂，1974年被 To u 等 人 改 良 應 用 ， 1 9 8 5 年 再 度 被 C o o k s 等 人 改 進 效 能 ， 終 於 以 其 快 速 的 分 析 速 度、高 度 的 選 擇 性、卓 越 的 靈 敏 度 以 及 不 須 樣 品 前 處 理 等 優 點，吸 引 了 研 究 人 員 的 注 意，而 且 其 構 造 簡 單、易 於 操 作 並 適 用 於 各 種 型 式 的 質 譜 儀，此 外，還 能 與 流 動 注 入 分 析 (flow injection anal ysis, F IA) 技 術 配 合 使 用，進 行 線 上 監 測。這 些 優 點，使 得 薄 膜 送 樣 質 譜 分 析 法 成 為 一 項 很 有 潛 力 的 分 析 技 術。 由 於 薄 膜 送 樣 技 術 是 利 用 利 用 樣 品 溶 液 通 過 薄 膜 時，其 中 所 含 待 測 之 揮 發 性 或 半 揮 發 性 的 有 機 化 合 物 幾 乎 同 時 穿 透 薄 膜 進 入 質 譜 儀 分 析，因 此 其 定 性 必 須 藉 由 特 性 離 子 來 判 定，若 樣 品 溶 液 中 同 時 有 多 種 待 測 化 合 物 具 有 相 同 的 特 性 離 子，則 在 定 性、定 量 上 將 會 有 誤 差 產 生，為 了 避 免 此 類 誤 差 的 產 生，必 須 藉 由 層 析 技 術 來 達 到 分 離 的 效 果，以 便 能 確 實 定 性、定 量。然 而，如 果 是 以 傳 統 的 氣 相 層 析 儀 來 進 行 分 離 工 作，少 者 數 分 鐘，多 則 數 十 分 鐘，則 薄 膜 送 樣 質 譜 技 術 原 先 所 具 有 的 及 時 監 測 之 優 點 將 因 而 喪 失 。 近 年 來 已 有 許 多 文 獻 報 導 利 用 薄 膜 送 樣 質 譜 分 析 技 術 進 行 線 上 環 境 及 程 序 分 析，更 有 研 究 人 員 利 用 冷 凍 聚 集 (cold-trap ) 來 進 行 樣 品 前 濃 縮，以 達 到 降 低 偵 測 極 限 的 目 的。本 實 驗 室 希 望 能 藉 由 犧 牲 部 份 及 時 監 測 的 特 性，利 用 樣 品 前 濃 縮 技 術 來 聚 集 並 提 升 進 入 質 譜 儀 的 樣 品 量，另 外 配 合 上 快 速 氣 相 層 析 技 術，將 各 種 待 測 物 於 極 短 的 時 間 內 分 離 測 定，以 獲 得 較 低 的 偵 測 極 限 及 較 精 確 定 性、定 量 的 優 點 。 P a r t B : 毛 細 電 泳 - 電灑游離離子化質 譜法於單隻昆蟲毒素偵測之 應用。 電灑離子化質譜法是在1大氣壓下 將分析物游離，為大氣壓力下游離質譜 法之其中一種，為近年來廣為使用的軟 性游離法之一，尤其搭配上液相層析儀 或毛細管電泳法與質譜的連線，更可針 對微量分析物進行管柱上的前濃縮及分 離雜質，方法應用上非常廣泛。毛細電 泳的高解析度與須樣品量少更成為與質 譜連線分析生化樣品的利器。相對於較 高流速的電灑法而言，微量電灑法是近 年才興起的技術，利用特製鍍金的毛細 管電灑探針和穩定的背壓以持續傳送探 針內之樣品，只需要不到 1 μl的分析 物，便能以 20~40 nl/min的流速完全持續 地電灑離子化分析物，而且靈敏度不輸 一般之電灑法。除了所需樣品少外，對 於不同之溶液組成、pH值和緩衝鹽類濃 度更具有廣大範圍的適應度，很適合搭 配質譜儀作為微量生物分子之偵測方
法。 本實驗室先以微量電灑法測試蜂毒中的 成份，發現除了melittin外，還發現醣蛋 白磷脂 部份不同的醣形式，引起我們 對於不同年齡、蜂種或蜂隻之間PLA醣 形式含量分佈的興趣，因此嘗試以簡單 省時之採樣新方法，對於單隻毒蜂取得 毒素樣品，利用毛細電泳配合質譜連線 來進行PLA不同醣形式之定性與定量分 析，此時質譜可以針對特性子離子做定 量上之應用，可以使得訊雜比升高而增 加定量靈敏度。
三、結果與討論
Part A: 薄膜送樣結合樣品前濃縮／快 速氣相層析質譜儀之研究 薄膜送樣結合樣品前濃縮／快速 氣相層析質譜儀分析系統是以蠕動幫 浦將三鹵甲烷樣品溶液以連續流動的 方式將其載入薄膜送樣系統中，其流速 為 1.2 ml/min，並於樣品流的管路上加 上內標準溶液添加管路，內標準溶液係 以針筒式幫浦推送，藉由一個Ｔ型接頭 與樣品流管路連接，以連續注入到樣品 流溶液中，並藉由一段 3 公尺長的混合 管路(mixing coil, Teflon tubing 0.030 in. ID ×0.062 in. OD ×3 m)使樣品溶液與 內標準溶液能充分混合，而後流入薄膜 送樣裝置中的管狀矽膠薄膜內側。利用 冷凍聚焦裝置為薄膜送樣裝置及快速 氣相層析質譜儀的界面，並以載流氣體 將穿透薄膜的待測物在送到冷凍聚焦 裝置中濃縮聚焦。冷凍濃縮聚焦時，捕 集管的溫度為-165℃，濃縮結束後，捕 集管迅速加熱到 200℃將待測物脫附注 入分離管柱分離測定。所使用的分離條 件為 0.25 mm DB-5 MS 分離管柱及 50 ℃恆溫。 分析結果發現會有來自樣品中穿 透薄膜的水分子的干擾，經過實驗研究 後，我們發現不論是使用水分控制裝置 或利用吸附劑來除水，都會增加分析的 時間，而且也會影響的分析的靈敏度。 幸運的是，我們也發現到有兩種方法可 以在不增加分析時間的情況下克服這 個問題，一是利用控制注入溫度；另一 則是控制層析溫度。實驗結果顯示將注 入溫度控制在 0℃時，不但可以克服水 分子干擾，增加靈敏度，而且可以控制 水分子由捕集管釋出的時間。至於控制 層析溫度則是利用改變層析溫度，以使 三鹵甲烷的滯留時間避開水分子出現 的滯留時間。經比較這兩種解決方式後 發現，控制注入溫度不但在降低水分子 干擾上有較好的效果，其適用範圍也較 廣。 實驗以控制注入溫度的方式繼續 進行，圖一為本分析系統測定 10 ppb 三鹵甲烷及 2 ppb 甲苯(內標準物)所得 的層析圖。研究顯示本分析系統分析三 鹵甲烷標準溶液時，連續 5 次測試的結 果，其相對標準偏差在未使用內標準物 時，介於 1.22 % 與 5.01 % 之間，而使 用內標準物時則介於 1.75 % 與 5.03 % 之間，顯示本分析系統不論是否使用內 標準物，均具有良好的再現性。另外， 本研究中對偵測極限的探討係以一系 列不同濃度三鹵甲烷的標準溶液來進 行，偵測極限係採用訊號 雜訊為 3 之 定義。分析結果三鹵甲烷的偵測極限分 別為，三氯甲烷 2 ppt、二氯一溴甲烷 4 ppt、一氯二溴甲烷 4 ppt 以及三溴甲烷 8 ppt，顯示本分析系統具有在極短的時 間內分析極低濃度三鹵甲烷樣品的能 力，而其偵測極限則約較傳統的薄膜送 樣系統降低了 10~100 倍。 本分析系統在經過一連串的相關 研究測試後，我們將其實際應用到飲用 水的即時分析，真實樣品係取自實驗室 自來水。首先我們配製一系列濃度分別 是空白、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 及 20.0 ppb 的三鹵甲烷標準溶液，每一 濃度連續測定三次以求其平均值，結果 顯示每個濃度重複三次分析所得的相 對標準偏差介於 0.45％與 5.40％之間 ，而三鹵甲烷校正曲線所得的線性係 數也都在 0.994 以上。然後將實驗室的自來水由水龍頭經過水管直接導入薄 膜送樣系統進行線上及時分析，其分析 條件與校正曲線相同，並將所得結果代 入校正曲線求得濃度，結果顯示在這段 間內三鹵甲烷各化合物的平均濃度分 別為三氯甲烷 3.8 ppb、二氯一溴甲烷 3.7 ppb、一氯二溴甲烷 2.1 ppb 以及三 溴甲烷 0.6 ppb，將這結果與先前有關 台灣自來水中三鹵甲烷的研究資料相 比較，應該都是在合理範圍內，證明本 分析系統具有相當高的實用性。 P a r t B : 毛 細 電 泳 - 電灑游離離子化質 譜法於單隻昆蟲毒素偵測之 應用。 磷脂 A2(PLA)約佔蜜蜂毒液乾 燥後的百分之十二到十四左右，PLA 是 蜜蜂毒液中主要的蛋白質之一，具有引 起人體過敏的特性，屬於鹼性的醣蛋 白，PLA 總共含有 134 個氨基酸，分子 量約 15.7 kDa，只含有一個位於 Asn13 的醣化位置。我們建立一套對於蜂毒中 醣蛋白 (PLA) 分析的前處理方法，來改 善需量多、費時及多步驟的傳統蜂毒分 析之缺點，並利用毛細電泳質譜分析醣 蛋白中不同醣形式(glycoforms)的含量 差異。 本實驗建立 Polybrene 塗佈毛細電 泳(CE)管柱配合酸性緩衝液作為磷脂 A2 的電泳分離條件，添加β-環糊精 對於完整 PLA 不同醣形式的分離可得 最佳結果，於毛細電泳質譜(CE-MS)實 驗中，β-環糊精的存在強烈抑制其他物 種的電灑游離。於未添加β-環糊精的電 泳條件中，我們利用胰蛋白 將 PLA 水解成醣 來增加不同醣形式的分 離解析度，水解程度不一導致的醣 群造成分析上的困難，利用篩離分子量 為 3000 的過濾離心管可將醣 群與 其他 群分離，醣 群的雙硫鍵還 原後可得單獨醣 與其他 群，此 時不同醣形式的醣 分子量為 1~3 kDa，於未添加β-環糊精的電泳條件下 可以將醣 與其他 群分離開來 並且解析部份的醣形式。毛細電泳質譜 可以清楚監測到 8 種不同醣形式的醣 ，利用選擇離子偵測的模式下來定 量估計不同醣形式的含量比例，可以得 到變異係數~1%的結果。 我們將進一步嘗試針對不同種類或年 齡之單蜂，進行成蜂與幼蜂或不同蜂 種醣蛋白間不同醣形式含量差異之分 析，對於了解蜂毒之形成過程與差異 有相當的助益。
四、計畫成果自評
Part A: 薄膜送樣結合樣品前濃縮／快 速氣相層析質譜儀之研究 1 . 成 功 連 結 了 薄 膜 送 樣 ／ 樣 品 前 濃 縮 ／ 快 速 氣 相 層 析 ／ 質 譜 儀 技 術 ， 保 存 了 薄 膜 送 樣 質 譜 技 術 即 時 分 析 的 優 點 ， 並 增 加 了 系 統 的 快 速 分 離 能 力。 2 . 克 服 了 來 自 穿 透 薄 膜 水 分 子 的 干 擾 ， 確 保 的 分 析 結 果 的 正 確 性。 3 . 利 用 樣 品 前 濃 縮 技 術 有 效 提 升 了 系 統 的 靈 敏 度 ， 其 偵 測 極 限 約 較 傳 統 薄 膜 送 樣 質 譜 技 術 降 低 1 0 1 0 0倍 。 4 . 證 明 本 分 析 系 統 確 實 可 以 應 用 在 實 際 水 樣 的 分 析。 P a r t B : 毛 細 電 泳 - 電灑游離離子化 質譜法於單隻昆蟲毒素偵測 之應用。 1. 利用微量電灑游離/離子阱質譜儀對 於單蜂蜂毒成份之定性與定量。 2. 以毛細管電泳/離子阱質譜連線對於 蜂毒進行分離、濃縮，達成對其定性 與定量。五、參考文獻
Part A:
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513. 圖一、 本分析系統測定三鹵甲烷及甲苯(內標準物)所得的層析圖 0.200 0.400 0.600 0.800 rt 0 1000 % (Min) Toluene CHCl3 CHBrCl2 CHBr2Cl CHBr3
PLA Glycofor ms
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Fucα1-6
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Fucα1-3 Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-3
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-3
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Fucα1-6 Fucα1-3 Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Fucα1-6 Manα1-3
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-3
Fucα1-3 Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-3
Manα1-3 Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc Manα1-3
Fucα1-3 Fucα1-6
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 8 GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3
Fucα1-3
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 9-1 GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3
Fucα1-3
Fucα1-6
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 9-2 GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3
Fucα1-3 Fucα1-3
Manα1-6
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 10 GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3
Fucα1-3 Fucα1-3 Fucα1-6 7 6 5-2 5-1 4 3-2 3-1 2-2 2-1 1
