含雙叉桿菌乳酸菌發酵豆奶產品之製備(1/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫執行進度報告

含雙叉桿菌乳酸菌發酵豆奶產品之製備

計畫編號：

執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日

報告日期：89 年 5 月 24 日

主持人：周正俊 國立台灣大學食品科技研究所

6.48 log cfu/ml，S. thermophilus 則生長快

速，但經 16 小時之發酵即致豆奶發生過度 酸化（late-acidification）現象。混合雙叉桿 菌及乳酸菌發酵的結果，B. infantis、B.

longum 分別與 L. acidophilus 共同培養時， L. acidophilus 於 32 小時後菌數達到最高

值，分別為 7.63 log cfu/ml 和 7.07 log cfu/ml，而其後雙叉桿菌則只有些微的成 長。雙叉桿菌與 L. bulgaricus 共同培養時， 後 者 並 無 生 長 跡 象 。 雙 叉 桿 菌 與 S. thermophilus 於 豆 奶 中 發 酵 時 ， S. thermophilus 於 24 小時即可產生最多的菌 數。加糖至發酵豆奶中使糖度達 15°Brix 後，貯存在 25℃或 5℃下，並另以無菌水 取代糖溶液作為對照組進行試驗，過程中 豆奶之 pH 值均隨貯存時間之延長而呈下 降之現象。在 25℃貯存者，pH 下降之幅 度，高於在 5℃貯存者，而其中又以添加有 糖液者，pH 下降之幅度最大。菌數減少情 形亦以在 25℃貯存者多於在 5℃貯存者， 且加糖組又多於未加糖組。然而經 5℃貯存 十天者，無論加糖或未加糖的組別，其菌 數均能維持在 106 CFU/ml 以上，故均達可 接受之標準而對人體健康有益。然而四組 在試驗過程中，無論在搭配何種雙叉桿菌 發酵，乳酸菌變化情形均相似，故雙叉桿 菌似乎不影響乳酸菌之生長，然而雙叉桿 菌卻因乳酸菌產酸的結果，特別是在 25℃ 加糖處理的情況下，活菌數大幅下降。發 酵過程中豆奶之醋酸和乳酸含量隨著發酵 時間之延長而增加，其中由於乳酸菌在後 期產生乳酸，使乳酸增加量提高，然而降 低豆奶 pH 值致雙叉桿菌無法存活而不能 產生醋酸，故醋酸增加量減少。 關鍵字：雙叉桿菌、乳酸菌、發酵豆奶 二、緣由與目的

黃豆(Soybean, Glycine max L. Merill) 是一種極具營養價值的豆科(Leguminose) 植物產品，它含有大約 40％(N×6.25)的蛋 白質及 25％的油脂。但黃豆中含極高脂氧 化酵素(lipoxygenase)活性，常造成產品之 豆臭味，而黃豆中含無法被人體消化道分 解之寡糖，被腸道中能分泌α-galactosidase 的細菌加以水解而產生氣體，會造成消化 不良、脹氣(Thananunkul et al., 1976)。為了 減少黃豆產品上述之缺點，利用乳酸菌來 進行乳酸發酵乃被認為是可行途徑之一， 這類產品除提供良好之營養價值外，亦如 乳酸菌對牛乳之發酵一樣，進一步改進產 品之風味與營養價值。 近 幾 年 由 於 對 於 雙 叉 桿 菌 (Bifidobacterium)在牛奶及奶製品中之生長 及扮演功能之研究與之瞭解，在乳製品中 添加雙叉桿菌乃為一種趨勢，因為如此可 提供具良好風味之產品又能有益於使用者

之健康。雙叉桿菌有助於腸道中正常微生 物族群之維持。Haenel (1970)指出喝母乳之 嬰 兒 腸 道 中 之 腐 敗 菌 如 Bacteroides ， Veillonella，Clostridium，Proteus 等皆明顯 的較少。此種拮抗機制，主要在於雙叉桿 菌可透過生長代謝中產生的醋酸和乳酸， 有效維持腸道保持在較低之 pH 值（pH 約 5.5）（Barbero et al., 1952），而使病原性 及腐敗性細菌不易生長。 過去吾人曾初步進行雙叉桿菌在豆奶 中生長之探討，發現雙叉桿菌在豆奶中生 長 2 天後菌數可增殖至約 108 /ml 且可分解 黃豆造成食用者脹氣之寡糖類，復因乳酸 菌有益人體健康且能幫助產生良好風味， 故吾人企圖進行含雙叉桿菌乳酸菌發酵豆 奶產品製造之探討。在此研究中將比較不 同雙叉桿菌在豆奶乳酸發酵過程中之存 活，以瞭解其對發酵豆奶成分之影響。 三、結果與討論 1.試驗菌株之篩選 在雙叉桿菌菌株選擇上，侯（1997） 曾進行雙叉桿菌在豆奶中生長之探討，發 現 B. infantis 及 B. longum在豆奶中生長 48 小時後，菌數可增殖至 108 cfu/ml，且可分 解 黃 豆 造 成 食 用 者 漲 氣 之 寡 醣 類 。 B. longum 是嬰兒腸道、成人腸道及人體陰道 等 三 個 部 位 最 常 見 之 雙 叉 桿 菌 ， 而 B. infantis 則主要分佈在嬰兒腸道中（Scardovi, 1986）。由 於 雙 叉 桿 菌 具 有寄主專一性 （host-specificity），因此，在選擇雙叉桿 菌為膳食添加物時，應考慮其為人體來源 （human-origin）之菌株，才能期待其能在 人體腸道中成為優勢族群，進而維持菌叢 生態相之平衡，發揮其機能性功能，故選 擇此二株雙叉桿菌菌株為實驗菌株。至於 乳酸菌菌株則擇取常用於發酵乳製造的

Streptococcus thermophilus 、 Lactobacillus acidophilus 及 L. bulgaricus 進行試驗。 將活化過的雙叉桿菌及乳酸菌菌株分 別及混合接種至豆奶中，使其初始菌數為 103∼104 cfu/ml，置於 37℃下培養 48 小 時，定時取出，測其 pH 值及滴定酸度，並 以平板計數法（pour plate）來測定其菌落 數。單獨培養時，雙叉桿菌的生長情形見 圖一、二，顯示以 B. infantis 之情況較佳， 48 小時後菌數可達 8.12 log cfu/ml，此與侯 （1997）之結果相符。圖三∼五則為乳酸 菌的生長情形，L. acidophilus 經 48 小時培 養後菌數為 7.17 log cfu/ml，然 L. bulgaricus 卻只有 6.48 log cfu/ml，S. thermophilus 則 生長快速，但經 16 小時之發酵即致豆奶發 生過度酸化（late-acidification）現象，故含

S. thermophilus 組不需太長的發酵時間。

混合雙叉桿菌及乳酸菌發酵的結果示 於 圖 六 ∼ 十 一 。 圖 六 及 圖 七 顯 示 ， B.

infantis、B. longum 分別與 L. acidophilus 共

同培養時，L. acidophilus 於 32 小時後菌數 達到最高值，分別為 7.63 log cfu/ml 和 7.07 log cfu/ml，而其後雙叉桿菌則只有些微的 成 長 。 圖 八 及 九 顯 示 ， 雙 叉 桿 菌 與 L. bulgaricus 共同培養時，後者並無生長跡 象，Wang 等（1974）指出，L. bulgaricus 在豆奶中經 48 小時培養後，並無生長情 況，推測是豆奶中缺乏容易供其代謝利用 的醣類所致；而 L. acidophilus 於豆奶中則 能生長，且添加葡萄糖及乳糖至豆奶中可 提高其生長速率。學者將 B. bifidum 加入含 L. bulgaricus 及 S. thermophilus 脫脂奶粉以 製成發酵乳發現，B. bifidum 的存在會使 L. bulgaricus 較於未添加 B. bifidum 之發酵乳 中所含菌數為低，推測是由於 L. bulgaricus 得不到某些兩者都需要之生長因子，或 B. bifidum 可能產生對其有害的代謝物所致

（Baig and Prasad, 1996）。故以雙叉桿菌 和 L. bulgaricus 為菌 時，可能由於營養 需求及生長習性相近而發生競爭現象，致 影響 L. bulgaricus 的生長，故 L. bulgaricus 並不合適與雙叉桿菌搭檔成為豆奶發酵的 菌 。由圖十及十一中發現，B. infantis、 B. longum 分別與 S. thermophilus 於豆奶中 發酵時，S. thermophilus 於 24 小時即可產 生最多的菌數，分別為 7.52 log cfu/ml 及 7.41 log cfu/ml，又因快速產酸，豆奶的 pH 值較同時期其他混合菌所得結果為低，且 此 時 雙叉桿菌菌數亦分別達到 7.21 log cfu/ml 及 6.90 log cfu/ml，其後只有些微的 成長，表示雙叉桿菌與 S. thermophilus 可於

較短時間內完成豆奶發酵。

就 生 長 速 度 而言 ，B. infantis 和 L.

acidophilus 發酵 32 小時後，B. infantis 增加

3.72 log cfu/ml，L. acidophilus 增加 4.04 log

cfu/ml；而B. longum 和 L. acidophilus 發酵

32 小時後，B. longum 增加 3.39 log cfu/ml， L. acidophilus 增加 3.25 log cfu/ml，其量均

較含 B. infantis 組者為少，而同樣的情形亦 於兩株雙叉桿菌分別與 S. thermophilus 共 同發酵時出現，故知 B. infantis 較 B. longum 能於豆奶中促進乳酸菌生長。 表一彙整了圖一∼十一各發酵過程之 關鍵時刻的菌數及 pH 值。以 B. infantis、

L. acidophilus 及 B. longum、L. acidophilus

共同發酵豆奶，經過 32 小時後，乳酸菌數 均達最高值，分別增加了 4.04 log cfu/ml 及 3.25 log cfu/ml ， 均 較 單 獨 以 L. acidophilus 發酵豆奶之同期增加量（2.65 log cfu/ml）為多，而雙叉桿菌則亦達到高 且趨於穩定的菌量，其增加量也比個別單 獨發酵豆奶之同時期為多。以 B. infantis、 S. thermophilus 及 B. longum 、 S. thermophilus 進 行 發 酵 ， 經 24 小 時 S. thermophilus 均達到最高菌量，其後雖雙叉 桿菌仍有少許增加的菌量，但 pH 值已分別 降至 4.37 與 4.22 以下，Rasic and Kurmann （1983）指出，當培養液 pH 值下降至 4.3 以下時，菌數會快速下降，是以其環境並 不適和雙叉桿菌持續存活，故以 24 小時為 發酵終點；此外，混合培養時個別菌株所 增加的菌量亦較單獨培養時所增加者為 高。 2.發酵豆奶貯存時雙叉桿菌及乳酸菌之存 活 發酵飲料之微生物組成和產品貯存時 菌數穩定性之維持，是發酵產品之重要特 性。Hammer and Marth（1984）提出在酸 酪乳（yogurt）之安全貯存期間內，乳酸菌 活菌數至少應維持在 106 CFU/ml 以上，才 為可接受之產品標準。將雙叉桿菌與乳酸 菌接種於豆奶進行適當之發酵後，將有無 添加糖液之豆奶分別置於 5℃及 25℃下貯 存 10 天，觀察雙叉桿菌、乳酸菌之存活及 pH 變化之情形，結果示於圖十二∼十六。 無論是在 25℃或 5℃下，發酵豆奶在貯存 過程中其 pH 值均隨貯存時間之延長而呈 下降之現象。在 25℃貯存者，pH 下降之幅 度，高於在 5℃貯存者，而其中又以添加有 糖液者，pH 下降之幅度最大。菌數減少情 形亦以在 25℃貯存者多於在 5℃貯存者， 且加糖組又多於未加糖組。然而經 5℃貯存 十天者，無論加糖或未加糖的組別，其菌 數均能維持在 106 CFU/ml 以上，故均達可 接受之標準而對人體健康有益。 圖十二為 B. infantis 與 L. acidophilus 共同發酵豆奶貯存 10 天的菌數變化及 pH 值變化結果。由（A）所代表的 B. infantis 菌數變化可發現，B. infantis 隨著貯存時間 增加而減少，其中以 25℃貯存並加糖處理 者，10 天後減少 5.96 log cfu/ml，Rasic 和 Kurmann（1983）推測是由於L. acidophilus 會產生過氧化氫，而雙叉桿菌無法生成分 解過氧化氫的觸 ，故為過氧化氫所直接 毒 害 致 死 。 圖 十 三 為 B. infantis 與 S. thermophilus 共同發酵後貯存的結果，經 25 ℃ 貯 存 並 加 糖 處 理 後 ， 由 於 S. thermophilus 迅速產酸的結果，十天後 pH 值降為 3.56，而 B. infantis 於 8 天即無法測 到 菌 數 。 圖 十 四 為 B. longum 與 L. acidophilus 的貯存結果，與圖十二相較， B. longum 活菌數下降情形較 B. infantis 為 明顯，於 5℃貯存並加糖處理後，菌數十天 後下降 6.28 log cfu/ml。圖十五為 B. longum 與 S. thermophilus 的貯存結果，以 25℃貯 存並加糖處理時，B. longum 於 6 天後即無 法測得，其死滅的速度同與 S. thermophilus 一起發酵、貯存之 B. infantis 為快。 試驗過程中，無論搭配何種雙叉桿菌 發酵，乳酸菌變化情形均相似，故雙叉桿 菌似乎不影響乳酸菌之生長，然而雙叉桿 菌卻因乳酸菌產酸的結果，特別是在 25℃ 加糖處理的情況下，活菌數大幅下降。 3.豆奶發酵過程中醋酸和乳酸含量之變化 雙 叉 桿 菌 最 初 被 歸 類 為 乳 酸 菌 屬 （Lactobacillus spp.），但由於其具特殊之 代 謝 途 徑 ， 不 同 於 乳 酸 菌 之 同 型 發 酵

（ homofermentative ） 與 異 型 發 酵 （heterofermentative），而將其自乳酸菌屬 中分離出來，單獨成為一屬。理論上，雙 叉 桿 菌 利 用 其 特 殊 之 酵 素 fructose-6-phosphate phosphoketolase （F6PPK）將 2 莫耳之六碳糖發酵產生 3 莫耳之醋酸與 2 莫耳之乳酸，但有時雙叉 桿 菌 會 將 丙 酮 酸 經 phosphoroclastic splitting 分解成醋酸，使得培養液中醋酸與 乳酸之比例大於 3/2，此種現象主要發生於 菌體生長之對數期（Rasic and Kurmann, 1983）。乳酸菌依產物的不同分為同型發 酵及異型發酵，對醣類分解時前者僅產生 乳酸，後者則除乳酸外還伴隨其他物質， 而 L. acidophilus 及 S. thermophilus 均屬於 同型發酵乳酸菌，故發酵時會產生大量乳 酸。表二為所試之雙叉桿菌及乳酸菌發酵 豆奶產生之醋酸和乳酸的含量及其比例。 結果顯示，在不同發酵時間，混合菌株在 豆奶中代謝所產生的醋酸和乳酸比值隨著 發酵時間之延長而減少。B. infantis 和 L. acidophilus 共同發酵 8 小時後，其比值為 1.65，可能是期間B. infantis 處於對數期且 生長較 L. acidophilus 為迅速，菌體將丙酮 酸經 phosphoroclastic splitting，產生較多之 醋酸所致。其後乳酸菌生長，逐漸蓄積乳 酸，致比例於 32 小時降至 1.40。B. longum 和 L. acidophilus 共同發酵 8 小時後，其比 值為 1.95，較含 B. infantis 組為高，應是由 於初期 L. acidophilus 生長不及含 B. infantis 組者；而 32 小時後其比值降為 1.02，較含 B. infantis 組為低，推測是由於 B. longum 所產生的醋酸較 B. infantis 為少所致。B. infantis 和 S. thermophilus 共同發酵之豆奶 則因 S. thermophilus 快速產酸的結果，致比 值自培養初期即無法超越 1.5，並於 32 小 時降至 0.54。在 B. longum 和 S. thermophilus 共同發酵的豆奶也有相似的情況。 四、參考文獻 1. 侯仁琬。1997。雙叉桿菌發酵豆奶之研 究。國立台灣大學食品科技研究所碩士 論文。台北市，台灣。

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表一、雙叉桿菌與乳酸菌在豆奶中之 pH 值 及菌數變化情形

Table. 1. pH value and colony counts of

Bifidobacterium spp. and lactics growing in soymilk

Initial range After 24 h After 32 h Micro-organisms pH CFU/ml pH CFU/ml pH CFU/ml

B. infantis 6.50 3.61±0.06 6.33 6.88±0.34 5.57 7.23±0.12 B. longum 6.50 3.61±0.06 6.08 6.32±0.24 6.04 7.26±0.12 L. acidophilus 6.50 3.34±0.03 6.45 5.97±0.13 6.44 5.99±0.14 S. thermophilus 6.50 3.63±0.10 3.95 7.88±0.07 3.88 7.69±0.07 B. infantis + L. acidophilus 6.50 3.92±0.17 3.59±0.22 5.98 7.57±0.24 7.36±0.21 5.59 7.64±0.03 7.63±0.29 B. infantis + S. thermophilus 6.50 3.01±0.10 3.10±0.01 4.45 7.21±0.19 7.52±0.06 4.37 7.20±0.20 7.39±0.08 B. longum + L. acidophilus 6.50 3.86±0.13 3.82±0.24 6.24 6.94±0.39 6.98±0.13 6.07 7.25±0.37 7.07±0.04 B. longum + S. thermophilus 6.50 3.02±0.03 3.03±0.09 4.34 6.90±0.09 7.41±0.04 4.22 6.94±0.08 7.30±0.17 表二、利用雙叉桿菌和乳酸菌發酵豆奶產 生之醋酸和乳酸之含量變化

Table 2. Contents of acetic acid and lactic acid in soymilk fermented with

Bifidobacterium spp. and lactics

Content (mmol/L) Fermentation

time (h) Acetic acid Lactic acid

Acetic acid/ Lactic acid —Fermented with B. infantis and L. acidophilus— 8 15.41±2.52 d 9.33±0.44 d 1.65 16 18.31±1.27 c 12.80±0.86 c 1.43 24 18.85±0.42 b 13.34±0.09 b 1.41 32 19.01±1.08 a 13.56±0.38 a 1.40

—Fermented with B. infantis and S. thermophilus— 8 11.32±0.21 b 9.99±1.89 d 1.13 16 11.54±0.61 b 13.45±1.38 c 0.86 24 13.84±0.14 a 21.98±2.92 b 0.63 32 13.93±0.45 a 25.78±2.02 a 0.54

—Fermented with B. longum and L. acidophilus— 8 10.08±0.32 c 5.52±0.06 d 1.95 16 12.02±0.72 b 6.47±0.39 c 1.86 24 12.11±0.42 b 7.47±1.72 b 1.62 32 12.36±1.55 a 12.15±1.36 a 1.02

—Fermented with B. longum and S. thermophilus— 8 11.33±0.33 c 10.08±0.20 d 1.12 16 11.68±0.29 c 11.17±0.74 c 1.05 24 12.64±0.17 b 12.15±0.30 b 1.04 32 13.14±0.58 a 13.84±1.17 a 0.95

*Values in the same column with different superscripts were significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05)