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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※ 果蠅 SMT3 蛋白基因及功能研究 ※
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計畫類別：
þ
個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC
89-2311-B-110-006-執行期間： 88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
計畫主持人：黃弘文
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立中山大學生物醫學研究所
中 華 民 國 89 年 10 月 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
果蠅 SMT3 蛋白基因及功能研究
xpression of Drosophila smt3 and protein function
計畫編號：NSC 89-2311-B-110-006
執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
主持人：黃弘文 國立中山大學生物醫學所
一、中文摘要 Smt3 蛋白在許多生物中具有強烈的胺 基酸演化保守性。在高等動物中有三種異 構脢存在：smt3A, smt3B 及 smt3C。果蠅 Smt3 蛋白質含 90 胺基酸與哺乳類約有 70% 相似度。目前的研究指出，smt3C 蛋白質 之作用方式類似 ubiquitin，但和其作用蛋 白質則和 ubiquitin 有相當的差異。本計畫 以果蠅模式，已定位果蠅之 smt3 之基因於 27C 位置，及定出其 intron 等基因結構。 我 們 發 現 果 蠅 其 有 二 個 smt3 轉 錄 子 (transcripts), 並 測 定 它 們 在 胚 胎 中 的 表 現。 關鍵詞：smt3，基因結構，轉錄子 AbstractThe SMT3 proteins were identified to exhibit strong amino acid sequence conservation among various species. This indicates the functional significance of the SMT3 protein. The sequence of 90 amino acids from Drosophila was also found to
have 70% identity to that of mammalian SMT3 proteins. There are three isoforms of SMT3 in mammals: SMT3A, SMT3B, and SMT3C. The mechanism of SMT3C action is similar to ubiquitin, though their target proteins are different. The functions of SMT3A and SMT3B proteins are unclear. We had mapped smt3 gene to drosophila chromosome 27C, and determined the gene structure of it including intron position. We also find that 2 transcripts expressed in
Drosophila. Expression of the 2 transcripts
in Drosphila embryo is determined by in situ
hybridization.
Keywor ds: smt3, gene structure, transcript.
二、緣由與目的
在 1995 年時，中山大學生物系李水龍 實驗室從豬的 cDNA 中發現一段約 230bp 的序列，經過 EST 序列比對後，發現其與 人的一段 EST 非常的類似(Mannen et al., 1996))，進一步的比對發現許多生物均有與 其對應的序列，且均有相當高的相似性。 後來發現這個序列即是對應酵母菌之 SMT3。初期我們的研究即集中在探討 SMT3 蛋白在演化及蛋白表現上的研究 (Choudhury et al., 1997; Huang et al., 1998;
Chen et al., 1998)。
目前在較高等的動物中，已發現 3 種 SMT 蛋白異構 (A,B,C)存在。人類的 SMT3A 已定位於染色體 21 (Lapenta et al.,
1996)，，我們研究了人類的 Hsmt3B 蛋白 發現它與 Hsmt3A 有相當高的類似，在胺 基酸的組成上，Hsmt3A 與 Hsmt3B 只在中 間相差 2-3 個胺基酸，在蛋白質 C-端末端 Hsmt3A 則比 Hsmt3B 多了約 10 個胺基酸 (Mannen et al., 1996; Lapenta et al., 1996)。
在 Smt3C 的研究中發現它對應到以往發現 的幾種蛋白質: SUMO-1, GMP1, PIC1, UBL1, sentrin。
Lehembre et. al.(MCB 20:1072, Feb.,
2000)發表果蠅的 smt3 實 上的結果, 其 中，Drosophila smt3 會與 PML binding, 顯
示果蠅的 smt3 與細胞核之 small nuclear body targeting 有關, 另外他們找到了另 一個 cell differentiation factor Ttk69
3 與 smt3 有 covalent bonding, 由於 Ttk69 本身為一個 transcriptional repressor，而這個報告亦指出另一個 smt3 functional pathway，即與一些 transcriptional activator/repressor 作用，Kim et. al. (PNAS,1999)亦發表
transcriptional factor HIPK2 (homeodomain-interacting protein kinase 2)會經由 Ubc9 的幫助與 smt3c (SUMO-1)結合。此外 Lehembre et. al 亦
指出果蠅的 smt3 可能和細胞核的 transport 相關 。 目前為止的數據顯示果蠅的 smt3 功能 可能與已發表的 smt3C 相當接近。由於果 蠅的 smt3 在演化數據上較接近 smt3A, smt3B (Huang et al., 1999), 因此雖然 目前的資料顯示，在果蠅上 smt3 功能上有 許多和 smt3C 是一致的，但也有一些功能 可以演化成 smt3A, smt3B 在高等動物上的 相關功能，而這也是我們關心的部分。 三、結果與討論 本年度的研究計劃，我們成功的將 fly smt3 定位至染色體 2L 之 27C6-8 的位置， 並經由基因比對分析，將基因之結構解 析。 由於 我 們發 現 果蠅 的 smt3 有二個 transcripts，且在各 developmental stages 有 不同的表現 (Huang et al., 1998)，顯示果蠅 的 smt3 的 二 種 transcript 可 能 和 其 developmental stage 有相關性。由於 smt3 目前已被認為是一個 consistently expressed protein，但又和許多蛋白有 interaction，故 其調控及機制相當的重要。 我們設計 PCR primers 來測試其基因 結構, 利用染色體 DNA 及 cDNA 做模板, 我們定出了 smt3 5 端有一個 122 bp intron, 位置在 start codon –86 到-217。另外, 我們 利 用 RACE 的 方 法 定 出 二 個 轉 錄 子 的 transcription start site 及其 3 端結果 的位置, transcription start site 在距 離 start codon –290 的位置, 而第一個轉 錄子 3 端結束在距離 start codon 560 的 個置, 第二個轉錄子的結束位置約距離 start codon 1390 bp。利用上述的二個 primer 當探針, 以果蠅胚胎做原位雜交實 驗, 我們發現此二個轉錄子的表現方式類 似。 四、計畫成果自評 本計畫我們已初步的達成研究 smt3 基 因的結構, 決定了此基因之內子位置及其 轉錄起始位置, 並發現了二個轉錄子。雖然 此二個轉錄子均產生同一個蛋白產物, 我 們相信有不同的調控存在, 如較長轉錄子 其 3 端可能有調控因子的結合,可以朝向此 二轉錄子之穩定性及轉錄效率的方向進行 研究。 五、參考文獻
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