以SCA17基因轉殖小鼠及其小腦初級培養平台評估具有抗氧化作用之化合物及天然物

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(1)國立臺灣師範大學命科學系碩士論文. 以 SCA17 基因轉殖小鼠及其小腦初級培養平台評估具有抗氧化作用之化合物及天然物 Evaluation of Potential Antioxidative Compounds and Natural Products Using SCA17 Transgenic Mice and Cerebellar Primary Culture 研究生: 陳翔文 Shiang-Wen Chen. 指導教授: 謝秀梅博士 Hsiu-Mei Hsieh, Ph. D.. 中華民國一 O 三年七月.

(2) 目錄縮寫表......................................................................................................... 1 中文摘要 .................................................................................................... 3 英文摘要 .................................................................................................... 5 壹、介紹 .................................................................................................... 7 貳、研究目的 .......................................................................................... 16 叁、研究材料與方法 .............................................................................. 17 肆、結果 .................................................................................................. 28 伍、討論 .................................................................................................. 35 陸、參考文獻 .......................................................................................... 41 柒、圖表 .................................................................................................. 49.

(3) 縮寫表縮寫. 全名. AD. Alzheimer’s disease. ADCAs. autosomal dominant cerebellar ataxias. BCA. bicinchoninic acid. CAT. catalase. Cu/ZnSOD. copper-zinc containing SOD. DAB. diaminobenzidine. DMSO. dimethylsulfoxide. DRPLA. dentatorubral pallidoluysian atrophy. ERK. extracellular signal-regulated kinases. FeSOD. iron containing SOD. GPx. glutathion peroxidase. GSH. glutathion. HD. Huntington's disease. HSP. heat shock protein. IL6. interleukin 6. IVC. individually ventilated cage. MnSOD. manganese containing SOD. NiSOD. nickel containing SOD. PD. Parkinson’s disease. pERK. phospho-ERK. 1.

(4) polyQ. polyglutamine. SCA. spinocerebellar ataxia. SOD. superoxide dismutase. SMA. spinal muscular atrophy. TBP. TATA-box binding protein. TG. transgenic. WT. wild type. 2.

(5) 中文摘要脊髓小腦萎縮症第十七型(SCA17)是染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，是由於在 TATA box binding (TBP)蛋白基因上有 CAA/CAG 三核苷酸過度擴增，此擴增編碼結果產生多麩醯胺酸造成蛋白質不正常的堆積而引發小腦的退化，尤其以 Purkinje cell 之受損最嚴重。先前有許多研究指出在細胞模式或是動物模式，給予中草藥或是抗氧化的藥物，皆可有效的改善神經退化性疾病。我們以 SCA17 小鼠作為一個藥物篩選的模式，以 SCA17 基因轉殖小鼠小腦的初級培養及組織培養評估中草藥和抗氧化藥物對於 SCA17 的療效。在小腦初級培養中，使用抗體 IP3R1 免疫染色標定 Purkinje cell，計算神經突延展長度以評估藥物的功效。在切片組織培養中，藉由神經突的密度、Purkinje cell 的形態及 TBP 聚集程度作為評估的依據；再將具有潛力的藥物施於 SCA17 基因轉殖小鼠，進行活體的探討。藉由 rotarod，及小鼠自主運動(locomotor)之行為測試探討藥物的功用，以組織免疫染色分析病理層次及分子機制。由 SCA17 小鼠的小腦初級培養和切片組織培養之篩選，得知兩項中草藥萃取物及三個合成的抗氧化化合物可以增加神經突的延展。活體內的藥物測試發現，小鼠的體重和自主運動並沒有受到化合物的影響，而 rotarod 測試結果指出，藥物的給予有使其運動協調能力獲得改善。並且我們發現化合物的給予可以減緩 3.

(6) Purkinje cell 退化和不正常蛋白 TBP 的堆積，並且增加伴護蛋白和超氧化物歧化酶的表現，並降低發炎反應。這些化合物可能有潛力發展成為 SCA17 治療藥物。. 關鍵字: 脊髓小腦萎縮症、SCA17 基因轉殖小鼠、Purkinje cell、小腦初級培養. 4.

(7) 英文摘要 Spinocerebellar ataxia 17 (SCA17) is an autosomal dominant neurodegenerative disease caused by trinucleotide CAA/CAG repeat excessive expansion in TATA box Binding Protein (TBP) gene. Expanded CAA/CAG repeat encodes polyglutamine (polyQ) in TBP, which causes mutant polyQ proteins aggregate and the cerebellar Purkinje cell degeneration. Some effective treatments for neurodegenerative disease using Chinese herbs and anti-oxidants have been reported in cellular and animal studies. Our lab has generated SCA17 mouse model and used for potential therapeutic screening. We first used SCA17 transgenic mouse cerebellar primary to screen potential Chinese herbs and anti-oxidative compounds. Immunocytochemistry was conducted to stain Purkinje cell, and measured neurite outgrowth to evaluate the effect of treatment in cerebellar primary culture. The screening results showed two herbal extracts and three synthesized anti-oxidative compounds could increase neurite outgrowth on SCA17 cerebellar primary culture. In vivo treatment results showed that mouse body weight and spontaneous activity were unaffected under the treatment of anti-oxdative compounds. The motor coordination of mice on rotarod task was improved after treatment. We also found that heat shock proteins and superoxide dismutase were increased and Purkinje cell degeneration , mutant protein TBP aggregation and inflammation were attenuated after the treatment with these compounds. These anti-oxidative compounds have potential for SCA17 diseases treatment. 5.

(8) Key words: spinocerebellar ataxia, SCA17 transgenic mice, Purkinje cell, mouse cerebellar primary culture. 6.

(9) 壹、介紹一、脊髓小腦共濟失調症(Spinocerebellar ataxias) 脊髓小腦運動共濟症(Spinocerebellar ataxias，SCAs)，又稱為小腦萎縮症，與阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，AD)、亨丁頓氏舞蹈症 (Huntington's disease，HD)、帕金森氏症(Parkinson's disease，PD)，都是屬於神經退化性疾病。小腦萎縮症是一群體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病。根據不同的致病基因，又可分為 37 種不同的類型 (Matilla-Duenas, 2012, Serrano-Munuera et al., 2013)，其基因的變異包括，有過多的 CAA/CAG 序列重複、移碼突變(frameshift mutation)和誤義突變(missense mutation)等(Matilla-Duenas, 2012)。SCA 患者會產生異常的行為，例如：步態和肢體共濟失調和肌張力障礙，此外，有患者會有癡呆、癲癇和視覺障礙等症狀。Harding 將上述的臨床症狀進行分類，將體染色體顯性遺傳的小腦共濟失調症(autosomal dominant cerebellar ataxia，ADCA)，分為三大類型：第一型(ADCA I) 是包含了小腦的共濟失調和其它中樞神經系統的病變，包含 SCA 1SCA 4、SCA 8、SCA 12- SCA 23、SCA 25、SCA 27、SCA 28；第二型(ADCA II)在小腦共濟失調的症狀外，又多了視神經的退化，主要是在視網膜的位置，包含 SCA 7；第三型(ADCA III)是只有小腦共濟失調的症狀，包含 SCA 5、SCA 6、SCA 11、SCA26、SCA 29、SCA 30 7.

(10) 和 SCA 31 (Harding, 1982, Whaley et al., 2011)。. 二、多麩醯胺酸疾病(Polyglutamine disease) 在基因層次的檢測，發現有多型的小腦萎縮症在致病基因中， CAA/CAG 三核苷酸序列會過度重複的擴增，經由轉錄、轉譯後，會產生擴增的多麩醯胺酸(polyglutamine，poly Q)的蛋白質，故又稱為多麩醯胺酸疾病(Polyglutamine disease)。當過多的 glutamine 序列重複出現時，會影響蛋白質構型，降低溶解性而造成堆積現象，進而對於神經細胞產生毒性甚至死亡(Perez et al., 1998, McCampbell et al., 2000, Yamada et al., 2001)。除了多型的小腦萎縮症(SCA1-3, 6, 7, 8, 17) (Zoghbi and Orr, 2000, Matilla-Duenas, 2012)之外，還有很多神經退化性疾病都是屬於 polyQ disease，例如: HD、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症 (Dentatorubral pallidoluysian atrophy，DRPLA)和脊髓延髓肌肉萎縮症 (spinal and bulbar muscular atrophy，SBMA)。目前對於造成這些疾病的機制並沒有十分明確，但因為 glutamine 擴增造成蛋白質錯誤摺疊而形成聚集，會導致神經細胞的死亡(Schaffar et al., 2004, Nagai et al., 2007)，所以 polyglutamnie 過度擴增與這些疾病的產生有很大之相關性。此外，當 glutamine 重複越多，會使疾病發病的時間提早，此現象稱為 anticipation (Manto, 2005)，此現象更突顯了 polyglutamnie 擴 8.

(11) 增與疾病嚴重度之關係。. 三、第 17 型脊髓小腦共濟失調症(Spinocerebellar ataxias 17) 第 17 型脊髓小腦共濟失調症(Spinocerebellar ataxias 17, SCA 17) 在 1999 年被發現(Koide et al., 1999)。SCA 17 患者發病的時間平均是在 34.6 歲(Stevanin and Brice, 2008)，行動遲緩、共濟失調、肌張力障礙、認知障礙、老年癡呆和癲癇等，是其臨床上的一些症狀(Friedman et al., 2007)。SCA 17 是因為在 TBP (TATA-box binding protein，TBP)基因上，有不正常的 CAG 三核苷酸序列重複擴增而產生神經退化的現象 (Koide et al., 1999, Nakamura et al., 2001)。TBP 基因位於染色體 6q27 的位置(Koide et al., 1999)，TBP 基因是一個轉錄因子，且對於真核生物的三種核糖核酸聚合酶(RNA polymerase I, II, III)之轉錄作用均扮演重要的角色(Gill and Tjian, 1992)。正常人的 TBP 在 N 端有 25-42 次的 glutamine 重複，而病人有超過 46 次 glutamine 重複(Mariotti et al., 2007, Reid et al., 2003)。TBP 不正常擴增的 glutamine 會增強 TBP 與轉錄因子 TF II B 交互作用，造成熱休克蛋白(heat shock protein，HSP) 表現量下降，進而影響神經細胞的存活(Friedman et al., 2007)。. 此外，在SCA 17病患的病理分析上，可以很明顯地觀察到，病患的 9.

(12) 小腦有嚴重的萎縮，Purkinje cell的退化，並藉由免疫組織化學的分析，也可以在病患的腦中看到核內包涵體(intracellular inclusion)的產生 (Nakamura et al., 2001)，這些現象說明polyQ之聚集與Purkinje退化存有很大相關性。. 四、 Purkinje cell Purkinje cell 是一群專一存在於小腦中的細胞，主要負責訊號的傳入與傳出。將運動與感覺的訊息傳入，並將協調動作的訊號傳出(Apps and Garwicz, 2005)。在先前的研究中，將 SCA 病人的腦部進行病理分析，會發現 Purkinje cell 有退化、萎縮，甚至減少的現象 (Hadjivassiliou et al., 2003, Kasumu and Bezprozvanny, 2012)。Purkinje cell 屬於晚期發育的細胞種類，Purkinje cell 會在小鼠形成胚胎後，發育到 11-13 天(E11-13)才會開始生成，接著要到小鼠出生後，Purkinje cell 才開始發育，可分為三個階段，第一階段為出生後 1 至 9 天(P1-P9)， Purkinje 細胞本體會快速生長；第二階段是 P9-P18，此時 Purkinje 的樹突會快速生長，並增加其複雜性；最後階段是 P18-P90，此時 Purkinje 發育完成，其樹突與功能變得更加成熟(Miale and Sidman, 1961, Hendelman and Aggerwal, 1980, Armengol and Sotelo, 1991, McKay and Turner, 2005)。在我們的實驗中，以初級培養 Purkinje cell，並在過程加入藥物處理，藉由 Purkinje cell 的型態，評估判斷藥物處理是否具 10.

(13) 有療效。. 五、初級培養(Primary culture) 初級培養於神經科學方面的研究具有重要的貢獻。因為神經系統中，神經細胞所占細胞的數量非常的少，大多為一些非神經細胞所組成，例如：星狀膠質細胞(astrocyte)、寡突膠質細胞(oligodendrocyte)、小膠質細胞(microglia)、內皮細胞以及一些血管周圍細胞等。這些不同種類的細胞，可能會彼此產生交互作用，維持神經細胞的生長。而利用初級培養的方式，可以保留神經細胞與非神經細胞之間的交互作用，與活體內狀況較為類似，故藉由初級培養培育出的神經細胞相較於經過癌化的神經細胞株而言，更貼近活體狀態。因此以初級培養作為藥物篩選的平台，可以初步探討藥物對於細胞整體狀況是否產生影響。. Purkinje cell是一群細胞數量很少的細胞群，所以在經過長時間的培養後，要維持較高密度的Purkinje cell是一件困難的事情(Furuya et al., 1998, Tomomura et al., 2001, Heuer and Mason, 2003, Yoshimi et al., 2003, Tanaka et al., 2006)，所以在1980年代以後，就有以初級培養的方式，培育Purkinje cell的各種方法被報導(Fischer and Schachner, 1982, Gruol and Franklin, 1987)。Gimenez-Cassina在2006年提出以無血清的 11.

(14) 培養方式。可降低神經膠質細胞(glial cell)的增生，並在培養液中外加可以支持神經細胞生長的物質，如B27補充物和GlutaMax-I，可以有效的提高Purkinje cell培育的效率(Gimenez-Cassina et al., 2007)，所以我們即依循此培養方法，進行培育SCA 17小鼠小腦的Purkinje cell，做為一個藥物篩選的平台。. 六、氧化壓力氧化壓力產生的原因，基於體內自由基產生量，超過抗氧化系統的處理範圍，因自由基極具活性且不穩定，所以當有過多自由基存在時，會和體內的細胞組織產生氧化反應，導致組織細胞失去正常功能，包括訊息的傳送，能量的代謝等等，甚至會破壞 DNA，蛋白質，脂質，進而造成許多疾病，例如癌症、動脈粥樣硬化、慢性發炎等(Uttara et al., 2009)。此外，許多神經退化性疾病也與自由基的形成息息相關，例如 AD、PD 和 HD (Lin et al.,2006, Episcopo et al., 2013, Gonzalez-Lima et al., 2013, Kirbas et al., 2013)。. 體內常見的自由基包括 superoxide (O2.-)，一氧化氮(NO)和過氧化氫 (H2O2)，皆為活性氧物質(reactive oxygen species, ROS)。當細胞有氧呼吸產生 ATP 的同時，約有 2%的氧氣會轉變成 O2.- (Cadenas and Davies, 2000)。O2.-的功能包括調節血管功能，細胞分裂及防禦機制 12.

(15) (Khodr and Khalil, 2001, Lee et al., 2001, Uemura et al., 2001, Vazifeh et al., 2002)，但是過多的 O2.-會對細胞造成傷害。H2O2 是 O2.-經過超氧化歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)催化後的產物，需再受到 catalase (CAT)、glutathion (GSH)、glutathion peroxidase (GPx)等酵素催化，轉換為水，減緩氧化壓力所造成的傷害。. 七、超氧化歧化酶(Superoxide dismutase, SOD) 我們細胞中存在著能夠清除自由基的抗氧化酶，如SOD，是體內主要的抗氧化酶，作為第一道防線去對抗ROS。SOD首先會將活性較大的O2.-轉變為活性較小的過氧化氫，接著再由其他抗氧化酶作用轉化成水，方能抵擋自由基所造成的傷害。而SOD需要與金屬離子結合，作為電子的傳遞，才會具有功能對抗自由基所造成的傷害(McCord and Fridovich, 1969, Valko et al., 2007)。依照不同金屬離子作為其輔因子，可將SOD進行分類。第一種為鐵型超氧化歧化酶(Fe-SOD)，第二種是錳型超氧化歧化酶(Mn-SOD)，這兩種SOD又稱為cambialistic SOD，因為在某些細菌中，這兩種的SOD可互換金屬離子作為輔因子，仍具有酵素活性(Alscher et al., 2002, Eitinger, 2004)。第三種為銅型/ 鋅型超氧化歧化酶(Cu/Zn-SOD)，這類型的SOD在其活性位置同時包含兩種金屬離子，銅離子負責蛋白質活性，而鋅離子則維持蛋白質的 13.

(16) 結構以及電荷的穩定(Ge et al., 2003)。然而，直到1996年，Youn及其研究團隊在Streptomyces species 中，發現新型的SOD，鎳型超氧化歧化酶(Ni-SOD) (Youn et al., 1996)。Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的作用機制主要都是由二價金屬離子催化SOD，使該酵素具有活性，可將ROS分解。然而Ni-SOD則是經由Ni金屬離子產生協調單位 (coordination unit) : Ni+3/+2，並改變蛋白質N端殘基結構，獲得具有氧化還原的能力(Broering et al., 2013)。Fe-SOD存在於原核生物的細胞基質，和高等植物的葉綠體中 (Bower et al., 1994, Alscher et al., 2002 )， Mn-SOD主要存在真核生物的粒線體和過氧化物酶體 (Kira et al., 2002, del Rio et al., 2003)，而Cu/Zn-SOD主要存在於真核生物的細胞質、過氧化物酶體和葉綠體中(Alscher et al., 2002)，然而Ni-SOD屬於新型SOD，探討相關文獻較少，因此並沒有文獻指出Ni-SOD存在於細胞何處。本實驗主要探討給予結構類似NiSOD活性中心的合成化合物後，對於SCA17基因轉殖小鼠的行為及病理是否獲得改善。. 八、中草藥從古至今，中草藥常被用來治療疾病，其相對於一些化學合成的藥物來說，藥物毒性相對較低。有越來越多的中草藥被開發為一些保健食品用以改善生活的品質。在前人的研究中，發現具有抗氧化壓力功 14.

(17) 用的中草藥或是其萃取物可以有效的改善神經退化性疾病。在人類神經瘤母細胞SH-SY5Y經過莎草(Cyperus rotundus)萃取物之處理，可以調控與氧化壓力相關蛋白質的表現量，例如SOD，HSP70及Caspase-3，並可有效的減緩受到氧化壓力所誘導的細胞毒性，達到神經保護的效果(Kumar and Khanum, 2013)。另外，利用淫羊藿的萃取物，Icariin，不論是在細胞模式還是小鼠模式(Zeng et al., 2010)，均可以有效的治療’AD。此外也發現Icariin具有對抗氧化壓力的功用，可抑制受到過氧化氫所活化的JNK/p38 MAPK 訊息傳遞路徑，進而抑制細胞凋亡，達到保護的效用(Li et al., 2011)。在第三型脊髓小腦萎縮症(SCA3)的細胞模式中，給予梔子花以及其不同萃取物(genipin,geniposide,crocin) 處理後，皆可活化Nrf2訊息傳遞路徑，使其下游的抗氧化基因表現量上升，可有效的抑制aggregation形成，並且可以增加細胞neurite的total outgrowth (Chang et al., 2014)。而本實驗中，利用SCA17基因轉殖小鼠找尋具有治療潛力的中草藥。. 15.

(18) 貳、研究目的. 我們的研究主要是評估藥物對於 SCA17 是否具有療效，這些藥物包括了中草藥以及具有抗氧化功能的化學合成藥物。研究分別以體外培養(in vitro)以及活體(in vivo)進行探討。首先是小腦的初級培養，以藥物對 Purkinje cell 的神經突(neurite) 影響作為體外評估的依據。接著進行 in vivo 的測試，將藥物以腹腔注射的方式打入小鼠體內，再以小鼠的行為是否獲得改善來評估藥物是否具有療效，最後將小鼠犧牲，將小腦取出，切片、染色，進行病理分析。主要是以 Purkinje cell 的大小，排列整齊與否和不正常折疊的 TBP 所形成的 aggregation 嚴重程度來分析藥物的效用。另外也會將小腦的蛋白質萃取出來，以特定的蛋白抗體進行染色，觀察經過藥物處理後，這些特定蛋白的表現量改變，作為判斷之指標。最後，我們結合 in vitro 和 in vivo 的結果，評估藥物是否具有治療 SCA17 的潛力。. 16.

(19) 叁、研究材料與方法. 一、SCA17 基因轉殖小鼠(SCA17 transgenic mice) 我們實驗室先前已經建立 SCA17 TG 小鼠(SCA17 transgenic mice)，以小腦 Purkinje cell specific protein 2 (PCP2/L7)基因之啟動子，將帶有 109 個多麩醯胺重複擴增序列之人類 TBP 以顯微注射的方式，注入 FVB 小鼠受精卵原核並移植到母鼠輸卵管中孕育完成(Chang et al., 2011)。我們以 SCA17 的公鼠與 WT FVB 母鼠(FVB/NJNarl, NALC, Taipei, Taiwan)進行交配，繁衍小鼠。所有的小鼠皆以 Individually Ventilated Cages (IVC)系統進行飼育，日夜週期為 12/12 小時，飼料與水為無限供應。所有的動物行為實驗及藥物施予都通過國立台灣師範大學動物委員會審核通過而執行。. 二、基因型分析(Genotyping analysis) 剪取小段小鼠尾巴或小塊組織，以Direct PCR kit (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA)提供的實驗方法進行DNA的萃取。使用Direct PCR緩衝液和0.5 mg/ml蛋白質水解酵素K (Proteinase K) (Biovovas, Canada)在55℃作用5.5小時，接著溫度升高至85℃，作用45分鐘，以終止Proteinase K活性。將萃取之DNA儲存於-20℃，以便後續進行PCR 17.

(20) 基因型分析。. 以聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)分析小鼠基因型。以SRY正向引子(forward primer) (5’-AGA GAT CAG CAA GCA GCT GG-3’)和反向引子(backward primer) (5’-TCT TGC CTG TAT GTG ATG GC-3’)分析小鼠性別。PL-7 forward (5’-TAT GGT GAG AGC AGA GAT GG-3’) 和TBP3R backward (5’-CTG CTG GGA CGT TGA CTG CTG-3’)則用以分析SCA17小鼠的基因型。先以95℃反應1分鐘，破壞DNA雙股間氫鍵，使其變為單股DNA，接著再以65℃反應1分鐘，並隨著每個循環下降0.1℃，使引子可以與單股DNA進行辨認，且形成鍵結，最後再以72℃反應1分鐘，作聚合酶反應，由兩引子端點延長DNA。共進行25個循環。之後將PCR產物以2%洋菜膠體(Genetek Biosciences, Maharashtra, India)電泳進行分析，SRY的DNA片段為294 個鹼基對，SCA17小鼠基因型態的DNA片段為765個鹼基對。. 三、初級培養(Primary culture) 我們初級培養的實驗操作程序是根據先前報導的研究方法 (Gimenez-Cassina et al., 2007)進行操作。細胞培養液是以 NEUROBASAL® medium (GIBCO, Carlsbad, CA, USA)為主，加2% B-27 (GIBCO)、1 mM adenine (Sigma, St Louis, MO,USA)、2 mM 18.

(21) GlutaMax-I (GIBCO)、3 mM potassium chloride (Sigma)、5 μg/ml Gentamicin (GIBCO )、100 U/ml Penicillin和100μg/ml Streptomycin (GIBCO)。從出生後1天內的小鼠分離出小腦，剪成小碎片，置於含有0.05% trypsin/EDTA (GIBCO)和20 U/ml DNase (Sigma)之培養液中，每個eppendorf加入200 μl，於37°C反應15分鐘，以轉速100 g (1000 rpm, 75002411, Thermo, Langenselbold, Germany)離心5分鐘，去除上清液後，加入含有10%胎牛血清(fatal bovine serum, FBS, GIBCO)及20 U/ml DNaseI (Sigma)的培養液200 μl，以終止蛋白降解反應，並將細胞以 pipetman打散，經100 g離心5分鐘去除上清液後，以無血清之培養液 200 μl潤洗細胞，100 g離心5分鐘去除上清液後，以含有1% FBS的培養液500 μl將細胞打散，最後將細胞培養在以100 μg/ml poly-L-lysine (Sigma) 塗佈過的96孔細胞盤中，每一孔分別加入100 μl的培養液。. 四、細胞初級培養的藥物處理(Drug treatment) 初級培養經培養到第二天，將培養液置換成無血清之培養液。在體外培養的第 5 天，以不同濃度藥物處理細胞，藥物皆以二甲基亞碸 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO, Sigma)稀釋，藥物體積佔培養液的比例為 0.1%。在體外培養的第 10 天與第 15 天，將其中半量體積之培養液置換成新鮮之含藥物培養液。待細胞培養到第 18 天，以抗體染色並進 19.

(22) 行觀察與分析。. 五、細胞免疫染色(Immunocytochemistry) 將培養後的細胞，先以0.1M PBS潤洗過1次，再置換成4% paraformaldehyde (pH7.4)固定細胞30分鐘，接著以0.1M PBST [0.1M PBS (pH7.4), 0.1% Triton X-100]潤洗3次，並配置blocking緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 0.1% Triton-X-100, 10 % FBS]，於37°C反應2小時，以阻隔非專一的抗原決定位反應。初級抗體IP3R1 (1:1000, Santa Cruz)配置於緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 0.1% Triton-X-100, 5% FBS]，於4°C反應16-18小時。以0.1M PBST潤洗3次。螢光二級抗體(1:500, Invitrogen) 配置在緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 0.1% Triton-X-100, 5% FBS]，於 37°C反應2小時。4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:5000, Invitrogen)配置在0.1M PBST中，於室溫反應10分鐘，再以0.1M PBST 潤洗3次。最終以高通量顯微影像擷取暨分析系統(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)進行觀察分析，並用MetaXpress application software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)軟體分析數據。. 六、動物行為分析(Behavioral analysis) Rotarod 20.

(23) Rotarod 可用來測量小鼠的運動及協調能力，由於實驗動物為小腦共濟失調的小鼠，會產生運動協調失常的現象。小量預試驗測試是以 TG 小鼠進行，分為對照組和藥物處理組，每組 4 隻小鼠。而大量試驗則分為下列各組別:(1)WT 對照組、(2)WT 處理藥物組、(3)SCA17 對照組和(4)SCA17 處理藥物組，每個組別 15 隻小鼠。評估給予藥物後，小鼠的運動及協調能力是否有獲得改善。小量預試驗時，從小鼠 4 週開始測試，為期 1 個月，至小鼠八週大。大量試驗也是小鼠四週大開始進行，為期 2 個月，至 14 週。在測試的前 2 天，會有行為前適應處理(handling)，讓小鼠習慣手掌的觸覺，減緩小鼠的緊張程度。接著訓練(training)，小鼠靜置於 rotarod (47600 Rota-Rod, Ugo Basile, Italy)滾輪上 1 分鐘，再以 4 rpm 轉動 1 分鐘，並重複 3 次，訓練期間每次間隔 10 分鐘。訓練完後開始測試(testing)，可將 Rotarod 分為兩個階段，第一階段為在 300 秒內從 4 rpm 等加速度至 30 rpm，接著進入第二階段，定速 30 rpm 維持 300 秒，總共 600 秒。第一階段設置的等加速度是藉由速度的改變評估小鼠運動協調，而第二階段主要是探討小鼠的耐力，記錄小鼠掉下滾輪的時間或是小鼠跑完整個流程 (600 秒)。每隻小鼠每天測試 3 次，測試 2 天，共 6 次。每次測試間隔 15 分鐘，每測試完一輪，均以 30%酒精擦拭滾輪，消除小鼠個別的氣味，減少彼此干擾因素。 21.

(24) Locomotor 是一種測量小鼠自主運動能力的分析方式，我們主要針對 6 週大和 12 週大的小鼠進行測試。首先將小鼠放入一個開放性空間的黑色箱子(30 x 30 x 30 公分) 10 分鐘，並藉由影像追蹤系統(EthoVision® XT, Noldus, wageningen, the Netherland)分析小鼠的自主行為運動，時間區分為前 5 分鐘和後 5 分鐘，分析參數包括小鼠移動的水平距離、速度以及待在空間的中間位置和周圍位置的時間。小鼠移動的水平距離、速度主要是用來判斷小鼠的自主運動是否有受到藥物的影響而改變。此外，我們的基因轉殖小鼠在週齡 14 週以後，會有 hyperactivity 的現象出現，即其水平距離相較於野生型小鼠有顯著性的上升(Chang et al., 2011)。所以我們也可以觀察經過藥物處理後，其 hyperactivity 的情況是否可以獲得改善。另外文獻也指出，小鼠依照其習性，慣於待在空間的周圍。而當小鼠往空間中進行探索，表示其焦慮程度較低(El Idrissi et al., 2009)。而我們依小鼠待在空間的中間部分和周圍部分初步的判斷藥物是否有副作用，使得小鼠焦慮程度上升。. Footprint 小鼠會因為運動協調能力的失調，但是又必須維持行走的能力，進而產生紊亂的步伐。我們分析的參數包括小鼠的前，後腳的步寬，腳步 22.

(25) 整體的規律性，步長、跨步的時間以及速度。在之前的文獻提出，相較於正常小鼠，SCA 的小鼠其後腳的步寬會較 WT 小鼠更寬，腳步規律會降低，步長會較短，跨步時間則會較長，而跨步速度會較慢 (Cendelin et al., 2010)。我們想要探討給予藥物後，小鼠的步態是否可以看到改善，進而評估藥物的功用。先將小鼠放置小鼠步態分析儀 (CatWalk® XT, Noldus)的玻璃面板，並調整小鼠踏在玻璃面板上的強度，使軟體可以正確地抓取小鼠的腳步。接著讓小鼠自由的在玻璃面板上穿梭 3 次，藉由抓取小鼠的步伐，並以分析軟體(CatWalk® XT 9.1,Noldus)分析. Homecage 為了瞭解處理後的小鼠在籠子中的日常行為，故將小鼠個別住一個籠子，使其習慣後，以攝影機進行攝影，紀錄晚上 12 個小時小鼠的日常活動行為，由軟體(Clever Sys. Inc., USA)分析並進行統計，可得知小鼠不同行為進行的次數及時間，可比較不同組別的小鼠中，各種行為是否有程度上的差異。. 七、自由基測試利用化學冷光分析儀(Chemiluminescence analyzing system,CLD-110,Tohoku Electronic Industrial Co.,Sendai,Japan)和化學 23.

(26) 冷光加強劑 lucigenin (Sigma)，和 luminol (Sigma)進行動物體內自由基(超氧陰離子)的量測，主要針對超氧陰離子形成探討。其測試原理是利用血液中自由基所含有的電子，將其轉移到化學冷光加強劑，而使自由基由高階能轉變為低階能，釋放出能量可使化學冷光加強劑發光，被激發出的冷光可藉由光電倍增管接收，並轉換成電流，再由檢測器測量電流強度，並轉換成數值。因此我們可以藉由數值大小得知小鼠體內自由基的含量，進而了解其是否受到氧化壓力。. 八、免疫螢光染色(Immunoflourescence staining) 將小鼠犧牲後，以0.9%的食鹽水灌流，再以4%的paraformaldehyde (pH7.4)灌流固定，將腦取下，浸泡在4%的paraformaldehyde 4小時進行後固定。利用不同濃度的蔗糖水溶液，將腦脫水，依序是10%的蔗糖水溶液浸泡1小時，20%的蔗糖水溶液浸泡2小時，最後以30%的蔗糖水溶液浸泡16-18小時。將脫水的腦以冷凍切片機(CM3050S, LEICA, Wetzlar, Germany)進行30 μm矢狀切片。將已切好的腦片，浸泡於blocking緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 2% Triton-X-100, 10% FBS] ，置於37°C反應2小時。初級抗體(表一)配置於緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 2% Triton-X-100, 5% FBS]，與腦片於4°C反應16-18小時。以PBST [0.1M PBS (pH7.4), 2% Triton-X-100]潤洗3次。螢光二級抗體(表二)配 24.

(27) 置在緩衝液[0.1M PBS (pH7.4), 2% Triton-X-100, 5% FBS]，於37°C反應2小時。DAPI (Sigma配置在PBST中，室溫反應10分鐘，再以PBST 潤洗3次。將已經處理好的腦片，以mounting medium (Southern Biotech, Los Angeles, USA)貼到玻片上，再用蓋玻片覆蓋於腦片上，最後以雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡(TCS SP2, Leica, Wetzlar, Germany)進行拍照觀察與分析。. 九、西方墨點轉漬法(Western blot) 將小鼠犧牲後，取出小腦並秤重，加入小腦重量五倍體積的 RIPA 溶液[5 mM EDTA, 10mM Tris (pH 7.4), 150 mMNaCl, 0.1 % SDS, 1% DOS,1% NP40]，含有蛋白質水解酶抑制劑(proteinase inhibitor, Thermo, Waltham, USA)和磷酸水解酶抑制劑(phosphatase inhibitor, Sigma)。加入氧化鋯磁珠，震盪機(Next Advance, NY, USA)以速度 3 震盪 3 分鐘將腦打碎均質，接著置於冰上 30 分鐘後，以 14000 g 離心 30 分鐘，取上清液蛋白並將其稀釋 20 倍，以蛋白質分析組(BCA protein assay kit , Pierce, USA)進行蛋白質濃度定量。取 50 μg 的蛋白質進行 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)，浸泡於 running buffer [192 mM Glycine (Sigma), 25 mM Tris Base (Bionovas, Ontario, Canada)溶於水 25.

(28) 中]，接著浸泡於 transfer buffer [192 mM Glycine (Sigma), 25 mM Tris Base (Bionovas), 20% v/v methanol (GeneStar, Shanghai, China)溶於水中]。轉移至 PVDF (polyvinylidene fluoride)膜，並將 PVDF 膜浸泡於 5%的脫脂牛奶進行 blocking，阻隔非專一的抗原決定位反應。初級抗體(表一)配置於 PBST 緩衝液(0.05% tween-20)，於 4°C 反應 16-18 小時，接著以 PBST 潤洗 5 次，二級抗體(表二)於室溫反應 1 小時，接著加入冷光呈色劑，於化學冷光偵測系統 LAS-4000 (Fujifilm; Tokyo, Japan)進行偵測。. 十、酵素連結免疫吸附法(ELISA) 血液由臉頰採血取得後，靜置於室溫 2 小時，接著於 4°C，2000xg 離心 20 分鐘，抽取上清液血清部分，儲存於-80°C。藉由 Glutathione assay kit (Cayman Chemical; MI, USA), IL-6 ELISA kit (R&D Systems; MN, USA) 來偵測 GSH 和 Il6。依照 kit 所提供的實驗方法進行測試。. 十一、統計分析(Statistical analysis) 細胞初級培養皆以Metaxpress (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)軟體之Neurite Outgrowth參數進行分析。統計方法以獨立樣本T 26.

(29) 檢定去評估每個組別間，是否有顯著的差異。行為參數的分析，皆以單因子變異數分析，去評估藥物給予組別和對照組。以Mean±S.E.M 表示，以p質小於0.05作為統計上顯著差異。. 27.

(30) 肆、結果. 一、利用初級培養篩選天然物萃取物與 WCSOD 系列藥物我們實驗室已經建立了小腦細胞初級培養的基本流程(圖 1A)，將出生一天(P1)的小鼠小腦分離出來進行體外培養，藥物於第 5 天(DIV5) 開始加入，在第 18 天(DIV18)進行細胞免疫染色分析，此時 TG 小鼠其 Purkinje cell 的 neurite outgrowth 長度，process 的數量及 branch 的數量均較 WT 小鼠顯著降低，因此我們固定於體外培養 18 天後以細胞免疫染色進行觀察以評估藥物處理之效果，Purkinje cell 以 IP3R1 抗體進行染色，可以得知 neurite 生長型態。Neurite outgrowth 可用以評估藥物處理是否可以減緩 Purkinje cell 退化的現象，以此作為一個藥物篩選之初步評估。. 本實驗中，主要是對 WCSOD 系列藥物及工研院提供的天然物甲醇萃取物(表三)進行篩選。。我們在 11 種天然物萃取物的篩選中，發現 NTNU312 和 NTNU319 可以顯著的提高 neurite outgrowth 長度(圖 1B)，從免疫螢光染色圖可明顯地看到 neurite 的長度受到此萃取物處理後，相較於對照組有顯著的提升(圖 1C)。WCSOD 系列藥物是師大化學系李位仁教授合成結構類似鎳超氧化物歧化酶(NiSOD)活性中心的化合物，可能可以作為抗氧化劑或是自由基清除劑。我們的結果 28.

(31) 顯示 WCSOD 系列藥物處理亦可提高 Purkinje neurite outgrowth 之長度(圖 1D)，因此我們初步之篩選認為天然物萃取物 NTNU312 和 NTNU319 及 WCSOD 系列藥物可能有助於減緩小腦初級培養細胞中 Purkinje cell 退化的現象。. 二、WCSOD 系列藥物活體效應之小量預試驗為了要了解 WCSOD 系列藥物在活體內之療效，我們先以短期(四週)對少量(n = 3-4)小鼠進行預試驗，於小鼠四週大開始，每天以腹腔注射的方式，將 WCSOD 系列藥物(2 mg/kg)打入小鼠體內。藥物施打的期間每週進行體重的測量，結果顯示，小鼠的體重仍穩定上升(圖 2A)，四組間並無差異。由此初步判定，給予 WCSOD 的藥物劑量對於小鼠並沒有造成太大之負面影響。行為測試方面，在小鼠四週大還沒有給與藥物之前，先進行一次 rotarod 測試，實驗組和對照組的小鼠在此時並沒有任何表現上之差異。接著我們每隔兩週進行 rotarod 測試，在小鼠八週大時，可以看到給予藥物組別的小鼠在滾輪上跑動的時間，顯著的高於對照組(圖 2B)。由此結果我們初步判斷藥物具有改善小鼠協調功能之潛力。我們將經過 WCSOD 系列藥物處理四週的小鼠犧牲，取其小腦切片進行染色作病理相關分析。以 IP3R1 和 Calbindin 抗體作 Purkinje 細 29.

(32) 胞的免疫染色，以 1TBP18 抗體偵測 TBP 蛋白不正常摺疊所造成的聚集(aggregation)，以 GFAP 的表現量判斷 gliosis 的程度。我們發現經過藥物處理後，Purkinje 細胞本體排列較整齊，且 neurite 退化的情況有減緩，而 TBP aggregation 的量有下降的趨勢(圖 2C)，我們推測藥物可能具有抑制不正常蛋白質堆積的功用，但並沒有看到小鼠因為藥物處理，獲得 gliosis 方面之改善(圖 2D)。. 三、WCSOD 系列藥物之活體效應我們在預試驗中發現 WCSOD 系列藥物的給予可以改善 SCA17 基因轉殖小鼠之協調性。因此進行較大數量的動物實驗(n=15)，並與 WT 小鼠進行比較。我們依舊由小鼠四週大開始進行藥物之腹腔注射，將 WCSOD 系列藥物(2 mg/kg)打入小鼠體內，每週進行小鼠體重的測量，各項行為之評估如圖 3A 所示。在此期間，小鼠體重穩定上升(圖 3B)。在小鼠自主運動(locomotor activity)能力測試中，我們分析了小鼠移動的水平距離和停留在開放性空間靠近中間位置的時間。TG 小鼠水平距離的移動顯著的高於 WT 小鼠(圖 3C)，顯示 TG 小鼠呈現 hyperactivity 的現象(Chang et al., 2011)。分析小鼠待在開放性空間靠近中間位置的時間，可以初步判定小鼠是否有焦慮的現象(El et al.,2009)。我們發現 TG 小鼠待在中間位置的時間顯著的多於 WT 小 30.

(33) 鼠，顯示 TG 小鼠呈現焦慮行為，而在 WCSOD 藥物處理後，獲得改善，特別是 WCSOD-006 的給予，有顯著的減緩效果(圖 3D)。Footprint 測試中，我們發現在 WT 小鼠和 TG 小暑其腳步規律性並沒有差異，而藥物的給予也沒有造成影響(圖 3E)。在小鼠後腳步寬分析中，看到 TG 小鼠明顯寬於 WT 小鼠，然而此現象並沒有因為藥物的給予而造成影響(圖 3F)。rotarod 測試結果顯示在小鼠 12 週時，WCSOD-006 和-021 的給予皆可有效改善 TG 小鼠運動協調能力，而在 14 週時，處理 WCSOD-021 可以輕微改善小鼠協調能力(圖 3G)。. 四、WCSOD 系列藥物對於 SCA17 小鼠周邊系統的影響在小鼠犧牲之前採集血液，進行血液中 ROS，IL6 及 GSH 的定量分析。以化學冷光分析儀偵測小鼠血液中 O2-和 OH˙，結果顯示 WT 和 TG 小鼠體內的 ROS 並沒有差異(圖 4 A&B)，因此沒有進一步再分析藥物對 ROS 之影響。另外，以 ELISA 分析顯示，發炎因子 IL6 在 TG 小鼠中，有上升的情況，而在藥物處理後，皆有獲得改善(圖 4 C)，但因個體差異較大，標準差數值過高，均無統計上之顯著性。而 GSH 則沒有受到藥物處理而產生顯著影響，只有 WCSOD-006 和-021 之處理有稍微上升之趨勢(圖 4D)。. 31.

(34) 五、探討 SCA17 TG 小鼠經過 WCSOD 系列藥物處理後，神經病理及各種分子表現程度的變化. 經過 WCSOD 藥物處理後，TG 小鼠的小腦相較於對照組，其萎縮的情況有些許的改善，特別是 WCSOD-021 的給予(圖 5A)。小腦中 Calbindin 的表現量於 TG 小腦中有顯著的下降，而在經過藥物處理後，並沒有上升(圖 5B)。先前的研究已指出磷酸化 ERK (pERK)會表現在小鼠的 Bergmann glia (Zsarnovszky and Belcher, 2004)。本實驗之結果顯示，觀察到 pERK 表現在小鼠的 Bergmann glia (以 s100β 標示)，在三種藥物分別處理後，其表現位置沒有因為藥物處理而產生改變(圖 5C)。在 western 定量結果中顯示，TG 小鼠其 pERK 表現量顯著的高於 WT 小鼠，分別處理三種藥物後，其表現量皆有下降的趨勢(圖 5D)。在 Bergmann glia 的部份，看到 TG 小鼠表現量顯著低於 WT 小鼠，三種藥物分別給予之後，其表現量皆顯著提升(圖 5E)。我們利用免疫組織化學染色標定 GFAP 訊號作為 gliosis 程度之測定，TG 小鼠確實有 gliosis 的現象，而在處理 WCSOD-021 後，gliosis 有減緩的現象(圖 5F)。GFAP 的表現量於 TG 小鼠中有顯著的上升，在三種藥物分別處理後，GFAP 表現量有輕微下降的趨勢，WCSOD-021 處理組別更為明顯(圖 5G)。分析 TBP 蛋白質堆積之 aggregation (N12)，在經過 WCSOD-006 和 021 處理後，有輕微下降的趨勢(圖 5H)。腦源性神經 32.

(35) 滋養因子( brain derived neurotrophic factor，BDNF)具有保護神經的功能，在之前的研究指出，在神經退化性疾病 HD 中，BDNF 的表現量會顯著的下降，而若使 BDNF 大量表現，則可改善 HD 的病徵(Zuccato and Cattaneo, 2009)。免疫染色結果發現 TG 小鼠其 BDNF 表現量相較於 WT 小鼠有較為降低，而藥物的處理並沒有造成 BDNF 的改變(圖 5I)。使用 Iba1 標定 microglia，TG 小鼠 microglia 顯著高於 WT 小鼠，而藥物的給予並沒有對 microglia 之程度產生影響(圖 5J)。. 六、WCSOD 系列藥物對於 SCA17 小鼠分子機制的影響我們利用西方墨點轉漬法分析經 WCSOD 系列藥物處理過小鼠的小腦其分子表現之強度，以便了解其中之分子機制(圖 6A)。pP38 的活化與免疫反應的產生相關，並且可作為發炎因子的指標(Johnson and Lapadat, 2002)。定量結果顯示 pP38 的表現量於 TG 小腦中有顯著的上升，而在經過藥物分別處理後，皆有顯著的下降 (圖 6B)。pJNK 與基因的轉錄相關(Johnson and Lapadat, 2002)，其表現量在 WT 小鼠和 TG 小鼠並沒有顯著差異，經過藥物處理後，對照組和藥物處理組別間亦沒有差異，沒有受到藥物的影響(圖 6C)。HSP 具有多種細胞生理功能，包括可以抑制不正常蛋白質的堆積，或是可以將變性的蛋白重新折疊，使其恢復正常功能，也可以幫助蛋白質的移動(Bukau et al., 2006, Hartl et al., 2011)。其中 HSP40 和 110 在神經退化疾病中扮 33.

(36) 演重要的角色。在 HD 的果蠅模式中，大量表現 HSP40 或 110，可以減緩細胞死亡使得 HD 的病徵獲得改善 (kuo et al., 2013)。而 HSP90 可保護神經細胞，減少神經細胞死亡(Lee et al., 2001)。我們觀察到 TG 小鼠其 HSP40，HSP90 和 110 表現量顯著的低於 WT 小鼠，經過三種 WCSOD 個別處理後，HSP40 的表現量均有顯著提升。HSP90 則是在 WCSOD-006 和 021 處理過後，表現量顯著提高。而 HSP110 只有在經過 WCSOD-003 和-006 處理後，顯著提升，而-021 之處理則只有上升趨勢。(圖 6D-F)。SOD 主要作為抗氧化壓力的蛋白質，我們分別探討 Mn-SOD 和 Cu/Zn-SOD 於小腦內之表現量。我們看到 TG 小鼠 Mn-SOD 表現量相較於 WT 小鼠有顯著的下降，而在給予 WCSOD-006 和 021 處理後，Mn-SOD 表現量顯著上升(圖 6G)。而 Cu/Zn-SOD 在 TG 小鼠表現量也是顯著低於 WT 小鼠，再處理 WCSOD-003 和 006 之後，皆有顯著回升。Catalase 為 SOD 下游基因，可將過氧化氫分解成水和氧氣，減緩氧化壓力所造成的傷害。我們探討 catalase 於小腦內之表現，定量結果發現 WT 和 TG 小鼠間沒有顯著差異，其表現量也沒有受到藥物之影響。我們將實驗結果統整如表四，可以更清楚明瞭的探討三種WCSOD 合成藥物對於SCA17之影響。. 34.

(37) 伍、討論我們利用 SCA17 小鼠小腦初級培養篩選天然物萃取物以及抗氧化藥物，從篩選的結果中，我們發現抗氧化藥物及少數天然物萃取物可以增加 Purkinje neurite outgrowth 長度，延緩神經細胞退化。而 Purkinje 的數量可作為藥物毒性的評估，發現我們所使用的藥物濃度對於 Purkinje 神經元沒有造成毒性，因此往後可以提高藥物濃度，針對沒有看到療效的藥物再進行篩選，故可排除是否因為藥物濃度不夠而沒有看到差異。. 在實驗室先前建立的 SCA17 小鼠小腦組織切片培養，可用於觀察藥物是否具有抑制不正常折疊而造成堆積的 TBP 蛋白，作為藥物篩選平台。在小腦切片培養中，我們發現經過 WCSOD 系列抗氧化藥物處理，可以有效的抑制 TBP 聚集(陶, 2013)。經由初級細胞培養及組織切片培養，預期 WCSOD 抗氧化化合物對於治療 SCA17 具有潛力，因此我們以 WCSOD 系列藥物進入 SCA17 基因轉殖小鼠進行活體試驗。. WCSOD 系列藥物主要是以結構類似 Ni-SOD 活性中心所合成的化合物，可能具有抗氧化酶的功效，可以減緩因為氧化壓力所造成的細胞毒性(Episcopo et al., 2013, Gonzalez-Lima et al.,2013, Kirbas et al., 35.

(38) 2013)，達到改善病情的效果。. 小量動物預試驗中，我們看到 WCSOD 三種抗氧化藥物分別給予，在小鼠八週大時可以顯著提升小鼠在滾輪上跑動的時間，而從免疫螢光染色結果看到藥物的給予，皆可有效降低 TBP 聚集，雖然 gliosis 的現象沒有受到藥物影響，但運動協調能力獲得明顯的改善，所以我們仍以 WCSOD 系列藥物進行大量動物試驗。先以 rotarod 進行協調運動功能的評估，結果顯示小鼠 12 週之前，藥物處理組別與對照組沒有差異，分別到了 12 週和 14 週，給予 WCSOD-006 和-021 才有顯著提升小鼠在滾輪上跑動時間。這樣的結果與小量預試驗不符合，我們推測可能是因為個體差異而造成。經過大量動物試驗則可避免因個體差異而影響實驗結果，故大量動物試驗可增加實驗準確性。另外在 footprint 分析中，並沒有因為 WCSOD 系列藥物的給予而獲得改善，前人的研究指出，步態不穩的小鼠，腳步規律性較低、後腳間距較寬、步長較短，跨步時間則會較長等現象(Cendelin et al., 2010)，然而在我們的結果中，WT 小鼠和 TG 小鼠的腳步規律性、步長和跨步時間並沒有差異，後腳步寬則是在 TG 小鼠有較寬的現象，但並沒有因為藥物的給予而獲得改善。儘管 rotarod 和 footprint 皆可用來進行運動行為能力的測試，但 footprint 相較於 rotarod 而言，是觀察更細微的測試，要病徵非常明顯才能看出差異，而我們 WT 和 TG 小鼠，在許多 36.

(39) 參數分析皆無差異，我們認為應該是小鼠年紀還不夠大，所以在步態上看不出有明顯的差異。在 locomotor 分析中，hyperactivity 的現象並沒有因為處理藥物而改變。然而有趣的是，我們藉由小鼠待在空間中心區域的時間，初步判定小鼠是否具有焦慮性，看到 SCA17 TG 小鼠待在中心區域時間顯著低於 WT 小鼠，以此認為 TG 小鼠可能具有焦慮狀態。而在臨床研究中，並沒有文獻指出 SCA17 病患有焦慮的產生，因此，我們可以藉由高空十字迷宮(elevated plus maze，EPM) (Lim et al., 2012)，作更進一步的探討 SCA17 小鼠是否有焦慮現象。在神經病理分析方面，可以看到 WCSOD-006 和-021 處理可以減緩 TBP 堆積，此結果與小量預試驗結果相符。TG 小鼠的神經膠細胞有大量表現(gliosis)的情形，而在 WCSOD 系列藥物，特別是 021 處理下，神經膠細胞的表現有顯著的下降，推測 WCSOD 系列藥物可能可以減緩神經退化的程度。然而，microglia 在 TG 小鼠小腦中大量表現，經過 WCSOD 處理，對於 microglia 則沒有太大的影響。前人文獻指出，microglia 大量活化會導致神經細胞的死亡(Marin-Teva et al., 2011)，相反的，也有人認為 microglia 活化可作為神經滋養因子(Elkabew et al., 1996)保護神經細胞，因此在本實驗中看到 TG 小鼠 microglia 表現高於 WT 小鼠的情形，我們推測有可能是 microglia 為了保護神經細胞的反饋機制。 37.

(40) pERK 作用機制在 SCA 中尚不明確，有研究指出，pERK 可以促進細胞存活(McCubrey et al., 2006, Wei et al., 2006)，也有人提出 ERK 會導致神經細胞退化，使細胞凋亡，在 Bhat 和 Zhang 的研究中發現，由 H2O2 誘導 oligodendrocyte 死亡，看到 ERK 大量表現(Bhat and Zhang, 1999)，以及在初級培養神經細胞中，藉由穀氨酸(glutamate) 產生興奮性毒殺，可以觀察到 ERK 的活化，並造成神經細胞的損傷 (Stanciu et al., 2000)。在本次實驗中，西方墨點轉漬法可觀察到 pERK 在 SCA17 TG 小鼠表現量有顯著的上升，而在 WCSOD 藥物給予後有下降的趨勢，我們認為藥物對於神經具有保護功能，但這部分需在往後進行探討。. HSP 可以抑制不正常蛋白質的堆積，或是可以將變性的蛋白重新折疊，使其恢復正常功能，也可以幫助蛋白質的移動(Bukau et al., 2006, Hartl et al., 2011)。在本實驗中，發現 TG 小鼠其 HSP40 和 110 皆比 WT 小鼠顯著的下降，推測其 HSP 功能可能失活，而經 WCSOD 藥物處理後，HSP40 和 110 皆有顯著的回復，其功能可能獲得改善，而增加其抑制不正常蛋白質的堆積的效果，故而在病理分析上觀察到 aggregation 皆有下降的趨勢(圖 2C，5C)。然而，HSP 家族還包括 HSP27, HSP70 及 HSP90，之前的文獻指出，HSP27 在 SCA 中，其表現量會 38.

(41) 顯著性的下降(Wen et al., 2003, Chang et al., 2005, Tsai et al., 2005)，而在發病晚期，或是病患死後的腦中發現，HSP27 表現量會提升(Chang et al., 2005)。在 Yang 及其研究團隊所建立的 knock in SCA17 小鼠模式中發現，HSP70 和 HSP90 在較老的 SCA17 小鼠中，表現量顯著下降。因此我們可以探討 WCSOD 藥物對於其他 HSP 是否會造成影響，進而去探討其分子機制的變化。. 發炎反應於神經退化性疾病中也是主要的病徵之一(Ferrari and Tarelli, 2011, Rubio-Perez and Morillas-Ruiz, 2012)，我們於是利用 ELISA 測試小鼠周圍系統中，細胞激素 IL6 的表現，因其可作為發炎因子的指標(Gabay, 2006)。TG 小鼠 IL6 表現有輕微高於 WT 小鼠的趨勢，但沒有顯著差異。但是在小鼠小腦中，TG 小鼠 pP38 表現量顯著的高於 WT 小鼠，pP38 亦可作為發炎因子指標(Johnson and Lapadat, 2002)，因此我們推測，只在 SCA17 TG 小鼠小腦內產生發炎反應，但在周邊系統中並不明顯，可能是因為 TG 小鼠的病徵不夠嚴重，因此只在小腦內有發炎反應的產生。. 我們藉由化學冷光分析儀分析小鼠血液中 ROS 含量，發現 WT 與 TG 小鼠並沒有差異。ELISA 分析 GSH 也發現 WT 與 TG 小鼠差異不大，我們推測可能是因為 SCA17 TG 小鼠其年紀還不夠年老，因 39.

(42) 此在我們的模式小鼠中，並沒有看到氧化壓力的提升。然而有趣的是，從 TG 小鼠萃取的小腦蛋白質中分析 Mn-SOD 和 Cu/Zn-SOD 的表現量，可以看到 Mn-SOD 和 Cu/Zn-SOD 的表現量顯著地低於 WT 小鼠，而分別給予 WCSOD-006 和 021，有助於 Mn-SOD 的回升。而處理了 WCSOD-003 和 006 之後，Cu/Zn-SOD 的表現量有顯著的提高。然而，我們也探討 SOD 下游基因，catalase，發現其表現量並沒有因為給予了 WCSOD 藥物之後，有顯著提升的現象。因此我們推測可能是因為 TG 小鼠受到 glutamine 不正常擴增，使其造成 aggregation 的現象，導致 SOD 無法正常表現，但在給予類似 SOD 系列藥物之後，改善了 aggregation 的情況，進而促使 SOD 正常表現，因此表現量提升。總結本實驗之結果，不論是在行為分析，或是分子層次的探討，皆有改善病情的現象，因此我們推測 WCSOD 系列藥物除了具有抗氧化功能之外，可能還有其他效果可以改善病況，例如增加熱休克蛋白的表現，或是作用於 pERK 這條訊息傳遞路徑，使其下游基因產生改變。因此我們認為 WCSOD 系列藥物對於治療 SCA17 是具有潛力的。. 40.

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(51) 柒、圖表. 表一本論文中所使用之初級抗體分子量. 初級抗體. 來源. 製造廠商. 使用比例. 目的. Calbindin. goat. SantaCruz. 1:500. IF/western. 28. IP3R1. goat. SantaCruz. 1:1000. ICC. 313. 1TBP18. mouse. QED. 1:30000. IF. GFAP. mouse. Millipore. 1:1000. IF/western/IHC 51. S100β. mouse. Millipore. 1:1000. IF/western. 10. Iba1. rabbit. Wako. 1:1000. IHC. 17. BDNF. rabbit. Millipore. 1:1000. IF. 17. HSP40. rabbit. Abcam. 1:5000. western. 40. HSP90. mouse. SantaCruz. 1:1000. western. 90. HSP110. mouse. Abcam. 1:1000. western. 110. Mn-SOD. mouse. Millipore. 1:1000. western. 24. Cu/Zn-SOD. rabbit. SantaCruz. 1:1000. western. 23. Catalase. rabbit. Abcam. 1:2500. western. 60. β-actin. mouse. Millipore. 1:1000. western. 42. p-ERK rabbit (Thr202/Tyr204). Cell signaling. 1:1000. IF/western. 42/44. ERK 1/2. rabbit. Cell signaling. 1:1000. western. 42/44. pP38. rabbit. Cell signaling. 1:1000. western. 43. P38. rabbit. Cell signaling. 1:1000. western. 43. p-JNK rabbit (Thr183/Tyr185). Cell signaling. 1:1000. western. 46/54. JNK 1/2. Cell signaling. 1:1000. western. 46/54. rabbit. 49. (kDa).

(52) 表二本論文中所使用之次級抗體次級抗體. 來源. 製造廠商. 使用比例. anti-goat IgG, Alexa Flour 488. donkey. Invitrogen. 1:500. anti-goat IgG, Alexa Flour 647. donkey. Invitrogen. 1:500. anti-mouse IgG, Alexa Flour 555. donkey. Invitrogen. 1:500. anti-rabbit IgG, Alexa Flour 555. donkey. Invitrogen. 1:500. anti-rabbit IgG, Alexa Flour 647. donkey. Invitrogen. 1:500. Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG. goat. Vector. 1:200. Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG. goat. Vector. 1:200. anti-goat IgG, HRP-linked. goat. SantaCruz. 1:5000. anti-mouse IgG, HRP-linked. goat. GE healthcare. 1:10000. anti-rabbit IgG, HRP-linked. goat. GE healthcare. 1:10000. 50.

(53) 表三本論文中所篩選的藥物系列. 藥名. WCt. WCSOD 003. WCSOD 006. WCSOD 021. NTNU. NTNU224. NTNU293. NTNU301. NTNU312. NTNU313. NTNU319. NTNU328. 神經突延展長度. 1 nM. -. -. 10 nM. -. -. 100 nM. -. -. 1 nM. -. -. 10 nM. -. -. 100 nM. -. -. 1 nM. -. -. 10 nM. -. -. 100 nM. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. +. P = 0.042. -. 1 μg/ml. +. P = 0.047. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. +. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 51. P 值. 藥物毒性*. 使用濃度. P = 0.01. -.

(54) NTNU331. NTNU379. NTNU385. NTNU395. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. 0.1 μg/ml. -. -. 1 μg/ml. -. -. 10 μg/ml. -. -. * : 依 Purkinje cell 型態作判斷 - : 與對照組沒有差異. 52.

(55) 表四總結本實驗藥物處理對於小鼠行為及病理之影響 TG vs. WT. WCSOD-003. WCSOD-006. WCSOD-021. 體重. -. -. -. -. Rotarod. ↓***. ↑**. ↑**. ↑**. IF. Aggregation. ↑***. ↓**. ↓***. ↓***. ↑***. -. -. -. 大量動物試驗. GFAP 體重. -. -. -. -. Locomotor-distance. ↑***. -. -. -. Locomotor-stay at central zone. ↓***. ↑. ↑*. ↑. Footprint-step sequence regularity. -. -. -. -. Footprint-BOS hind paw. ↑*. -. -. -. 小量動物預試驗. IF. IHC Western. Rotarod 小腦萎縮程度. ↓. ↑. ↑*. ↑*. ↑***. ↓. ↓. ↓. Aggregation. ↑***. ↓. ↓*. ↓*. BDNF. ↓***. -. -. -. GFAP. ↑***. ↓. ↓. ↓*. Iba1. ↑***. -. -. -. Calbindin. ↓***. -. ↑. -. Mn-SOD. ↓*. ↑. ↑**. ↑**. Cu/Zn-SOD. ↓*. ↑*. ↑*. ↑. pP38. ↑***. ↓***. ↓***. ↓***. GFAP. ↑***. -. -. ↓. pERK. ↑*. ↓. ↓. ↓. S100β. ↓*. ↑**. ↑*. ↑*. HSP40. ↓*. ↑*. ↑***. ↑**. HSP90. ↓*. ↑. ↑**. ↑*. HSP110. ↓*. ↑*. ↑**. ↑. TG vs WT:以 WT 作標準 - : 與 TG 對照組沒有差異 ↓ : 與 TG 對照組有下降趨勢 ↑ : 與 TG 對照組有上升趨勢 *:依 TG 對照組顯著差異 * ， p < 0.05； **， p < 0.01； ***， p < 0.001 53.

(56) 54.

(57) 圖 1. 以 SCA17 小鼠小腦初級培養篩選藥物之結果 (A)利用 SCA17 小鼠小腦初級培養篩藥之時間軸。(B)由 neurite outgrowth 長度評估天然物萃取物對 SCA17 小鼠小腦初級培養之影響， vehicle 組別為 SCA17 小鼠之 Purkinje cell neurite outgrowth 長度。(C) NTNU312 (1 μg/ml)及 NTNU319 (10 μg/ml)之處理可減緩 SCA17 小鼠 Purkinje cell 退化，增加 neurite outgrowth 長度。(D) WCSOD 系列抗氧化藥物之處理，可增加 Purkinje neurite outgrowth 之長度。(比例尺 = 100 μm， independent t test； *， p < 0.05； **， p < 0.01； ***， p < 0.001， n = 4). 55.

(58) 56.

(59) 圖 2. 利用 SCA17 小鼠進行 WCSOD (2 mg/kg) 系列藥物之小量預試驗 (A)藥物處理組與對照組小鼠的體重並無差異。(B) rotarod 測試結果，了解藥物處理組的小鼠八週大時在滾輪上停留的時間均較無藥物處理組有顯著的增加。(C)經過藥物處理後，Purkinje cell 的細胞本體排列較為整齊且 neurite 退化的情況有減緩現象，錯誤摺疊蛋白所形成的 aggregation (1TBP18)與對照組相比較，定量結果亦有顯著的下降。 (D)小鼠小腦中 gliosis (以 GFAP 表示)的現象並沒有因為藥物處理而獲得明顯的改善。(比例尺 = 75 μm (C)，150 μm (D)， independent t test； * ， p < 0.05； **， p < 0.01； ***， p < 0.001， n = 4). 57.

(60) 58.

(61) 圖 3. 藉由 SCA17 TG 小鼠運動行為評估 WCSOD 藥物之效用 (A)本實驗中執行動物行為測試的時間表。(B) WT 和 TG 小鼠的體重並沒有受到藥物的處理而改變。(C&D)小鼠自主運動能力分析之結果。 TG 小鼠移動的距離顯著的高於 WT 小鼠，但這種 hyperactivity 的情形並沒有因為藥物的給予而獲得改善。TG 小鼠停留在開放空間的中間區域時間顯著的下降，故推測基因轉殖小鼠有焦慮的情況產生，而在給予藥物後，皆有獲得改善，特別是處理 WCSOD-006 的小鼠，相較於對照組有顯著的回復。(E&F) Footprint 分析之結果。小鼠腳步的規律性在 WT 和 TG 小鼠間無差異，藥物的給予並沒有造成影響。TG 小鼠後腳步寬明顯寬於 WT 小鼠，三種藥物分別處理沒有造成影響。 (G) rotarod 測試之結果顯示，小鼠 12 週時，WCSOD-006 和 021 的給予皆可有效改善 TG 小鼠協調運動功能，而在 14 週時，處理 WCSOD-021 可以輕微改善小鼠協調能力。(independent t test； *， WT 與 TG 小鼠對照組做比較； #，TG 小鼠對照組與 TG 小鼠處理組做比較；*，#， p < 0.05； **，##， p < 0.01； ***，###， p < 0.001， n = 15). 59.

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(63) 圖 4. 探討 WCSOD 處理對於 SCA17 小鼠周邊系統的影響 (A，B)利用化學冷光分析儀偵測小鼠血液中 ROS 的產生情形，O2- (A) 和 OH˙ (B)在 WT 和 TG 組間並沒有差異。(C，D)以 ELISA 分析發炎反應因子(C)和 GSH (D)，經過藥物處理後，IL6 在 TG 小鼠中，有些微上升的趨勢，而在藥物處理後，皆有獲得改善之趨勢。而 GSH 則沒有受到藥物處理而產生影響。(independent t test，n = 4 (A，B)，n = 6 (C，D)). 61.

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