行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
毛細電泳/質譜，醣體及多醣分析技術之開發與應用(2/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2113-M-002-033- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學化學系暨研究所 計畫主持人： 何國榮 報告類型： 精簡報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 6 月 8 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫期中報告
計畫編號：NSC 92-2113-M-002 -049 -
執行期限：93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日
主持人：何國榮 台灣大學化學系
第一部分：毛細管電層析質譜儀
相關技術之發展與應用
A. 毛細管電層析/電灑法質譜儀
之開發與應用
一、中文摘要 毛 細 管 電 層 析 (capillary electrochromatography , CEC) 是 結 合毛細管電泳與高效能液相層析之特 性的分離技術，藉由此特性可分離帶 電 荷 及 中 性 的 分 析 物 。 以 電 灑 法 (electrospray ionization , ESI)質 譜儀做為偵測器時，可以由滯留時間 與質量做為定性的依據。 在毛細管區帶電泳下，分析市售常 見的八種除草劑，卻無法有效的達到 分離效果;實驗室曾經使用微胞電動 電泳(MEKC)，成功的分離這八種除草 劑，但是在接上質譜儀分析後，由於 緩 衝 溶 液 中 加 入 非 揮 發 性 的 添 加 劑 （介面活性劑 SDS），造成在離子化的 過程中，添加劑與分析物互相競爭液 珠過量電荷而抑制質譜訊號;本實驗 的目的在捨去介面活性劑（SDS）的使 用，避免 SDS 對除草劑質譜訊號的抑 制，改以開管式毛細管(C8)與填充式 毛細管(C18)為分離工具，利用靜相與 除草劑間的作用力達到分離的效果； 此外，實驗中將緩衝溶液醋酸銨的濃 度降低，使醋酸銨對除草劑的抑制現 象降到最低。 關鍵字: 毛細管電層析(CEC),質譜儀, 微胞電動電泳(MEKC) Abstract: Capillary electrochromatography (CEC) can be considered to be a hybrid of capillary electrophoresis (CE) andhigh performance liquid chromatography (HPLC) that has the
potential to become a powerful separation tool for the analysis of charge and neutral mixtures. Electrospray ionization (ESI)-MS is the best chromatography detector available for both retention time and mass analysis.
The eight commercial triazines cannot be separated effectively by capillary zone electrophoresis (CZE). Thus, in our earlier work, micellar electrokinetic chromatography (MEKC) has been investigated and the method can successfully separate the eight triazines. However, when MEKC was
coupled with MS, the surfactant-SDS competed with the analyte about the surface charge of droplet. Therefore, the sensitivity is degraded. To overcome the effect of ionization suppression, ot-CEC and packed-CEC were studied. The results showed that seven out of the eight triazines could be separated and the sensitivity was found to be 10 and 5 times better than MEKC and CZE approaches respectively.
Keyword:capillaryelectrochromatograp hy , MEKC, mass analyzer
二、緣由與目的 傳統上，毛細管電泳是依靠分析物 本身在電場的作用下，根據分析物的 離子遷移率達到分離的效果。然而中 性物質卻會隨著電滲流同時被沖提出 來，因此中性物質是無法在毛細管區 帶電泳中被分離的； 1984 年 Terabe(1) 等 人 提 出 微 胞 電 動 毛 細 管 層 析 電 泳 (MEKC)的方法，它是一種結合微胞液 相 層 析 與 毛 細 管 區 帶 電 泳 的 分 離 方 法，分離的機制主要是利用分析物在 微胞相與水相之間的分配作用，產生 分離的效果，因此可以有效的分離中 性物質。例如：介面活性劑(如：SDS)， 在電泳的分離過程中，陰離子表面活 性劑分子（SDS）和微胞會向陽極端移 動，與電滲流的方向相反，但是電滲 流的流動還是比微胞的移動速率快， 因此微胞最終移動的方向還是與電滲 流方向一致。 然而將微胞電動毛細管層析電泳銜 接上質譜後，由於微胞會隨著分析物 一起流析出來，經過電灑的過程中， 帶 電 荷 液 珠 同 時 包 含 著 分 析 物 與 微 胞。因為介面活性劑是帶有長鏈型的 碳鏈，所以其表面活性大，容易移動 到電灑液珠的表面而形成離子簇，使 得分析物無法有效的游離化，因此分 析物的質譜訊號就會被抑制。 為了降低界面活性劑對質譜訊號的 干擾，本實驗以固定式的靜相(CEC)， 取代界面活性劑(MEKC)。實驗中利用 固定式的靜相，藉由八種除草劑在動 相與靜相間分配係數的不同，對除草 劑達到分離的效果，因為沒有界面活 性劑的抑制，可有效的提升分析物的 質譜訊號。 三 、 結 果 與 討 論 毛細管電層析有多種的製作方式， 本實驗中選擇了開管式毛細管及填充 式毛細管，做為分離八種除草劑的分 離工具。選擇此兩種毛細管的特性分 別介紹如下：(1)開管式毛細管：使用 溶膠凝膠製作(2~3)的 C8 開管式毛細 管 , 它 的 缺 點 就 是 塗 佈 的 表 面 靜 相 薄 ， 造 成 對 樣 品 的 承 載 量 (loading capacity)很低，所以如何有效的尋找 分離條件，且能夠發揮開管式毛細管 對樣品的滯留能力，是實驗中重要的 問題；(2)填充式毛細管：需要有高壓 裝置幫助填充，普遍上填充式毛細管 經常被使用的原因是由於其在靜相的 選擇方面是相當多變化的。本實驗使 用 C18 的靜相，利用長碳鏈端與分析 物作用。在分析的過程中，frit 或填 充顆粒間的氣泡需要小心的除去，避 免造成斷電或導致分析帶的變寬，尤 其是燒結 frit 的毛細管處，相當的脆 弱需要小心的使用，避免造成 frit 端 的毛細管斷裂。
毛 細 管 電 層 析 與 質 譜 儀 銜 接 的 界 面，本實驗採用實驗室之前所設計的 低流速鞘流界面，其目的乃降低傳統 鞘流界面對分析物的稀釋效應，因此 實驗所採用的毛細管電層析/質譜儀 界面，皆使用低流速鞘流界面，以利 於分析物訊號的提升。 3-1、毛細管電層析\電灑法界面的使 用概念 毛細管電層析與質譜儀銜接的界面 中，比較常使用的有兩種，一個為無 鞘流界面，一個為鞘流界面，以下個 別介紹。(1)無鞘流界面：文獻上(4~8) 毛細管電層析/質譜儀使用無鞘流界 面的文章不多，因為其製備不易及施 加高電壓於毛細管電灑噴頭端易導致 電化學反應，造成塗附的導電物質剝 落。一般若是毛細管電泳以純水相的 緩衝溶液作為分離條件的話，容易因 為水的表面張力過大，使得噴灑電壓 過大，造成放電的現象，不利於電灑 離子的形成，然而毛細管電層析使用 的緩衝溶液中，含有一定比例的有機 溶劑，恰好符合無鞘流界面的使用， 不過有機溶劑在流經塗附的導電物質 時，也會因為化學反應導致導電物質 脫落，造成毛細管使用壽命的減短， 所以本實驗不採用無鞘流界面。(2)鞘 流界面：文獻上(9~13)使用鞘流界面 的文章居多，因為鞘流溶液界面以鞘 流 溶 液 作 為 毛 細 管 電 層 析 的 接 地 極 (ground)，維持毛細管電層析的電通 路，所以使用上較無鞘流界面方便許 多，特別是利用毛細管電層析分離八 種除草劑時，因為它們的 pKa 值介於 1.62 ~ 4.3 之間，當緩衝溶液的 pH 值 調至 7.0 時，大部分除草劑皆為中性 的分子，除草劑經過逆相毛細管電層 析分離後，進入鞘流溶液中，因為鞘 流溶液中加入少許的酸，除草劑即可 有效的形成〞預成離子〞，有助於分 析物的離子化。 但 是 鞘 流 界 面 始 終 存 在 著 一 個 問 題，那就是一般電灑法為了達到穩定 噴灑與高靈敏度的訊號，通常分析的 流速操作在最佳流 速 (optimum flow rate)的範圍，也就是在這個流速下， 電灑的靈敏度不再隨著流速的增加而 上升，僅隨分析物的濃度上升而訊號 上升。一般毛細管電層析在銜接質譜 儀時，由於電滲流產生的流速只有 100 nl/min 以下，而傳統鞘流電灑法界面 的最佳流速為 3~5 μl/min，因此需要 外加溶液，補足電灑流速來達到最佳 流速，所以會造成分析物被鞘流溶液 稀釋；而在 1996 年時 Wilm 和 Mann(14) 曾提出縮小毛細管末端口徑，即可降 低電灑法的最佳流速，此電灑的技術 稱為微電灑法(nanospray)。根據實驗 室之前的研究，使用低流速鞘流界面 時，將電灑毛細管末端口徑開成 25 μm 後，此時電灑最佳流速約為 200~300 nl/min，對於毛細管電層析所產生的 電滲流流速在 100 nl/min 以下的流速 而言，低流速鞘流溶液只需要補充約 100~200 nl/min，即可達到電灑訊號 的最佳流速。因此相較於傳統電灑法 界面而言，低流速鞘流界面對於分析 物的稀釋作用較低，所以本實驗採用 低流速鞘流界面避免分析物被鞘流溶 液大量稀釋。 3-2、開管式毛細管\質譜儀的分離 開管式毛細管因為塗佈的靜相僅有 薄薄的一層 C8 靜相，因此對於分析物
的承載量 (sample capacity) 低，所 以在選擇分離條件時相當重要。實驗 中曾經嘗試使用緩衝溶液條件為( 50 mM 醋酸銨 pH 值為 7.0 )，首先以毛細 管區帶電泳測試八種除草劑的分離狀 況，由 CE-UV 圖(圖 1.a)得知，只有兩 根層析峰，推測由於 pH 值為 7.0 時， 絕大部分的除草劑以中性分子為主， 幾乎隨著電滲流一起流析出來，最後 僅能靠高濃度的醋酸銨(50 mM)達到些 許的分離。以相同的緩衝溶液條件， 測 試 開 管 式 毛 細 管 電 層 析 的 分 離 狀 況，由 ot-CEC-UV 圖(圖 1.b)發現，因 為開管式的靜相很薄，C8 靜相幾乎沒 有任何分離上的貢獻，所以八種除草 劑幾乎都在同一個時間出來，甚至層 析峰的尾端有拖尾的現象。 由上述實驗可知，將緩衝溶液的 pH 值調至 7.0，此時幾乎所有除草劑為中 性分子，又由於開管式毛細管的相比 例(phase ratio)過低，所以沒有任何 的分離效果。因此，為了遷就開管式 毛細管相比例低的問題，所以一開始 在選擇緩衝溶液條件時，就必須選擇 有良好分離的最佳條件。 首先緩衝溶液的比例配製成 50 mM 醋酸銨於 80%的乙腈(acetonitrile, ACN)中，將 pH 值調整至 3.85。由(圖 2)中觀察，三個 pKa 相似且含-Cl 的除 草劑，幾乎沒有分開的現象，這樣的 情形就像在毛細管區帶電泳一般，推 測的原因是因為在高達 80% 的乙腈， 除草劑與 C8 靜相的作用時間短，因此 幾乎同時流析出來。至於 Prometon、 Simetryn、Ametryn 的分離狀況也幾乎 與毛細管區帶電泳相似，帶有-OCH3的 Prometon 最 快 被 流 析 出 來 。 而 Terbutryne 與 Prometryn 推測因為其 兩者的碳鏈非極性端較其他除草劑來 的高，所以與 C8 靜相的作用力也較 強，連帶著遷移的時間也增長了，其 中 Terbutryne 的層析峰有變胖的現 象，推測是由於靜相的承載量過低， 再加上分析物自身的電泳遷移所致， 而造成分析帶變寬。 於是試著降低乙腈的比例，增加分 析物與靜相間的作用時間。將緩衝溶 液的比例配製成 50 mM 醋酸銨於 50% 的乙腈中，將 pH 值調整至 3.85。由(圖 3)發現，因為乙腈比例的降低，三個 含-Cl 的除草劑與 C8 靜相間的作用時 間增加而達到分離，且三種含-Cl 的除 草劑分離順序，與微胞電動毛細管層 析電泳(見圖 4)的分離順序相同，出來 時 間 依 序 為 Simazine 、 Atrazine 、 Propazine，主要原因為三個含-Cl 的 除草劑，其末端非極性大小(碳鏈個數) 依 序 為 Simazine <Atrazine <Propazine 。 至 於 Prometon 、 Simetryn、Ametryn 的分離狀況與 80% 的乙腈相似，不過 Simetryn 與 Ametryn 似乎有些微的分開。而 Terbutryne 由 於乙腈的比例降低，層析峰有越來越 胖的趨勢，幾乎快要與背景值相同， 造成難以分辦層析峰。Prometryn 的層 析時間和在 80%乙腈不同，層析峰並未 與三個含-Cl 的除草劑重疊在一起，推 測此三個中性的除草劑與 C8 靜相作用 時 間 增 加 ， 使 得 流 析 出 來 的 時 間 增 長，不再與 Prometryn 重疊在一起。 雖然降低乙腈的比例，增加除草劑 在動相與靜相間的作用時間而分離八 種除草劑。但是缺點為：第一、分離 時間過長，需要花費將近五十分鐘的 時間。第二、受限於需要使用毛細管 區帶電泳的最佳分離條件，緩衝溶液
的濃度(50 mM 醋酸銨)仍舊會造成質 譜訊號的抑制。 為了解決開管式毛細管相比例過低 的缺點，與 50 mM 醋酸銨對分析物質 譜訊號的抑制效應，接下來選擇填充 式毛細管，做為分析八種除草劑的分 離管柱。 3-3、填充式毛細管\質譜儀的分離 填充式毛細管最常使用的原因為: 第一、所使用的填充顆粒，可以選擇 一般 HPLC 所填充的靜相。第二、文獻 上 有 許 多 製 作 填 充 式 毛 細 管 的 流 程 (15~18)。第三、填充式毛細管的靜相 對於分析物的承載量(sample loading capacity)高過於開管式毛細管。但是 填充式毛細管最大的困難就是 frit 的 影響。 有鑑於出口端 frit 會造成氣泡的產 生，於是本實驗將毛細管以拉尖的方 式製作成填充式毛細管,而且拉尖後 的 毛 細 管 ， 僅 需 要 製 作 入 口 端 的 frit，而真正造成氣泡的主要原因卻 是末端的 frit，所以拉尖的填充式毛 細管能夠避免上述氣泡對實驗所造成 的影響。 一開始緩衝溶液的比例配製成 5 mM 醋酸銨於 90%的乙腈(acetonitrile, ACN)，測試毛細管電層析/質譜儀的分 離，由（圖 5）發現，只有 Terbutryne 是分開的，其它七種除草劑幾乎跟在 毛 細 管 區 帶 電 泳 下 一 樣 都 重 疊 在 一 起，雖然可以看到些微的分離，主要 是因為除草劑在 90%的乙腈動相中與 C18 靜相間的分配效率太低，幾乎沒有 太大的滯留效果，只有 Terbutryne 與 C18 的作用時間較長，得以分離出來。 因此，將乙腈的比例降低，讓除草 劑在動相與靜相間的作用時間增加， 以達到分離的效果，由（圖 6）把乙腈 的比例調至 80%時，大致上八種除草劑 可以分出七根層析峰，只有 Propazine 和 Simetryn 兩個分析物明顯的重疊在 一起，無法有效的分離開來，但是可 以利用質譜儀對質量的選擇而區別出 Propazine(m/z 230)與 Simetryn(m/z 214)兩者。雖然不能利用毛細管電層 析對分析物的滯留時間判斷分離，不 過卻可以根據質量不同達到鑑定的功 能。 3-4、開管式 v.s.填充式 CEC/質譜儀 開管式與填充式毛細管電層析對分 離而言，最大的不同便是相比例的大 小問題。由實驗得知將緩衝溶液的 pH 值調為 7.0 時，對開管式毛細管電層 析(圖 1.b)而言，由於相比例過低靜相 幾乎對分析物沒有任何分離的貢獻， 所以沒有分離的效果；對填充式毛細 管電層析(圖 6)而言，由於其靜相對分 析物的高承載量，因此分離效率遠比 開管式毛細管好。 而為了彌補開管式毛細管的缺點， 實驗中採用毛細管區帶電泳的最佳分 離條件(50mM 醋酸銨 pH 3.85)。因此， 開管式毛細管電層析與毛細管區帶電 泳的分離圖譜比較相近，分離的概念 主要是先依靠分析物本身電泳遷移速 率的不同達到初步的分離效果，再加 上分析物與 C8 靜相的作用而分離。但 是因為使用的緩衝溶液為 50mM 醋酸 銨、pH 值為 3.85，所以電滲流相當的 慢，再加上使用 50%的乙腈，使得整體 分析的時間變的相當長（55 分鐘）。 填充式毛細管電層析，使用的緩衝溶
液為 5mM 醋酸銨、pH 值為 7，在這個 條件下，可以增快電滲流縮短分析的 時間(22 分鐘)。 對質譜訊號抑制而言，填充式毛細 管使用的緩衝溶液為 5mM 醋酸銨，對 於分析物的質譜訊號抑制可以有效的 降低由圖 7。而開管式毛細管受限於必 須使用高濃度之緩衝溶液(50mM 醋酸 銨)才能有好的分離條件，因此開管式 毛細管緩衝溶液條件對分析物的抑制 效應高過於填充式毛細管。不過兩者 對於除草劑訊號的提升，都較微胞電 動毛細管層析電泳來的好，見(表 1)。 3-5、填充式 CEC v.s. MEKC/質譜儀 填充式毛細管電層析(圖 6)與微胞 電動毛細管層析電泳(圖 4)的緩衝溶 液之條件皆將 pH 值調至 7.0，所以此 時除草劑幾乎為中性分子，若由兩者 的分離圖譜互相比較，可以發現其兩 者的分離機制非常相似，靠著動相與 靜相間的分配不同，將除草劑分離開 來，首先含-Cl 的三個除草劑依照其非 極 性 度 的 大 小 Simazine <Atrazine <Propazine 依序的流析出來，其後跟 著含-SCH3的 Simetryn、Ametryn 及含 -OCH3的 Prometon 出現，接著是含-SCH3 的 Prometryn 與 Terbutryne。隨著除 草劑的非極性度越大(碳鏈的增加)， 除草劑與靜相間的作用力越強，滯留 的時間也跟著增加，而達到分離的效 果。 另外，將兩種分離方法的訊號互相 比較得知（表 2），由於填充式毛細管 以 C18 靜相取代 SDS 的功用，再加上 緩衝溶液醋酸銨的濃度降到 5mM，推測 可以有效增加除草劑的訊號強度。由 表中發現毛細管電層析(CEC)的八種 除草劑訊號強度都大過於微胞電動毛 細管層析電泳(MEKC)的除草劑訊號強 度約 10 倍以上；再由訊號雜訊比(S/N) 的資訊得知，毛細管電層析因為沒有 微胞對質譜訊號的抑制效應，所得到 的訊號及雜訊訊號大小，都較微胞電 動毛細管層析電泳來的好，大致上訊 號雜訊比值(S/N)上升約 3~14 倍之多。 四、計畫成果自評 1.毛細管電層析以固定式的靜相 (CEC)，取代 SDS(MEKC)的使用，可 捨去因 SDS 競爭液珠表面電荷，而 造成除草劑質譜訊號的抑制。 2.降低緩衝溶液醋酸銨(NH4OAc)的濃 度，可減少緩衝溶液對除草劑質譜 訊號的抑制 3.使用低流速鞘流介面，除了保持鞘 流溶液的優點外，尚可降低鞘流溶 液對分析物的稀釋效應。 4.質譜儀搭配毛細管電層析： (1)開管式毛細管因為相比例 (phase ratio)較低，所以需要搭配 毛細管區帶電泳的最佳分離條件， 才可有效的分離八種除草劑，但是 分析的時間仍過長。 (2)填充式毛細管雖然無法像微胞 電動毛細管層析電泳完全的分離八 種除草劑(可分離七種)，但是捨棄 微胞(SDS)的使用與降低緩衝溶液 醋酸銨的濃度，確實可以有效的提 升分析物的訊號。 五、參考資料
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圖 1、(a)以毛細管電泳分析八種除草劑之 CE-UV 圖。
(b)以開管式毛細管電層析分析八種除草劑之 ot-CEC-UV 圖。 緩衝溶液為 50 mM 醋酸銨 pH 值為 7.0，分離電壓為+20 kV
圖2、使用低流速鞘流界面，以開管式毛細管電層析分析八種除草劑之質譜層析
圖。分離的緩衝溶液為 50 mM 醋酸銨於 80%的乙腈(acetonitrile)中( pH
=3.85)，鞘流溶液為 70 %甲醇＋1 % 醋酸，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電泳 分離電壓為+22 kV
圖 3、使用低流速鞘流界面，以開管式毛細管電層析分析八種除草劑之質譜層析 圖。分離的緩衝溶液為 50 mM 醋酸銨於 50%的乙腈(acetonitrile)中( pH =3.85)，鞘流溶液為 70 %甲醇＋1 % 醋酸，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電 泳分離電壓為+22 kV
圖 4、使用低流速鞘流界面，以微胞電動毛細管層析電泳（MEKC）分析八種除草 劑之質譜層析圖。分離的緩衝溶液為 20 mM 醋酸銨+ 25 mM SDS( pH = 7)，鞘流 溶液為 70 %甲醇＋1 % 醋酸，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電泳分離電壓為+22 kV
圖 5、使用低流速鞘流界面，以填充式毛細管電層析分析八種除草劑之質譜層析 圖。分離的緩衝溶液為 5 mM 醋酸銨於 90%的乙腈(acetonitrile)中( pH =7)，鞘流溶液為 70 %甲醇＋1 % 醋酸，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電泳分 離電壓為+22 kV
圖 6、使用低流速鞘流界面，以填充式毛細管電層析分析八種除草劑之質譜 層析圖。分離的緩衝溶液為 5 mM 醋酸銨於 80%的乙腈(acetonitrile)中( pH =7)，鞘流溶液為 70 %甲醇＋1 % 醋酸，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電泳分離 電壓為+22 kV
圖 7、(a) 將 Atrazine 溶於不同濃度的醋酸銨中，以電滲流方式連續注入，在 不同醋酸銨濃度下分析物的絕對訊號大小
表 1、填充式毛細管電層析、開管式毛細管電層析與微胞電動毛細管層析電泳/ 質譜儀的訊號比較
表 2、填充式毛細管電層析與微胞電動毛細管層析電泳/質譜儀的訊號比較
B.晶片電泳/質譜儀之發展
一、中文摘要 質譜儀是近來分析基因、蛋白質 及藥物研發最重要的技術之一。建構 於微小化裝置上的晶片電泳是化學分 離技術的一種，晶片電泳具有靈敏 度、速度、儀器尺寸、花費及定量的 優點，將晶片電泳與電灑式質譜儀系 統相結合可大幅的增加毛細管電泳於 生物分析的功能。 晶片電泳技術銜接電灑質譜做線 上(on-line)分析的主要困難在於電灑 介面的製作。外接式毛細管電灑介面 不易製做，通常是通道不易對準或是 上膠時易塞住通道，甚或接口端上膠 不均而產生無效體積(Dead Volume)。 本 研 究 中 ， 採 用 高 分 子 塑 膠 材 料 PMMA 為基材，製作電泳晶片。電灑 介 面 則 利 用 高 黏 稠 之 環 氧 樹 脂 膠 (epoxy)黏接已拉尖之 毛細管電灑噴 頭。方法是將30µm 鎢絲的一端穿入電 泳晶片出口通道(50µm)中，另一端則 穿入一段1cm 長之斜口毛細管噴頭(口 徑30µm)，塗環氧樹脂膠於晶片及毛細 管噴頭接點間，環氧樹脂膠會微滲入 而填補接縫，待環氧樹脂膠聚合硬化 後抽離鎢絲，即可於出口端接上電灑 噴頭。 此介面不僅易於製作且可減小無 效 體 積( ＜ 0.5nl) 對 層 析 解 析 度 之 影 響。電灑測試結果顯示，此介面在最 佳流速下電灑可長時間穩定操作，並 進 行 晶 片 電 泳 電 灑 質 譜 於 胜 (peptides)混合物分析之評估 關鍵字: 晶片電泳,質譜 Abstract:Microfabricated analytical devices are receiving growing interest due to their potential to enhance sensitivity and speed, as well as for reduction of instrument size, cost, and weight. A variety of microdevices have been constructed including chemical separation techniques, e.g., capillary electrophosesis (CE). Mass spectrometry (MS) is one of the most important techniques for analysis of a broad range of samples related to genomics, proteomics, and drug discovery. The coupling of chip CE to ESI/MS systems would greatly expand the potential of both CE and ESI/MS for biotechnological applications.
In this work, the chip electrophoresis is coupled with ESI-mass spectrometer using an attached capillary sprayer. Chip CE was fabricated on poly(methyl methacrylate) substrate by wire-imprinting technique. The coupling of the ESI sprayer with the separation channel was found to be the most difficult challenge of this design. To facilitate the alignment of the separation channel with the attached ESI sprayer, one end of a metal wire (30µm) is inserted into the separation channel (50µm) of the chip. The other end is inserted into the tapered ESI tip. Then the epoxy is applied to the junction. After the epoxy is hardened thoroughly, withdraw out the wire. As a result, the ESI sprayer could be precisely aligned
with the exit of the separation channel. The performance of the device was evaluated with the analysis of peptides mixtures. The results indicated that this design could produce a stable electrospray for long-time operation. Keywords: chip capillary electrophoresis, mass spectrometry 二、緣由與目的 本研究目的在於研製晶片電泳與 質譜儀的連接界面，希望能將微晶片 這樣的微小化分析裝置，與質譜儀這 樣具有高靈敏度及高選擇性的偵測器 相 結 合 ， 以 望 能 達 到 晶 片 電 泳 的 分 離，甚至高通量的樣品分析以及偵測 上的高鑑定性，並且希望將製程低成 本化、簡單化、操作自動化，以將其 應用於生化方面的分析上。 在晶片電泳/質譜的界面設計上採 用外接電灑噴頭的設計。並且在晶片 的製作上儘量的減小晶片與外接電灑 噴頭的無效體積(Dead volume)以避免 影響電泳的分離效率。基於晶片電泳 的 低 流 速 與 微 電 灑 流 速 相 符 合 的 關 係，電灑噴頭的設計上採用拉尖毛細 管，並控制出口端口徑以符合電灑法 的最佳流速(optimum flow rate)，希望 藉由上述的設計研製晶片與質譜儀界 面上的連接。
三 、 結 果 與 討 論
外接電灑噴頭的設計，最大的問 題在於晶片管道與毛細管電灑噴頭內 徑管道的對準及黏接。對於晶片管道 與電灑噴頭內徑管道的對準問題的解 決是利用高黏稠之環氧樹脂膠(epoxy) 黏接30µm 已拉尖之毛細管電灑噴 頭。方法是將外徑30µm 鎢絲的一端穿 入電泳晶片通道(50µm) 出口中，另一 端則穿入一段約1cm 長之斜尖口毛細 管噴頭(口徑 30µm) (圖 2)，塗環氧樹脂 膠於晶片及毛細管噴頭接點間，利用 環氧樹脂膠的高黏滯性，微滲入而填 補接縫，待環氧樹脂膠聚合完全硬化 後抽離鎢絲，即可於出口端接上電灑 噴頭。此製作方法可有效的避免製作 電灑介面時所導致的膠封通道的問 題。另外，也免除通道對準的困難， 簡化介面製作的流程，省時也大幅的 增進電灑晶片製作的成功率。 圖1(a)中，電灑電壓是透過尖端導 電塗佈施加，方法是利用商業化導電 橡膠的B 部分(導電橡膠部分)，塗佈於 已拉尖且內通氣流的毛細管尖端上， 再經強力氣流(100psi)逆向吹拂，均勻 地推平導電橡膠於尖端外表面，置於 45℃烘箱中烘烤約 3 分鐘以加速硬化。 晶片的設計如圖1(a)，使用簡單的 十 字 進 樣 設 計 ， 進 樣 通 道 內 徑 為 50µm，進樣電場約 650V/cm，最大進 樣電流60µA。進樣及分離之施加電壓 如圖 1(b)所示，進樣時利用電動聚焦 (pinched injection) 減 緩 樣 品 擴 散 現 象。但是分離管道的另一端是無鞘流 介面，無緩衝液可補充進通道，因此 不施加聚焦電壓(pinched voltage)，以 避免斷電現象的產生。圖1(c)簡示實際 的進樣帶寬現象。 圖 3 為晶片電泳電灑裝置藉由電 滲流推動樣品溶液連續電灑做穩定測 試。由於晶片電泳的分離管道短，分 析的時間通常較少超過 5 分鐘，因此以每 5 分鐘為一個測試週期，強度差 異約可維持在10~15%的範圍內，顯示 電滲流足以維持電灑的穩定。 圖4 是以 5 個 20µM 的胜肽標準品 混合物進行晶片電泳分離評估。進樣 時間30 秒，每次分析擷取 5 分鐘層析 圖，分離電場300V/cm。分析物約在 1 分鐘後沖堤出，半高峰寬約在 12~20 秒左右。
四、計畫成果自評
1. 此 膠 黏 式 外 接 電 灑 噴 頭 的 Chip-CE/MS 界面可以產生穩定的 電泳電灑訊號。 2. 以胜標準品混合物成功進行晶 片電泳的分離評估。五、參考資料
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(a)
(b)
(c)
圖1. (a)PMMA 晶片尺寸設計。(b)電壓施加圖示。(c)實際樣品、緩衝液流動模擬
圖 2. 30μm 斜尖口電灑噴頭(未導電塗佈)。拉尖侵蝕後，於 2000 番號的水砂 紙上以斜角 30°先磨成斜口，再左右旋轉 90°磨成尖口。
圖3. 電灑電泳晶片裝置連續電灑 5 分鐘之 TIC 圖。樣品為 1ppm reserpine 於 MeOH/H2O=1:1, 1%HOAc, pH=3.5。
RT:0.00 - 6.42 SM:3G 0 1 2 3 4 5 6 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 1.77 1.60 1.98 1.92 2.05 NL: 3.37E5 m/z= 659.90-661.90 F: ITMS + c NSI Full ms [ 150.00-2000.00] MS 03
NL: 2.34E6
m/z= 368.40-370.40 F: ITMS + c NSI Full ms [ 150.00-2000.00] MS 03
NL: 7.12E5
m/z= 379.30-381.30 F: ITMS + c NSI Full ms [ 150.00-2000.00] MS 03
NL: 6.05E5
m/z= 291.30-293.30 F: ITMS + c NSI Full ms [ 150.00-2000.00] MS 03
NL: 4.17E5
m/z= 569.70-571.70 F: ITMS + c NSI Full ms [ 150.00-2000.00] MS 03
圖4. 20µM 胜肽混合物之晶片電泳分離。分離條件為 Buffer: MeOH/H2O=1/9,
C. 低揮發性緩衝液毛細電泳/質
譜界面之研究
一、中文摘要 在做毛細電泳分離時，所使用的 緩衝溶液系統大都是非揮發性的無機 鹽類(如硼酸鈉鹽，磷酸鈉鹽等)，或者 是添加一些非揮發性的界面活性劑(如 SDS 等)來提高分離效率。然而，當毛 細電泳與電灑法質譜儀相銜接時，這 些無機鹽類很可能在離子化過程中與 分析物互相競爭而抑制質譜訊號。因 此，為了改善這些抑制效應，便朝兩 部分進行，一方面是仍然使用常用的 非揮發性緩衝溶液系統，但是設計界 面來降低其抑制效應;而另一方面則是 尋找適當的緩衝溶液使其既能保有良 好的分離效果，又較不會抑制分析物 的訊號來取代目前的非揮發性緩衝溶 液。 關鍵字: 低流速,毛細電泳,質譜 Abstract:The combination of CE with
electrospray ionization-mass spectrometry has proven to be a useful
towards improved sensitivity and increased certainty in peak identification. Unfortunately, it is difficult to couple directly nonvolatile buffer CZE and MEKC with ESI-MS because the nonvolatile buffers and surfactants are known to suppress the signals of analytes. Consequently , volatile buffers or volatile additives were used in most CE/MS applications. However ,
nonvolatile buffers often provide better separation than volatile buffers in many CZE applications. Therefore, suitable CE/ESI-MS interfaces needs to be developed for MEKC and nonvolatile buffer CZE/ESI-MS analysis. I
Keywords: low flow, capillary electrophoresis, mass spectrometry
二、緣由與目的 微 胞 電 動 毛 細 管 層 析 法 (MEKC)(1)，它主要的分離機制是利用 溶質在微胞與介質溶液之間的分配作 用而產生分離的效果。這項技術最大 的特點是使毛細管電泳法除了使用在 離子型物質的分離之外，同時能夠應 用在中性物質的分析。 然 而 當 微 胞 電 動 毛 細 管 層 析 法 (MEKC)與電灑法質譜儀相銜接時， SDS 是一種帶有長碳鏈的界面活性 劑，其表面活性較大 (2-15) ，所以容 易佔據電灑法所產生的液滴表面，並 且 搶 走 表 面 所 帶 有 的 正 電 荷( 如 Na+)，進而排斥分析物離子導致分析 物無法移動至表面，而不易從液滴中 脫附出形成氣態離子，而使得靈敏度 下降。 有鑑於此，利用合併兩個斜口毛 細管設計一個新的毛細管電泳界面。 此界面綜合了傳統鞘流以及無鞘流界 面的優點。兩個毛細管中，一個提供 毛細電泳的分離，另一個提供極低流 速（∼300 nL/min）類似鞘流介面所使 用 的 輔 助 溶 液 。 相 較 於 傳 統 鞘 流 界 面，由於本界面使用斜口的設計，不 需很高流速的輔助溶液就可達到電灑 法的最佳流速。而實驗室已成功的利
用此界面分離 trazine 化合物，相較於 傳統鞘流界面，本界面還可以提高分 析物的訊號並且降低界面活性劑對分 析物的抑制效應。 而另外一個抑制原因就是非揮發性鹽 類所產生的干擾雜訊。在電灑的過程 中，液珠分裂後的母液珠有大約15 % 的電荷移到分裂出的液珠，而本身的 大小卻只減小了2 %(16)，因此使得母 液珠的電荷密度下降，若電荷密度不 夠則無法再行分裂，故液珠會因為溶 劑揮發而持續縮小，縮小後的母液珠 鹽類濃度高過鹽類飽和濃度時，就會 產 生 所 謂 的 離 子 簇(ion cluster) 的 訊 號。由於此過程會產生許多不同大小 及不同電荷量的離子簇，使分析物訊 號 會 被 界 面 活 性 劑 的 離 子 簇 訊 號 抑 制。因此我們利用此界面於非揮發性 緩衝溶液區帶毛細電泳/電灑法之負離 子模式下分離酚類化合物和神經節苷 脂， 並在維持毛細電的解析度下得到 最佳靈敏度。 三 、 結 果 與 討 論 圖 1 所示為本界面的示意圖，此 界面由兩個斜口毛細管所結合而成。 當兩個斜口毛細管結合在一起後原先 的泰勒錐也會結合在一起，此時兩個 管柱的溶液就會互相混合共同形成一 個 泰 勒 錐 。 在 毛 細 電 泳 質 譜 的 操 作 上，我們使用一個斜口毛細管負責樣 品的毛細電泳分離，另一個斜口毛細 管負責補充輔助液體。此設計與一般 傳統或是低流速鞘流界面最大的不同 點就是輔助液體是平行的補充，而不 是利用同軸的外管補充鞘流液體至毛 細管尖端。 雙 斜 口 介 面 所 產 生 的 泰 勒 錐 極 小，因此此介面不需要高流速便維持 穩定的電灑，因此界面的設計可以大 幅度的降低樣品受到輔助溶液的稀釋 效應，也可得到輔助溶液所帶來的好 處(電灑法穩定，可使用幫助離子化的 添加劑)。由於電灑法質譜儀是屬於濃 度靈敏度的儀器，因此當分析物進入 質譜的濃度上升時樣品的偵測靈敏度 也會上升。 圖2a為使用傳統鞘流界面時，分 離六種西藥化合物的質譜層析圖，圖 2b則是使用斜口鞘流界面所得到質譜 層析圖，比較兩張圖可以得知，使用 斜口鞘流界面所得到的分析物訊號強 度和訊號雜訊比，主要原因除了稀釋 比例小外，界面與質譜的入口處距離 較 短 ， 再 加 上 不 需 要 輔 助 氣 體 的 幫 助，進樣效率也較高。圖3a為經由最 佳化輔助溶液分離七種酚類化合物的 質譜層析，實驗發現利用斜口低輔助 流界面所得到的訊號強度，相較於在 相同條件下使用的低流速界面(圖 3b) 提高了二至五倍，並且七種酚類化合 物皆可看到，主要的原因為可控制輔 助溶液的稀釋，因而可以降低界面活 性劑的濃度，減少抑制，雖然在此同 時，分析物也被稀釋了，但相對於分 析物跑至表面的機率就變大，如此分 析物的訊號強度便可提高。圖3a 為使 用傳統鞘流界面分離神經節苷脂，所 得到質譜層析圖，我們發現使用硼酸 銨鹽緩衝液和硼酸鈉鹽系統相比，可 以明顯減少緩衝溶液的抑制效應，而 若鞘流溶液的pH值控制在9，也有助於 訊號的提升但只能看到GD1a的分析物 訊號，而從圖 3b，若使用斜口低輔助 流界面來分析神經節苷脂，訊號雜訊 都能大幅提升。
四、計畫成果自評 1.我們成功開發出低輔助流鞘流界面。 2.透過低輔助流鞘流界面，可以尋找到 輔助溶液流速的最佳條件。 3.成功應用西藥、酚類和神經苷節脂的 分析，並跟傳統鞘流界面和低流速鞘 流界面比較，有較好的質譜訊號。 五、參考資料 1. S. Terabe, K. Otsuka, K.
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16. P. Kebarle, J. Mass Spectrom. 35, 804, (2000)
Beveled tip with 530
µm i.d. and 75 µm i.d.
orifice
Second capillary with 155 µm
o.d. 50 µm i.d. and 25 µm orifice
to deliver make-up liquid by
syringe pump
Microcentrifuge Tube
Make-up liquid
CE separation capillary with
155 µm o.d. 50 µm i.d. and 50
µm orifice
Pt Wire
Oxyphenbutazone m/z = 325 Intensity = 1.58E6,S/N = 117 Phenylbutazone m/z = 309 Intensity = 2.0E6,S/N = 168 Ketoprofen m/z = 255 Intensity = 1.19E6,S/N = 76 Niflumic acid m/z = 283 Intensity = 6.09E6,S/N = 301 Sulindac m/z = 357 Intensity = 1.92E6,S/N = 119 Mefenamic acid m/z = 242 Intensity = 1.40E6,S/N = 94 圖 2 使用(a)傳統鞘流界面鞘流流速為 5 µl/min，電灑電壓為+ 4 kV 毛 細電泳分離電壓為+24 kV。和(b)斜口鞘流界面鞘流流速為 0.6 µl/min ，電灑電壓為+ 2 kV，毛細電泳分離電壓為+22 kV 在正離 子模式下分析西藥化合物之SIM 質譜層析圖。分析物的注入方式 為使用重力注入10 mbar, 10 秒。分離的緩衝溶液為 40 mM 醋酸 Oxyphenbutazone m/z = 325 Intensity = 2.83E5,S/N = 16 Phenylbutazone m/z = 309 Intensity = 5.95E5,S/N = 32 Ketoprofen m/z = 255 Intensity = 3.42E5,S/N = 10 Niflumic acid m/z = 283 Intensity = 1.49E6,S/N = 47 Sulindac m/z = 357 Intensity = 2.90E5,S/N = 15 Mefenamic acid m/z = 242 Intensity = 9.01E4,S/N = 5 (a) (b)
(a) (b) 圖3 使用(a)斜口鞘流界面輔助溶液的流速為 0.4 µl/min ，電灑電壓為 -1.6kV，毛細電泳分離電壓為＋18.4 kV (b)低流速鞘流界面，電 灑電壓為-2 kV，毛細電泳分離電壓為＋18 kV 分析酚類化合物 之SIM 質譜層析圖。分析物以用重力注入 10 mbar, 10 秒進樣。 分離的緩衝溶液為pH= 7 的 20 mM CHES 加上 40 mM SDS，輔 助溶液為80 % 異丙醇+ 1 % 氨水。 4-NP m/z = 138 Intensity 3.61E5,S/N 480 2-M 4,6-DNP m/z = 197 Intensity 6.26E5,S/N 1270 2,4-DNP m/z = 183 Intensity 4.64E5,S/N 41 2,4-DMP m/z = 121 Intensity 5.27E4,S/N 22 4-C-3MP m/z = 141 Intensity 6.37E4,S/N 15 2,4-DCP m/z = 161 Intensity 1.34E5,S/N 50 2,4,6-TCP m/z = 195 Intensity 9.42E4,S/N 42 2-M 4,6-DNP m/z = 197 Intensity 8.52E4,S/N 48 2,4-DNP m/z = 183 Intensity 9.44E4,S/N 16 2,4-DMP m/z = 121 Intensity 2.21E3,S/N 2 4-C-3MP m/z = 141 Intensity 1.06E4,S/N × 2,4-DCP m/z = 161 Intensity 1.16E3,S/N × 2,4,6-TCP m/z = 195 Intensity 1.37E3,S/N × 2-M 4,6-DNP m/z = 197 Intensity 8.52E4,S/N 48
(a) (b) 圖 4 使用(a)使用傳統鞘流界面流速為 5 µl/min，電灑電壓為-4 kV，毛細電泳分 離電壓為+16 kV (b)斜口低輔助流界面外加輔助流速為 0.4 µl/min，電灑電 壓為-1.6 kV，毛細電泳分離電壓為＋18.4 kV 分析神經節苷脂化合物之 SIM 質譜層析圖。分析物以重力注入10 mbar, 10 秒進樣。分離的緩衝溶液為 20 mM α-CD + 40 mM 硼酸銨鹽在 pH = 10.6，輔助溶液為 80 %異丙醇 pH=9 。 GM1 m/z = 1545 Intensity 8.39E4,S/N 3 GD1a/b m/z = 932 Intensity 8.97E4,S/N 10 GD1a/b m/z = 918 Intensity 8.62E4,S/N 3 GM1 m/z = 1573 Intensity 7.76E4,S/N 3 GT 1b m/z = 718 Intensity 4.81E3,S/N × GT 1b m/z = 709 Intensity1.61E3 ,S/N × GM1 m/z = 1545 Intensity1.98E6,S/N 300 GD1b m/z = 932 Intensity 2.41E6,S/N 289 GD1b m/z = 918 Intensity 4.31E5,S/N 180 GM1 m/z = 1573 Intensity1.94E6,S/N 112 GT 1b m/z = 718 Intensity 3.39E4,S/N 10 GT 1b m/z = 709 Intensity 3.86E4,S/N 5 GD1a m/z = 918 Intensity 2.14E6,S/N 605 GD1a m/z = 932 Intensity 2.42E6,S/N 361
第二部分：質譜於蛋白質/醣蛋白
質體學相關研究與應用
A. 毛細液相層析與拋棄式奈灑
探針電灑法質譜/質譜於蛋白
質鑑定之開發與應用
一、中文摘要 在後基因體時代的今日，蛋白質 體學是重要的課題，主要為蛋白質的 鑑定、相關的定量分析與蛋白質間的 交互作用。近年來質譜儀在靈敏度、 分析速度、方便性等方面的快速進 步，及高靈敏度軟離子化方法的發展 而使質譜儀成為分析這些生化分子的 核心技術；蛋白質鑑定為協助了解蛋 白質功能、與疾病發生的關係及藥物 的研究，相對於 Edman 定序儀，質譜 儀分析較快速，可以用較少的樣本量 即可完成分析，加上質譜儀分析技術 的自動化，提供了一個高通量分析工 具，能對許多微量蛋白質快速分析， 這對進行蛋白質體研究有極大的幫 助。目前鑑定蛋白質身分的高可信度 技術為將蛋白質經酵素消化成胜肽， 接著經由層析的方法分離，以串聯式 質譜技術作序列分析，經由資料庫比 對來鑑定蛋白質。 本研究第一部分為建立毛細液相層析 電灑法串聯式質譜儀，成功地鑑定大 白鼠第二型肺泡細胞特有胞器-層質 體 (lamellar bodies) 之組成蛋白質，以 研究此胞器之形成及其功能行使分子 機轉，有助於未來臨床上對呼吸窘迫 症病患的處理與治療。第二部分鑑於 層析方法過於耗時，而開發具簡單且 可拋棄式的奈灑探針，將消化後的胜 肽直接送入串聯式質譜儀進行分析， 可達到快速鑑定蛋白質及無樣品殘留之問題；以標準樣品 (the tryptic digest
of Myoglobin)，蛋白質身分鑑定的極限 可至 2.5 fmol，具有使用方便及低樣 品消耗的優點。第三部分我們以濃縮 為主訴求，希望能開發簡單、實用且 能線上淨化的方法，真正予以應用在 真實樣品的鑑定上，而開發線上淨化 微電灑串聯質譜儀，大幅提高濃縮倍 率及減少分析時間，實際應用於層質 體的蛋白質體，得到高可信度的蛋白 質鑑定結果。 關鍵字: 蛋白質、質譜 Abstract:
In this study, we set up on-line micro capillary reversed phase liquid chromatography interfaced to a tandem mass spectrometry (µLC-MS/MS) for protein identification. Protein identification of lamellar bodies proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis was achieved by applying µLC-MS/MS. However, the current technique is time consuming. We developed a disposable device that could be on-line clean up and infusion unseparated proteolytic peptides into an ESI tandem MS. It was demonstrated that several proteins of lamellar bodies could be successfully identified by using this on-line clean up method. Compared to µLC-MS/MS, this method could identify proteins rapidly and be without cross-contamination although the
peptide sequence coverage was lower. Keywords: protein identification, mass spectrometry 二、緣由與目的 進入後基因時代後，蛋白質體成 為科學家們研究所著重之目標，而蛋 白質之鑑定已然成為研究重心之一， 質譜技術不斷進步，加上電腦自動化 以及生物資訊技術上的突破，使得蛋 白質體學得以快速發展，成為後基因 體時代最重要的課題。其中蛋白質身 分鑑定 (protein identification, protein ID) 已是一個可例行性操作的技術，然 而質譜分析技術必須要不斷創新的發 展，以面對蛋白質體學的種種需求。 本研究希望以二維膠體電泳結合 質譜，建立毛細液相層析以串聯式質 譜儀作為高可性度蛋白質身分鑑定， 並希望開發更為經濟有效率的分析方 法，應用於真實樣品。 三 、 結 果 與 討 論 3-1 毛細液相層析電灑法串聯式質譜 儀 本系統仿效之前提出的系統而設 計，主要分為兩個部分，Precolumn 與 Separation column；Precolumn 主要功 能為保護Separation column 且減少整 個流程的時間，進樣流速以µL/min 而 非nL/min 送至 precolumn 上作濃縮與 去鹽，再由六向閥的切換造成的壓力 差以200 nL/min 流速將濃縮於 Precolumn 中的樣品送至 Separation column，進行分離及質譜儀線上偵 測。梯度設計為20 分鐘 15-40%B，再 加上平衡時間，分析一個樣品需35 分 鐘，選擇較快速的梯度設計原因是我 們的分析物較單純，通常含 1 個或 2 個蛋白質，我們希望以較快的方式即 可完成鑑定的工作。 系統建立好後注射標準分析物樣 品 300 fmol (the tryptic digest of bovine serum albumin）作為測試，平均半高
寬為15 秒以內，經資料庫搜尋的結果
可信度很高，且有67%胜肽序列涵蓋
度 (Peptide Sequence Coverage) 本實驗以蛋白質體學的研究方 法，將純化自大白鼠肺泡細胞的胞器 層質體以二維膠體電泳方式，pH 3-10 作第一維IEF 依等電點分離再以 15% SDS gel 作第二維分子量的分離， SYPRO Ruby 染色後以螢光偵測蛋白 質點，得到層質體的二維膠體電泳圖 (圖 1)。將有興趣的點用酵素trypsin 對蛋白質中的Lysine (Lys, K) 與 Arginine (Arg, R) 的胜肽鍵消化水 解，再以毛細液相層析串聯式質譜儀 系統鑑定蛋白質的身分。蛋白質鑑定 結果如表 (表 1) ，鑑定結果具可信 度，平均胜肽序列涵蓋度 (Peptide Sequence Coverage) 於 20％以上。 3-2 拋棄式奈灑探針電灑法串聯式質 譜儀 上一節毛細液相層析電灑法串聯 式質譜儀，成功地鑑定真實樣品，建 立起蛋白質身分鑑定的平台，然而鑑 於層析方法過於耗時，且容易有前個 樣品殘留的問題，而欲開發具簡單且 可拋棄式的奈灑探針，將消化後的胜 肽直接送入串聯式質譜儀進行分析， 可達到快速鑑定蛋白質。 操作方法利用毛細現象以拉尖處 吸取溶液非常好操作，不僅沒有樣品 運送的損失，也不會在探針裡有氣泡
的產生，真的可以作到只需很少的溶 液即可作分析。估計流速在70-100 nL 之間。 我 們 用 標 準 樣 品 (the tryptic digest of Myoglobin) 序列稀釋，再分 別吸取約500 nL的樣品來分析，成功地 鑑定蛋白質的身分，我們將所使用的 絕對量與鑑定結果如表所示 (表2) 3-3 線上淨化微電灑串聯式質譜儀 上一節我們希望以直接電灑法質 譜/質譜 (ESI-MS/MS) 的方式，將蛋 白質經酵素消化成胜肽作序列分析以 鑑定蛋白質身分，而設計了拋棄式的 探針，製作上非常簡單，具有使用方 便及消耗很少樣品的優點；然而省去 液相層析的步驟，我們將胜肽樣品經 ZipTipC18除鹽濃縮，再以探針吸取作分 析 ， 以 自 製 的 標 準 樣 品 (the tryptic digest of Myoglobin) 序 列 稀 釋作 分 析，蛋白質身分鑑定的偵測極限可以 至2.5 fmol，雖然大大省去時間，但濃 縮倍率有限且不是線上分析，在面臨 真實樣品時恐怕無法達到此表現，因 此我們承襲快速分析的初衷，希望能 開 發 簡 單 、 實 用 且 能 線 上 分 析 的 方 法，真正予以應用在真實樣品的鑑定 上。 系統設計如圖 (圖2)，測試可行性 後，我們取層質體 (lamellar bodies) 的 二維膠體中其中幾點作分析，成功地 鑑定蛋白質的身分，將結果與之前使 用毛細液相層析電灑法串聯式質譜儀 得到的資料相比對，如表所示兩技術 鑑定的結果為一致 (表3) 。 將兩技術相比較，此法操作簡單 方便，省去質譜分析的時間也不需高 壓幫浦的設備，且淨化管柱是拋棄式 的不會有前個樣品殘留的問題，雖然 此 技 術 的 胜 肽 序 列 涵 蓋 度 (Peptide Sequence Coverage) 可能較低，但當面 對不是非常複雜的真實樣品時，平均5 分鐘可完成一個樣品的蛋白質身分鑑 定與液相層析至少30分鐘相比，是非 常符合經濟效益的。 四、計畫成果自評 1.我們以二維膠體電泳結合毛細液相 層析質譜，成功地分析出大白鼠肺泡 細胞中的層質體之組成蛋白質。 2.奈灑探針的設計與操作非常簡單且 拋棄式，未來可作到自動化，不僅是 應用於蛋白質鑑定，對於其他量很少 的分析物，這是一個經濟實惠的分析 方法。 3. 開 發 線 上 淨 化 微 電 灑 串 聯 式 質 譜 儀，於真實樣品鑑定上有良好的分 析，提供了省時有效率的蛋白質身分 鑑定之方法。 五、參考資料 1. Wilkins,M. R., Sanchez, J. C., Golley,A. A., Appel, R. D.,
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圖 1 層質體的二維膠體電泳圖
11
6
7
KDa
97
12
pH 3
pH 10
1
2
3
4 5
8
9
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
11
6
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16
17
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High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
Syringe pump
High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
Packed capillary
Syringe pump
High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
Syringe pump
High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
High Voltage
Sheath liquid
15 μmorifice
Packed capillary
Syringe pump
圖 2 低流速鞘流介面線上前濃縮偵測之裝置示意圖表 1 層質體蛋白質身分鑑定結果
Spot Protein name
Database accession number Theor. pI Theor. Mr (kDa) Sequence coverage (%) 1 Polymeric-immunoglobulin receptor precursor P15083 5.07 85 18 2 Contrapsin-like protease inhibitor 3 precursor P05544 5.48 46 34 3 Alpha-1-antiproteinase precursor P17475 5.7 46 20 Vimentin P31000 5.06 54 24
4 ATP synthase beta chain,
mitochondrial precursor P10719 5.19 56 48
5 disulfide isomerase A6 precursor Q63081 4.95 47 16
6
Serum albumin precursor [Contains:Neurotensin-related
peptide (NRP)]
P02770 6.09 69 30
7 Serotransferrin precursor P12346 6.94 76 20
8 Protein disulfide isomerase A3
precursor P11598 5.88 57 43
9 Actin P60711 5.29 42 48
10 Pulmonary surfactant-associated
Spot Protein name Database accession number Theor. pI Theor. Mr (kDa) Sequence coverage (%) 11 Pulmonary surfactant-associated protein A precursor P08427 4.79 26 20 12 Annexin A4 P55260 5.31 36 18 13 Annexin A1 P07150 7.14 39 18 14 Voltage-dependent
anion-selective channel protein 1 Q9Z2L0 8.63 31 40
15 Glutathione S-transferase Yc-1 P04904 8.83 25 34
16 ATP synthase beta chain,
mitochondrial precursor P10719 5.19 56 48
17 Cathepsin H precursor P00786 8.69 37 19
18 Myosin light polypeptide 6 Q64119 4.46 17 44
19 Lysozyme C P00697 9.32 17 56
20 Pulmonary surfactant-associated
protein B precursor P22355 6.17 42 11
表 2 標準樣品 (the tryptic digest of Myoglobin) 序列稀釋鑑定結果
500 fmol 250 fmol 125 fmol 50 fmol 25 fmol 2.5 fmol
Sequence Coverage
(%)
59 43 40 39 26 22
表 3 毛細液相層析與低流速鞘流介面線上前濃縮電灑法串聯式質譜儀鑑定層質 體蛋白質之比較 Spot Protein name Theor. Mr (kDa) Sequence coverage (%) Mascot score 6 LC-ESI-MS/MS ESI-MS/MS 7 LC-ESI-MS/MS ESI-MS/MS 11 LC-ESI-MS/MS ESI-MS/MS P02770 P02770 P12346 P12346 P08427 P08427 69 69 76 76 26 26 30 19 20 14 18 11 658 560 331 278 223 115
B.發展醣探針於醣體學之研究
一、中文摘要 醣化為蛋白質最主要的後轉譯修 飾之一，醣蛋白上的醣鏈在蛋白質的 結構與功能上，扮演了重要的角色。 一般分析醣鏈於醣蛋白上的分佈，會 將醣鏈從醣蛋白上切下，但若醣化的 位置不只一個時，便無法得知來自個 別醣化位置上醣鏈的分佈，因此本研 究以醣胜肽為分析的對象，保留醣化 位 置 的 資 訊 ， 以 胰 蛋 白 酶 水 解 醣 蛋 白，利用纖維素微晶體純化醣胜肽， 再以電灑法線性離子阱質譜儀分析純 化後的醣胜肽，來得知各別醣化位置 上醣鏈的分佈。然而，醣胜肽經由質 譜/質譜所得之片斷多來自於醣苷鍵的 斷裂，因此利用線性離子阱多次質譜/ 質譜的特性得到醣胜肽上來自胜肽的 特徵裂片離子，經由資料庫搜尋比對 即可達到蛋白質之鑑定並得知醣化的 位置。 關鍵字: 醣蛋白, 醣鏈, 質譜 Abstract:Glycosylation is one of the major posttranslational modifications of protein. The structure diversity inherent in the sugar moieties of a glycoprotein enable subtle changes in protein shapes, charge and volume that could affect its function both temporally and spatially. A simple approach for determine the distribution of glycans from individual glycosylation site of glycoprotein has been developed. Glycoproteins were digested with Trypsin which is specific protease yielding glycopeptides containing a peptide and glycan. Glycopeptides were purified using cellulose microcrystalline and analyzed by electrospray- linear ion trap mass spectrometry. In addition, both the glycoprotein and glycosylation site could be identified using MSn analysis.
Keywords: glycomics, glycans, mass spectrometry
二、緣由與目的
人體中約有 35,000 個基因會表現出
蛋 白 質 ， 但 由 於 轉 譯 後 修 飾 ( post-translational modifica- tion)、突變
以及RNA 剪切等機制而大幅增加蛋白 質的種類。要在這種複雜的環境中， 有系統性的鑑定細胞在不同狀態下基 因所表現出蛋白質的差異，其中包含 蛋白質種類和表現差異量的程度，以 及蛋白質與蛋白質的交互作用等，會 是一個很大的挑戰。質譜儀因對蛋白 質分析上具有極佳的質量準確度、靈 敏度再加上分析速度快等優點，而成 為 蛋 白 質 體 學 中 不 可 或 缺 的 一 個 技 術。 醣 化 是 蛋 白 質 最 常 見 的 後 轉 譯 修 飾，哺乳類的蛋白質大約60~90％是醣 蛋白。醣蛋白的醣鏈與生命現象有著 密切的關係，許多醣蛋白的醣鏈在受 精、發炎、免疫反應、癌症、血型等 方面都扮演了重要的角色。細胞上醣 蛋白的醣鏈提供細胞間確認的依據， 可以很精確的辨認受體的特異性，例 如：精蟲可以辨認同種的卵子，或是 某 些 毒 素 反 應 的 受 體 或 附 著 體 。 另 外，醣蛋白的醣鏈對於蛋白質三度空 間的構形亦極為重要，使得蛋白質可 以順利的疊合。這些重要的功能皆來 自於醣蛋白上醣鏈的差異，因此了解 醣蛋白在細胞不同狀態下，醣鏈的分 布及量的差異，對於蛋白質在生物體 內的作用會有更深入的了解。而此種 研究細胞在某一個狀態下，所有醣蛋 白上的醣鏈稱為醣體學(glycomics)。 然而於 1999 年由 Steven P. Gygi
等 人 所 提 出 的 ICAT(isotope-coded affinity tag)技術，只能偵測蛋白質表現 量的差異，無法得知蛋白質上後轉譯 修 飾 程 度 的 改 變 ， 因 此 本 研 究 利 用 ICAT 技術的概念，應用到偵測不同狀 態的細胞在醣蛋白上醣鏈的分布及量 的差異，也就是對兩種不同狀態下的 細胞，進行醣體學的分析。然而，在 進行真實樣品之醣體學分析前，須先 尋找一有效的方法得以觀察單一醣蛋 白於個別醣化位置上醣鏈之分布，並 且克服醣胜肽不易進行蛋白質鑑定的 困難，才可有效進行醣體學之分析。 三 、 結 果 與 討 論 本研究利用蛋白質水解酵素-胰蛋 白酶(Trypsin)具有專一性水解蛋白質 之特性，將醣蛋白水解成胜肽以及醣 胜肽，再藉由纖維素微晶體與醣胜肽 間具有親水性之親和作用力來純化醣 胜肽。純化後的醣胜肽包含來自不同 醣化位置的資訊，利用 C18 毛細液相 層析分離不同醣化位置的醣胜肽，結 合 電 灑 法 線 性 離 子 阱 質 譜 儀 進 行 分 析，即可得到來自於個別醣化位置上 醣鏈分布的資訊，並且利用離子阱質 譜儀具多次質譜/質譜之功能，可進一 步得到醣胜肽上來自於胜肽的斷裂碎 片，以達到蛋白質鑑定的目的，並可 得知醣化位置。 本研究以醣蛋白-核糖核酸酶 B 來 測試此方法，核糖核酸酶 B 為氮連接 型式之醣蛋白，只具有一個醣化的位 子並且具有五種醣鏈，分別為Man5、 Man6、Man7、Man8、Man9，其相對 之含量分別為57%、30%、4%、7%、 1%。以胰蛋白酶水解後的結果如圖一 (A)，圖中可觀察到 Man5、Man6、 Man7、Man8、Man9 之醣胜肽與核糖 核酸酶 B 其他未含有醣鏈之胜肽，平 均來說醣胜肽相對於其他胜肽之訊號 較 小 ， 為 了 要 使 醣 胜 肽 更 容 易 被 觀 測，因此利用纖維素微晶體具有親水 性親和之特性，對醣胜肽做純化，其 純化的結果見圖一(B)，從圖中可觀察 出醣胜肽的訊號較為顯著，且其相對 比例與實際的醣鏈分佈很接近。由此 結果可知，若能將單一醣化位置的醣 胜肽做純化，即可藉由質譜圖觀察出 個別醣化位置之醣鏈分佈。 醣胜肽在碰撞以致裂解(CID)下的 訊號，通常會得到來自於醣苷鍵的斷 裂，而能用來進行蛋白質鑑定之胜肽 片段的訊號，只有當所接的醣鏈只含 有一個單糖時才會較為明顯，因此， 本研究利用線性離子阱質譜儀具有多 次質譜/質譜的特性，嘗試找尋醣胜肽 於多次質譜/質譜下的斷裂規則，以期 達到蛋白質鑑定及得知醣化位置的目 的。核糖核酸酶B 經胰蛋白酶水解後， 以 纖 維 素 微 晶 體 所 純 化 之 醣 胜 肽 Man5、Man6、Man7、Man8、Man9 的質譜/質譜圖見圖二，從圖中可觀察 出其斷裂的碎片多來自於醣苷鍵的斷 裂，然而，只含有一個單糖的醣胜肽 為第一或是第二強的訊號。以 Man5 之醣胜肽做個測試，將質譜/質譜圖中 只含有一個單糖的醣胜肽 m/z678.5 更 進一步進行 CID，如圖三(B)，可觀察 出圖中最強的訊號，即為Man5 之醣胜 肽 去 掉 醣 鏈 的 完 整 胜 肽 訊 號 (m/z475.3)，因此，將此完整胜肽訊號 同樣進行CID 可得圖三(C)，圖中可明 顯得到胜肽的序列資訊。將此圖譜送 入蛋白質鑑定的軟體：Sequest 進行資 料庫的搜尋，其結果顯示於圖四，第 一順位的搜尋結果即為核糖核酸酶， 並可得此醣胜肽之胜肽序列，由此胜 肽序列中只有一個胺基酸具有醣化的 可能性，可得知其醣化的位置即為氮 端的第一個胺基酸。因此，本研究利 用此種規則，設計了讓線性離子阱可 自動化分析醣胜肽的方法，此方法除 了可得到醣胜肽的醣鏈分佈外，還可 以做到蛋白質的鑑定以及醣化位置的 確認。
四、計畫成果自評 1. 本研究開發可觀察醣蛋白個別醣 化位置醣鏈之分布的方法。 2. 此方法應用於醣蛋白-核糖核酸酶 B，所得之醣鏈分布與理論上相 似，且利用線性離子阱質譜儀具有 多次質譜/質譜的特性，達到蛋白質 鑑定以及醣化位置的確認。 3. 預期此方法結合毛細液相層析便 可進行真實樣品醣體學之分析。 五、參考資料
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圖 1、以電灑法線性離子阱質譜儀分析核糖核酸酶 B 以胰蛋白酶水解之結果。(A) 未經纖維素微晶體純化醣胜肽(B)已纖維素微晶體純化醣胜肽
(B)
圖2、核糖核酸酶 B 之醣胜肽的質譜/質譜(A)Man5 之醣胜肽 m/z 846.5(B) Man6
之醣胜肽m/z 927.5 (C)Man7 之醣胜肽 m/z 1008.5(D) Man8 之醣胜肽 m/z 1090.5(E)
Man9 之醣胜肽 m/z 1171.5。 (B)
(C) (E)
(D) (A)
圖3、以電灑法線性離子阱質譜儀分析核糖核酸酶 B 中 Man5 之醣胜肽(A)質譜/ 質譜，m/z 846.5 → (B)質譜/質譜/質譜，m/z 846.5 → 678.5 → (C)質譜/質譜/質譜/ 質譜，m/z 846.5 → 678.5 → 475.3 →。 (A) (B) (C)
