掃描式穿隧電流顯微鏡與蛋白質形貌與結構變異分析

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授王忠茂教授. 掃描式穿隧電流顯微鏡與蛋白質形貌與結構變異分析. 研究生林襄廷. 中華民國一百零五年六月.

(2) 目錄致謝............................................................................................................. I 圖目錄.......................................................................................................III 表目錄...................................................................................................... IX 摘要............................................................................................................. i Abstract ...................................................................................................... ii 第一章緒論.............................................................................................2 第二章實驗.............................................................................................5 2.1. 化學藥品 ...................................................................................5. 2.2. 實驗設備 ...................................................................................5. 2.3. 鐵蛋白修飾電極：前處理與製備 ...........................................6. 2.4. 掃描式穿隧顯微鏡操作步驟 ...................................................6. 2.5. 原子力顯微鏡操作步驟 ...........................................................8. 第三章實驗結果與討論 ......................................................................12 3.1. 鐵蛋白之掃描式電子穿隧顯微鏡(STM)分析 ......................12. 3.2. 鐵蛋白之原子力顯微鏡(AFM)分析 ......................................19. 3.3. 鐵蛋白之導電模組(C-AFM)影像分析 ..................................22. 3.4. 蛋白質變性結構分析 .............................................................24. 第四章結論...........................................................................................32.

(3) 第五章未來展望 ..................................................................................33 參考文獻...................................................................................................34 附錄...........................................................................................................36.

(4) 致謝本論文得以完成，承蒙指導教授王忠茂老師這三年悉心指導與鼓勵，使我在研究所生涯獲益良多。在我遇到問題與挫折時，給予建議與引導，並且總是包容並關心我，使我能保持信心解決實驗瓶頸，在此由衷致上最誠摯的感激。同時，也感謝口試委員范秀芳教授及張元賓教授在百忙之中參與我的學位口試，指正學生論文，給予寶貴建議，使內容更臻完善。感謝張庭瑜學姊總是關心我的實驗狀況，和我一起談天說地，也提供實驗上許多技巧與建議，使我在實驗上更順利，感謝張家偉學長花時間另外教我我想學的實驗技術等等，感謝蔡宜庭學長總會抽空回來看大家，給予實驗的建議與指教，感謝邱柏豪學長當初和我真誠地介紹實驗室，歡迎我加入這個溫馨的家庭，感謝王慶豪學長時常關心我，並且與我分享過去的實驗室生活等，感謝諸多學長姊照顧我。也謝謝林煒舜同學在我碩一、碩二的陪伴與幫助，與我分享許多生活上的趣事，謝謝林子晶、簡仲葳、王佩婷三位學妹的協助與包容，也使我的實驗生活多采多姿，感謝宋燕玲、曾思瑜、許詩弘學弟妹的關心、支持、歡笑，因為有你們，我才能保持樂觀開朗的自己。此外，也感謝國立臺灣師範大學提供美好的學習環境，以及國科會的經費贊助。. I.

(5) 最後，我想將此論文的成果獻給我的父母與家人，謝謝你們的栽培與鼓勵，感謝你們總是陪伴我的求學路途並關心我，給予我許多建議與提醒，唯有你們，才能讓我一路念到碩士，願你們身體健康，開心幸福，一切順利。. 林襄廷謹誌臺灣師範大學化學系研究所一百零五年六月 II.

(6) 圖目錄圖 3-1 HOPG 於氣相下所得的 STM 影像與立體圖。掃瞄速度 30 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。………………………………….12 圖 3-2 HOPG 於液相下所得的 STM 表面影像以及剖面分析圖，其中掃瞄範圍為 2 nm × 2 nm，掃瞄速度 30 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。…………………………………………………………….13 圖 3-3 於氣相下所得的 FT 平面與三維 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……14 圖 3-4 四個獨立 FT 於氣相下所測得的(A) STM 影像及其(B)寬度與 (C)高度分析圖。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。………………………………………….15 圖 3-5 FT 於液相下測得之平面與三維 STM 影像圖。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 10 Hz，穿隧偏壓 500 mV，穿隧電流 5.6 nA。…16 圖 3-6 三個獨立的 FT 於液相下測得之(A) STM 影像及其(B)寬度與 (C)高度分析圖。掃瞄範圍為 20 nm×20 nm，掃瞄速度 10 Hz，穿隧偏壓 500 mV，穿隧電流 5.6 nA。………………………………………..17 圖 3-7. FT 的(A)平面(B)三維 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，. 掃瞄速度 0.5 Hz。……………………………………………………….18 圖 3-8 五個獨立 FT 的(A) AFM 影像及其(B)寬度與(C)高度分析圖。 III.

(7) 掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。……………………….19 圖 3-9 FT 的液相 STM、氣相 STM、AFM 影像之(A)寬度(B)高度分析。………………………………………………………………………20 圖 3-10. (A) FT 與(B)空白 HOPG Contact mode AFM 影像及(C) FT (D). 空白 HOPG C-AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5Hz，施加偏壓 0.5V。…………………………………………………………21 圖 3-11. HOPG 與 FT 的 I-V 曲線。掃瞄速度 0.5 Hz。………………..22. 圖 3-12 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 (A) 0；(B) 15；(C) 20 min 所得之 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。………………………………………..23 圖 3-13 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 0；15；20 min 所得 STM 影像之(A)寬度(B)高度分析。………………………..………………..…….24 圖 3-14 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 0；5；15；20 min 所得之 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。………………..…25 圖 3-15 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 0；5；15；20 min 所得 AFM 影像之(A)寬度(B)高度分析。…………………………………..………26 圖 3-16. FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 0；10；20 min 所得之 STM 影像。. 掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………………………………...……..27. IV.

(8) 圖 3-17 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 (A) 0；(B) 10；(C) 20min 所得 STM 影像之(A)寬度(B)高度分析。……………..………..…………….28 圖 3-18 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 (A) 0；(B) 10；(C) 20min 所得之 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。…………29 圖 3-19 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 (A) 0；(B) 10；(C) 20min 所得 AFM 影像之(A)寬度(B)高度分析。……………...…………………….30 圖 3-20 ITO 的 STM 影像。掃瞄範圍為 500 nm × 500 nm，掃瞄速度 512 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。…………………………36 圖 3-21 氣相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………………………...…………………..37 圖 3-22 氣相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。………………………………………………………………….38 圖 3-23 氣相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………………………...…………………..39 圖 3-24 氣相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流. V.

(9) 2.7 nA。………………………………………….………………………40 圖 3-25 液相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 5.6 nA。……………………………………………….…………………41 圖 3-26 液相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 5.6 nA。…………………………………………………………….……42 圖 3-27 液相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 5.6 nA。……………………………………………….…………………43 圖 3-28 FT 的 AFM 剖面(A)寬度；(B)高度影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。…………….………………...…………..44 圖 3-29 FT 的剖面(A)寬度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。……...………45 圖 3-30 FT 的剖面(A)寬度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。……………...46 圖 3-31 FT 的剖面(A)寬度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。………….…..47 圖 3-32 FT 的剖面(A)寬度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm. VI.

(10) × 30 nm，掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。…………….48 圖 3-33 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 15 min 所得之剖面(A)寬度； (B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。…………………………...…………..49 圖 3-34 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度； (B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………………….50 圖 3-35. FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 5 min 所得之所得之剖面(A)寬. 度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz...51 圖 3-36 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 15 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。…...….52 圖 3-37 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。…...….53 圖 3-38 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 10 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………...…………..54 圖 3-39 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。……………………………...…………..55. VII.

(11) 圖 3-40 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 10 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。……....56 圖 3-41 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。………57. VIII.

(12) 表目錄表 3-1. FT 於液相 STM、氣相 STM、AFM 影像平均寬度與高度分. 析。……………………………………………………………………20. IX.

(13) 摘要本論文利用掃描式穿隧電流顯微鏡（Scanning Tunneling Microscopy，簡稱 STM）探討鐵蛋白吸附於高定向裂解石墨（Highly Oriented Pyrolytic Graphite，簡稱 HOPG）之表面結構，測量其於氫氧化鈉及鹽酸溶液中變質，逐漸改變結構之影像，藉以建立蛋白質岐化與形貌變異關聯性。結果顯示：鐵蛋白經氫氧化鈉溶液處理後表面形貌會逐漸變異，其寬度增大而高度降低，並且顯現塌陷現象。我們也對鹽酸的影響進行探討，發現經由鹽酸處理，鐵蛋白也顯現類似變化，但結構不會呈現塌陷。根據這些結果，我們認為 STM 具有作為研究蛋白質結構變異之分析方法。. 關鍵字：掃描式穿隧電流顯微鏡、蛋白質形貌與結構變異分析. i.

(14) Abstract In this thesis, we use scanning tunneling microscopy (STM) to investigate structural changes of proteins during denauration. Ferritin (FT) is a global protein, responsible for iron regulation in biosystems. Because of its spherical structure, we use it as a model protein to monitor any changes in surface structure as adsorbed on HOPG when exposed to basic and acidic reagents, such as 1 M NaOH and 1 M HCl. Experimental results show that in NaOH, the surface morphology of FT changes gradually with immersion time, in which the height decreases from 0.430 to 0.345 nm, but the width increases from 15.240 to 19.538 nm. Besides, the center of the FT shows indentation phenomenon, contrasting to the results found in HCl solutions. Accordingly, we consider STM a useful tool for surface analysis of proteins.. ii.

(15) 第一章緒論本實驗室過去曾以導電模組原子力顯微術（ Conductive mode Atomic Force Microscopy，簡稱 C-AFM）對鐵蛋白（Ferritin，簡稱 FT）與缺鐵鐵蛋白（Apoferritin，簡稱 apoFT）的結構進行影像分析 (1). ，也曾以磁性模組原子力顯微術（Magnetic mode AFM，簡稱 MFM）. 與力曲線（Force Curve）辨識二者結構異同(2)，其間發現若以氫氧化鈉處理，鐵蛋白與探針間的引力會降低(3)。有鑒於此，本論文擬以掃描式電子穿隧顯微術（Scanning Tunneling Microscopy，簡稱 STM）對鐵蛋白曝露於酸鹼環境中的結構變異進行深入探討。鐵蛋白為一球形蛋白，常存於人體肝臟與巨噬細胞，分子量約為 450 kDa，由 24 個分子量約為 20 kDa 的蛋白質次單位所組成，內徑約為 8 nm，而外徑約為 12 nm。鐵蛋白的主要功能為儲存鐵離子，大約能容納 4500 個鐵離子，進而平衡生物體內鐵離子濃度。由於其特殊功能與結構，近來鐵蛋白受到生物醫學領域廣泛研究，並且鐵蛋白也成為診斷血清中鐵蛋白含量、冠狀動脈、惡性腫瘤、幹細胞移植的參考指標(5,6)。而鐵蛋白於人體大腦內鐵蛋白儲存、鐵離子累積與神經性退化疾病的關聯性(4)，目前尚未有文獻對鐵蛋白累積情形進一步深入探討，因此本研究以 STM 技術試圖瞭解鐵蛋白造成病理之鐵蛋. 2.

(16) 白表面形貌變異研究。對於鐵蛋白的表面形貌，S. Ohnishi 等人曾以 AFM 探討(7,8)，確立 AFM 具有作為分析蛋白質工具的應用潛力(9)。自此，掃描顯微術如 C-AFM(10,11)、STM、Scanning Electrochemical Potential Microscopy（簡稱 SECPM）與磁性模組 MFM(12,13,14,15)也相繼被用來分析鐵蛋白的表面結構、導電度與磁性。在這些研究中，實驗顯示若鐵蛋白的溫度接近於人體體溫時，其傳遞電子行為會近似於金屬(12)。對於鐵蛋白表面吸附行為，石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，簡稱 QCM）、表面電漿共振（Surface Plasmon Resonance ，簡稱 SPR）、X-ray 光電子能譜（X-ray Photoelectron Spectroscopy，簡稱 XPS）等方法均被探討，並可藉以分析鐵蛋白的表面覆蓋率及膜厚(16)。這些研究不僅有助於辨識鐵蛋白於矽與氧化矽表面的行為差異 (17). ，亦肯定鐵蛋白在生物感測器與生物燃料電池的應用潛力(18-20)。文獻也曾報導，鐵蛋白中的氫氧化鐵與磷酸鐵. （(FeOOH)8(FeOH2PO4)），若經熱處理，可形成奈米粒子(21)。若再配合電漿蝕刻，便可將其結構由 12 nm 縮減至 2 nm(22)。文獻也曾報導， apoFT 若經 Mn(III)、Co(III)、Cu(II)處理，可製成含金屬蛋白的三明治電極，具有生醫光電感測應用潛力。除此之外，研究也預測 FT 可藉以發展有機場效應電晶體(23)。雖然如此，鐵蛋白於酸、鹼環境下所. 3.

(17) 衍生的結構變異則尚未被探討。對於蛋白質結構分析，理論上可以 X 射線晶體繞射(X-ray crystallography)、核磁共振(NMR)、二維電泳 (2D Gel electrophoresis)、酵素免疫分析法(ELISA)、基質輔助雷射脫附離子質譜(MALDI)、計算模擬(Computational modeling)等方法施行之，惟上述技術多需繁複樣品前處理與昂貴設備，因此本論文選擇以具高解析能力的 STM 對 FT 結構變異進行分析。掃描式穿隧顯微鏡（簡稱 STM）是 Binnig 與 Rohrer 於 1981 年所發明，可藉由探針與導體間的穿隧電流，獲得原子級的影像解析度。 STM 的成像原理主要是利用電子的穿隧效應。當探針與樣品間距離接近 5Å 時，若對探針施加電壓，電子即可發生穿隧效應，產生穿隧電流。若固定電流值，則可藉由探針掃瞄時的垂直位移，得知樣品表面形貌。我們發現：當 FT 浸置於 NaOH 溶液中時，其結構會逐漸塌陷。我們也對 HCl 對 FT 進行探討，鐵蛋白經鹽酸溶液處理後寬度增大，高度降低。這些現象尚未被報導，顯示 STM 具有辨識蛋白質結構變異的應用潛力。. 4.

(18) 第二章實驗 2.1 化學藥品藥品名稱. 廠牌. 1. Ferritin (FT). Sigma. 2. Sodium hydroxide. Sigma. 3. 銅膠. 3M. 4. 銀膠. Delta technologies. 5. STM 探針絕緣膠. UNT. 6. 高純水. Milli-Q. 2.2 實驗設備儀器名稱. 廠牌規格. 1. 工作電極. HOPG. 2. 原子力顯微鏡. NanoScope IIIA, Veeco Metrology. 3. 接觸式掃描顯微鏡探針. Nanosensors PPP-XYCONTR. 4. 非接觸式掃描顯微探針. Budgetsensors Multi75M-G. 5. 鉑銥合金線(Pt:Ir=90:10wt%). Gredmann Taiwan（直徑 0.25mm）. 6. 銀絲(99.99%). STREM CHEMICALS. 7. 斜口鉗. VICTOR 5.

(19) 2.3 鐵蛋白修飾電極：前處理與製備 A. HOPG 電極：於鐵片上黏貼雙面銅膠，將 HOPG 裁成面積 1 cm×1 cm 大小後黏於鐵片上，在 HOPG、銅膠、鐵片間以銀膠導通，每次使用前以膠帶將最上層 HOPG 撕除，即可得到乾淨 HOPG 表面。 B. Ferritin 溶液：將 Ferritin 溶液溶於去離子水中稀釋，製備濃度為 530 g/mL 的 Ferritin 水溶液。 C. Ferritin 固定於 HOPG 電極之製備：以 dip coating 方式將 B 溶液滴於步驟 A 所製得 HOPG 電極上，俟五分鐘後，再以去離子水沖洗表面，晾乾備用。 2.4 掃描式穿隧顯微鏡操作步驟 A. STM 鉑銥合金探針製備 1. 將鉑銥合金線依序以水及丙酮沖洗後，以鑷子緊夾鉑銥合金絲，再以斜口鉗以 10~15°角迅速裁剪之，以顯微鏡觀察針尖情形。 2. 進行液相 STM 影像分析時，探針須先絕緣，首先以鑷子夾住探針，再以小刷將指甲油滴施於針尖後端約 0.5cm 處，小刷跨於針尖後端兩側，來回刷多次後順勢往外滑出，使指甲油包覆針尖，並注意毛刷不可觸碰到針尖，亦不可使探針針尖被完全絕緣，待. 6.

(20) 兩小時乾燥後移入收納盒備用。 B. 儀器操作步驟 1. 儀器開機前，先將電位儀與儀器以排線串接，並且將機台 (Nanoscope controller)至於懸吊式避震系統上。 2. 依序開啟電腦、電腦螢幕、機台(Nanoscope controller)、軟體 (Nanoscope R(III))。 3. 將 Nanoscope controller 調成 STM mode。 4. 開啟 Nanoscope R(III)程式，點選程式所示的. ，再從跳出的對. 話框選擇 Quadrexed EC MultiMode，以進入主要調控視窗，並設定 Other controls 的 Microscope mode 調為 STM mode。 5. 將步驟 A 製得的 STM 探針以鑷子裝入 STM 專用的 Converter head，並與電位儀連接，以肉眼確認尖端是否垂直朝下且不碰到樣品。 6. 進行液相 STM 測量時，將有固定樣本之鐵片上方加上鐵氟龍反應槽，以螺絲鎖住四角，再將溶液注入，確定溶液沒有漏出後，再置於機台上。 7. 先進行手動下針，再進行電腦微調下針。 (1) 手動下針：機台上有 Up（上針，基座往下）和 Down（下針，基座往上），以手動下針讓探針先大幅度接近表面，用肉眼觀察探. 7.

(21) 針與樣本之間距離約 1mm 後停止下針。 (2) 電腦微調下針：在 Nanoscope R(III)中點選. 下針，螢幕上會出. 現開始下針並出現 Approaching surface 警告，待機器發出＂逼＂一聲，即表示下針完成，圖像開始顯示於電腦螢幕。 8. 點選顯示螢幕的. ，顯示螢幕下方的 Capture 顯示為 On 表示. 開始儲存影像，顯示為 Done 完成儲存。若 Capture 顯示 next 則是掃描中有調整參數以致重新掃描後下張圖像才會儲存，顯示 forced 則是掃描中調整參數後仍儲存當張圖像。 2.5 原子力顯微鏡操作步驟 A. Tapping mode 1. 依序開啟電腦、電腦螢幕、顯示螢幕、高倍率顯微鏡、光源、機台(Nanoscope controller)、軟體(Nanoscope R(III))。 2. 將非接觸式探針放入 tapping 探針座到底夾緊，旋緊探針座（若未旋緊探針座將無法調頻），並將樣品放置於機台上。 3. 調整旋鈕直到光柵產生後，再稍微調整旋鈕，使雷射直射於針尖上，此時雷射的 SUM 值將會達到最大值。 4. 選擇機台上的 TM AFM 模式，調整 VERT 數值約 0 左右（若為負值則圖像可能造成圖像模糊）。再將模式開到 AFM&LFM 模式，調整 HORZ 數值約 0 左右（若為負值則圖像可能造成圖像模糊）。. 8.

(22) 來回檢查數次，確保數值的正確性，也必須使 SUM 值逼近最大值。之後再將機台上的模式調回 AFM&LFM 模式。 5. 設定 Nanoscope R(III)中 Other controls 的 Microscope mode 調為 tapping。 6. 點選. 進行調頻，並點選調頻(Autotune)，等待 Autotune 完成後. 下針。 7. 先進行手動下針，再進行電腦微調下針。 (1) 手動下針：機台上有 Up（上針，基座往下）和 Down（下針，基座往上），透過高倍率顯微鏡和顯示螢幕確定基板與探針差距，再手動下針讓探針先大幅度接近表面後停止下針（若太接近表面則探針懸臂將呈現白色）。 (2) 電腦微調下針：先確定 VERT 數值與 HORZ 數值約 0 左右、SUM 值逼近最大值，接著在 Nanoscope controller 軟體中點選. 下針，. 螢幕上會出現開始下針並出現 Approaching surface 警告，待機器發出＂逼＂一聲，即表示下針完成，圖像開始顯示於電腦螢幕。 8. 點選. ，顯示螢幕下方的 Capture 顯示為 On 表示開始儲存影像，. 顯示為 Done 完成儲存。若 Capture 顯示 next 則是掃描中有調整參數以致重新掃描後下張圖像才會儲存，顯示 forced 則是掃描中調整參數後仍儲存當張圖像。. 9.

(23) B. Conductive mode（可得 C-AFM 影像，I-V curve） 1. 依序開啟電腦、電腦螢幕、顯示螢幕、高倍率顯微鏡、光源、機台(Nanoscope controller)、軟體(Nanoscope R(III))。 2. 將接觸式探針放入探針座到底夾緊，旋緊探針座，並將樣品放置於機台上。 3. 調整旋鈕直到光柵產生後，再稍微調整旋鈕，使雷射直射於針尖上，此時雷射的 SUM 值將會達到最大值。 4. 將導線探針座以軟細線接上訊號放大器，同時確定訊號放大器未顯示電流過大指示燈(overload)。 5. 選擇機台上的 TM AFM 模式，調整 VERT 數值約-1~-2。再將模式開到 AFM&LFM 模式，調整 HORZ 數值約 0 左右。來回檢查數次，確保數值的正確性，也必須使 SUM 值逼近最大值。之後，再將機台上的模式條回 AFM&LFM 模式。 6. 設定 Nanoscope R(III)中 Other controls 的 Microscope mode 調為調為 C-AFM。 7. 將 Channel 2 中 Data type 改為 C-AFM current。 8. 先進行手動下針，再進行電腦微調下針。 (1) 手動下針：機台上有 Up（上針，基座往下）和 Down（下針，基. 10.

(24) 座往上），透過高倍率顯微鏡和顯示螢幕確定基板與探針差距，再手動下針讓探針先大幅度接近表面後停止下針（若太接近表面則探針懸臂將呈現白色）。 (2) 電腦微調下針：先確定 VERT 數值約-1~-2、HORZ 數值 0 左右、 SUM 值逼近最大值，接著在 Nanoscope controller 軟體中點選下針，螢幕上會出現開始下針並出現 Approaching surface 警告，待機器發出＂逼＂一聲，即表示下針完成，圖像開始顯示於電腦螢幕。 9. I-V curve 量測： (1) 位置：點取顯示螢幕上的 Offset，選定所欲量測 I-V curve 之位置後，點選 Execute 將會變更指定位置。 (2) 參數：Ramp channel 改為 DC sample bias 後，可控制 Ramp begin 及 Ramp end 改變施加電壓範圍，Scan rate 控制掃描速率。 10. 點選. ，顯示螢幕下方的 Capture 顯示為 On 表示開始儲存影像，. 顯示為 Done 完成儲存。若 Capture 顯示 next 則是掃描中有調整參數以致重新掃描後下張圖像才會儲存，顯示 forced 則是掃描中調整參數後仍儲存當張圖像。. 11.

(25) 第三章實驗結果與討論 3.1 鐵蛋白之掃描式電子穿隧顯微鏡(STM)分析鐵蛋白(Ferritin，簡稱 FT)為生物體中常見的球蛋白，主要功能為儲存生物體內的鐵離子。有鑒於 FT 的生化特性與球形結構，本論文擬以掃描式電子穿隧顯微術(簡稱 STM)，分析 FT 在酸、鹼環境中發生變性時的結構變異。進行影像分析前，我們須將 FT 固定於基材表面。首先選擇的基材是 ITO 導電玻璃表面(24)，惟 ITO 表面粗糙度過大，所以我們改以 HOPG 做為基材，其氣相與液相 STM 影像如圖 3-1 與 3-2 所示，所測得的碳原子其直徑分別為 0.222 nm 與 0.223 nm，與文獻報導值 0.220 nm 極為吻合(25)，顯示本實驗所使用的探針具有 0.05 nm 的解析能力。. 12.

(26) 圖 3-1 HOPG 於氣相下所得的 STM 影像與立體圖。掃瞄速度 30 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 13.

(27) 圖 3-2 HOPG 於液相下所得的 STM 表面影像以及剖面分析圖，其中掃瞄範圍為 2 nm × 2 nm；速度 30 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 5.6 nA。. 進行 FT 影像分析時，我們先以 dip coating 方式將 40 L 的 FT 溶液（濃度 530 g/mL）滴於 HOPG (1 cm × 1 cm)表面，俟靜置五分鐘後，再以去離子水沖洗表面，去除未固定的蛋白質與鹽類。鐵蛋白氣相下所得的 STM 影像如圖 3-3 所示，鐵蛋白於室溫下顯現出預期的球形結構，故本研究皆於室溫下進行實驗。. 14.

(28) 圖 3-3 於氣相下所得的 FT 平面與三維 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 我們也對其他 FT 進行分析，其平面與 3D 立體影像如圖 3-4 所示。經由不同角度剖面分析，我們發現其平均寬度與高度分別為 15.24 nm 與 0.43 nm。若與 FT 的 X-ray 數據（直徑 12 nm）進行比較，我們發現 STM 所得的寬度比 X-ray 寬約 3 nm，但高度遠小於 X-ray 的數值。究其原因，可能是 FT 導電度差，不易成像(12)(26)(27)，或是部分官能基與 HOPG 緊密吸附，導致蛋白質坍塌之故。此外，在氣相下進行影像分析時，FT 結構內部分水分子可能因而散逸，致使其結構與 X-ray 結構不盡相符。. 15.

(29) (1). (2). (3). (4). A. 19. B. Width (nm). 18 17 16 15 14 13 1. 2. 3. 4. Ferritin (number). C. Height (nm). 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1. 2. 3. 4. Ferritin (number). 圖 3-4 四個獨立 FT 於氣相下所測得的(A) STM 影像及其(B)寬度與 (C)高度分析圖。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。 16.

(30) 我們也在液相中對 FT 進行 STM 影像分析，其結果如圖 3-5 所示。我們另對兩個獨立 FT 進行分析，其平均高度為 2.43 nm，而寬度為 9.96 nm，接近於 X-ray 繞射所得數值。若與在氣相下所得的數據相比較，發現液相下所得高度較高，但寬度較窄，顯示在液相下，FT 的結構可能因水分子支撐的關係，顯得較為飽滿。. 圖 3-5 FT 於液相下測得之平面與三維 STM 影像圖。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 500 mV，穿隧電流 5.6 nA。. 17.

(31) (2). (1). (3). A. B. Width (nm). 12. 11. 10. 9. 8 1. 2. 3. Ferritin (number) 3.2. C. Height (nm). 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1. 2. 3. Ferritin (number). 圖 3-6 三個獨立的 FT 於液相下測得之(A) STM 影像及其(B)寬度與 (C)高度分析圖。掃瞄範圍為 20 nm×20 nm，實驗條件與前圖相同。. 18.

(32) 3.2 鐵蛋白之原子力顯微鏡(AFM)分析除了以 STM 分析外，我們也以原子力顯微鏡(簡稱 AFM)對 FT 進行結構分析，其結果如圖 3-7 所示。我們同時分析五個獨立 FT，分析其平均高度為 1.734 nm，而平均寬度為 16.92 nm，如圖 3-8。我們也將 AFM 數據與 STM 數據進行比較，並將之歸納於圖 3-9 與表 3-1 中。根據比較結果，我們發現：液相 STM 所得高度最高，寬度則以 AFM 最寬。我們推論以 STM 與 AFM 技術測量之鐵蛋白結構分析不盡相符，可能是 AFM 所使用之探針與 STM 所使用之探針因解析度而有所差異。此外，若是以 STM、AFM、X-ray 鐵蛋白結構分析比較，我們推論 X-ray 鐵蛋白結構最精確，但 X-ray 所使用之鐵蛋白結晶所需環境（如鹽類種類與濃度、鐵蛋白濃度）與本實驗環境較不相同，因此鐵蛋白於表面形貌結構分析與 X-ray 鐵蛋白結構因而有所差異。. B. A. 圖 3-7. FT 的(A)平面(B)三維 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，. 掃瞄速度 0.5 Hz。. 19.

(33) (1). (2). (3). (4). (5). A. 20. B. Width (nm). 19. 18. 17. 16. 15 1. 2. 3. 4. 5. Ferritin (number) 2.4. C. Height (nm). 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1. 2. 3. 4. 5. Ferritin (number). 圖 3-8 五個獨立 FT 的 AFM 影像與寬度與高度分析。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 20.

(34) Width (nm). A. 液相STM 氣相STM. 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7. AFM. 1. 2. 3. 4. 5. B. Height (nm). Ferritin (number). 液相STM 氣相STM. 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2. AFM. 1. 2. 3. 4. 5. Ferritin (number). 圖 3-9. FT 的液相 STM、氣相 STM、AFM 影像之(A)寬度(B)高度分. 析。. 表 3-1. FT 於液相 STM、氣相 STM、AFM 影像平均寬度與高度分析。分析法. 液相 STM. 氣相 STM. 平均寬度(nm). 9.96±1.40. 15.24±1.47. 16.92±1.77. 平均高度(nm). 2.42±0.45. 0.43±0.18. 1.73±0.31. 21. AFM.

(35) 3.3 鐵蛋白之導電模組(C-AFM)影像分析此外，我們也以導電模組(Conductive-mode AFM，簡稱 C-AFM) 對 FT 進行結構分析，如圖 3-10。在此之前，我們先對 HOPG 與 FT 進行 I-V curve 分析，如圖 3-11，確定最佳偏壓為 0.5 V。由於在此電壓下，HOPG 基材的導電度較佳，而 FT 導電度較差，故可使 FT 順利成像。其直徑約為 17 nm。. A. C. B. D. 圖 3-10. (A) FT 與(B)空白 HOPG Contact mode AFM 影像及(C) FT (D). 空白 HOPG C-AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5Hz，施加偏壓 0.5V。. 22.

(36) 400. HOPG FT. Current (pA). 200. 0. -200. -400 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. Bias (V) 圖 3-11. HOPG 與 FT 的 I-V 曲線。掃瞄速度 0.5 Hz。. 23. 1.0.

(37) 3.4 蛋白質變性結構分析根據文獻報導(29)，蛋白質若與強酸、強鹼作用會因而變性。有鑒於此，我們便以 STM 與 AFM，分析經氫氧化鈉及鹽酸處理的 FT 其結構變化。實驗結果顯示：若將 FT 浸泡於 1 M NaOH 中不等時距，FT 結構中心會逐漸塌陷，如圖 3-12~3-15。而將 FT 浸泡於 1M HCl 中不等時距，FT 結構寬度逐漸增大、高度逐漸降低，如圖 3-16~3-19，並且 STM 與 AFM 結果一致。我們推論可能是鐵蛋白於酸鹼性環境下，鐵蛋白呈淨正、負電，增加胺基酸間斥力，而導致鐵蛋白形貌之變異。 (A). (B). (C). 圖 3-12 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 (A) 0；(B) 15；(C) 20 min 所得之 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 24.

(38) 24 23. (A). Width (nm). 22 21 20 19 18 17 16 15 14 0. 5. 10. 15. 20. 15. 20. Time (min). (B). Height (nm). 0.6. 0.5. 0.4. 0.3. 0.2 0. 5. 10. Time (min) 圖 3-13 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 0； 15； 20 min 所得 STM 影像之(A)寬度(B)高度分析。. 25.

(39) (A). 圖 3-14. (B). (C). (D). FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 (A) 0；(B) 5；(C) 15；(D) 20 min. 所得之 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 26.

(40) 30. (A). Width (nm). 28 26 24 22 20 18 0. 5. 10. 15. 20. 15. 20. Time (min) 3.0. (B). Height (nm). 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0. 5. 10. Time (min) 圖 3-15 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 0； 5； 15；20 min 所得 AFM 影像之(A)寬度(B)高度分析。. 27.

(41) (A). (B). (C). 圖 3-16 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 (A) 0；(B) 10；(C) 20 min 所得之 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 28.

(42) 22 21. (A). Width (nm). 20 19 18 17 16 15 14 13 0. 5. 10. 15. 20. 15. 20. Time (min). (B). Height (nm). 0.4. 0.2. 0.0 0. 5. 10. Time (min) 圖 3-17 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 0；10；20 min 所得 STM 影像之(A)寬度(B)高度分析。. 29.

(43) (A). (B). (C). 圖 3-18 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 (A) 0；(B) 10；(C) 20 min 所得之 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 30.

(44) 21. (A). Width (nm). 20 19 18 17 16 15 0. 5. 10. 15. 20. Time (min) 2.2. (B). Height (nm). 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 0. 5. 10. 15. 20. Time (min) 圖 3-19 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 0；10；20 min 所得 AFM 影像之(A)寬度(B)高度分析。. 31.

(45) 第四章結論 1. 根據 STM 與 AFM 分析，我們發現鐵蛋白經氫氧化鈉處理的 FT 其寬度變寬、高度變低、並且中心會逐漸塌陷，而鐵蛋白經鹽酸溶液處理前後其寬度變寬、高度變低，但中心無逐漸塌陷之傾向。 2. 我們由 FT 於液相 STM、氣相 STM 與 AFM 所得影像分析之，發現 FT 高度以液相 STM 最高，寬度則以 AFM 最寬。. 32.

(46) 第五章未來展望 1. 以 Circular Dichroism(CD)探討鐵蛋白浸泡於 NaOH、HCl 溶液中隨時間變化的二級結構變異分析。 2. 以 C-AFM 技術探討鐵蛋白浸泡於 NaOH、HCl 溶液中隨時間變化的導電差異情形，分析鐵蛋白電子傳遞行為之影響情形。 3. 以 STM 技術探討 A. 鐵蛋白於其他環境的表面形貌結構變異分析。 B. 缺鐵鐵蛋白形貌與酸鹼環境中的表面形貌結構變異分析，並比較鐵蛋白之分析結果。 C. 其他蛋白質形貌與酸鹼環境中的表面形貌結構變異分析。. 33.

(47) 參考文獻 1. 何如紘，國立臺灣師範大學化學系碩士論文，2010，原子力顯微鏡場效應鐵蛋白影像分析。 2. 陳俞宏，國立臺灣師範大學化學系碩士論文，2011，磁性模組原子力顯微鏡掃瞄技術對磁性微粒影像分析之探討。 3. 張家偉，國立臺灣師範大學化學系碩士論文，2012，原子力顯微術應用：鐵蛋白結構變異分析。 4. P. M. Harrison; P. Arosio, Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1275, 161. 5. W. Wang; M. A. Knovich; L. G. Coffman; F. M. Torti; S. V. Torti, Biochim. Biophys. Acta. 2010, 1800, 760. 6. M. A. Knovich; J. A. Storey; L. G. Coffman; S. V. Torti; F. M. Torti, Blood Rev. 2009, 23, 95. 7. S. Ohnishi; M. Hara; T. Furuno; H. Sasabe, Biophys. J. 1992, 63, 1425. 8. S. Ohnishi; M. Hara; T. Furuno; T. Okada; H. Sasabe, Biophys. J. 1993, 65, 573. 9. A. Perrin; V. Lanet; A. Theretz, Langmuir. 1997, 13, 2557. 10. D. Xu; G. D. Watt; J. N. Harb; R. C. Davis, Nano Lett. 2005, 5, 571. 11. D. N. Axford; J. J. Davis, Nanotechnology. 2007, 18, 145502. 12. T. Rakshit; S. Banerjee; R. Mukhopadhyay, Langmuir. 2010, 26, 16005. 13. A. Mosca; R. Paleari; P. Arosio; A. Cricenti; M. A. Scarselli; R. Generosi; S. Selci; E. Rovida, J. Vac. Sci. Technol. 1994, 12, 1486. 14. C. Baier; U. Stimming, Angew. Chem. 2009, 48, 5542. 15. C.W. Hsieh; B. Zheng; S. Hsieh, Chem. Commun. 2010, 46, 1655. 16. F. Caruso; D. N. Furlong; P. Kingshott, J. Colloid. Interface. Sci. 1997, 186, 129. 17. E. Manning; S. T. Yau, J. Vac. Sci. Technol. 2005, 23, 2309 18. J. M. Domínguez-Vera; L. Welte; N. Gálvez; B. Fernández; J. Gómez-Herrero; F. Zamora, Nanotechnology. 2008, 19, 025302. 19. M. Tominaga; K. Soejima; M. Matsumoto; I. Taniguchi, J. Electroanal. 34.

(48) Chem. 2005, 579, 51. 20. A. G. Hemmersam; K. Rechendorff; F. Besenbacher; B. Kasemo; D. S. Sutherland, J. Phys. Chem. C. 2008, 112, 4180. 21. M. Preisinger; M. Krispin; T. Rudolf; S. Horn; D. R. Strongin, Phys. Rev. 2005, 71, 165409. 22. R. V. Martinez; M. Chiesa; R. Garcia, Small. 2011, 7, 2914. 23. B. J. Kim; Y. KO; J. H. Cho; J. Cho, Small. 2013, 9, 3784. 24. 黃祥盈，國立臺灣師範大學化學系碩士論文，2009，類黃核素修飾電極製備及其與蛋白質間的交互作用探討。 25. H. Rafii-Tabar, Computational Physics of Carbon Nanotubes Cambridge University Press, New York, 2008. 26. Q. Chi; J. Zhang; J. U. Nielsen; I. Friis; E. P. Chorkendorff; G. W. Canters; J. E. T. Andersen; J. J. Ulstrup, Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4047. 27. D. Alliata; L. Andolfi; S. Cannistraro, Ultramicroscopy. 2004, 101, 231.. 35.

(49) 附錄. 圖 3-20 ITO 的 STM 影像。掃瞄範圍為 500 nm × 500 nm，掃瞄速度 512 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 36.

(50) (A). (B). 圖 3-21 氣相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 37.




(54) (A). (B). 圖 3-25 液相下所得的 FT 剖面(A)寬度；(B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 20 nm × 20 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 5.6 nA。. 41.



(57) (A). (B). 圖 3-28 FT 的 AFM 剖面(A)寬度；(B)高度影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 44.

(58) (A). (B). 圖 3-29 FT 的剖面(A)寬度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄範圍為 30 nm × 30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 45.




(62) (A). (B). 圖 3-33 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 15 min 所得之剖面(A)寬度； (B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 49.

(63) (A). (B). 圖 3-34 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度； (B)高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 50.

(64) (A). 圖 3-35. (B). FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 5 min 所得之所得之剖面(A)寬. 度；(B)高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 51.

(65) (A). (B). 圖 3-36 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 15 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 52.

(66) (A). (B). 圖 3-37 FT 浸泡於 1 M NaOH 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 53.

(67) (A). (B). 圖 3-38 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 10 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 54.

(68) (A). (B). 圖 3-39 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 STM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 5 Hz，穿隧偏壓 100 mV，穿隧電流 2.7 nA。. 55.

(69) (A). (B). 圖 3-40 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 10 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 56.

(70) (A). (B). 圖 3-41 FT 浸泡於 1 M HCl 中維持 20 min 所得之剖面(A)寬度；(B) 高度 AFM 影像。掃瞄範圍為 30 nm×30 nm，掃瞄速度 0.5 Hz。. 57.

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