日本鰻魚紅體與卵巢組織在發育過程中其PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)Homolog和EDF-1(Endothelial differentiation-related factor-1)表現與影響其表現因子之研究
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(2) 致謝 首先要感謝恩師 黃永森博士，不時的討論和指點實驗的方向，以及 待人處事與研究教學上之教導使我獲益匪淺，使我得以兩年內順利完成 本論文。本論文的完成另外亦得感謝林園養殖業盧尚賦、東港水產試驗 所的李彥宏和國立高雄海洋科技大學的鄭絢如老師的協助，陳嘉妍老師 在硬體及軟體上支援；以及口試委員施能朗老師、戴明泓老師在百忙中 撥冗審查我的論文，給予我許多的意見並細心的指正，使我的論文能更 加的完善。在研究所求學的過程中，感謝各位同學的陪伴、分享，寫下 許多屬於我們美好的回憶。感謝雅婷、詩婷和子齡，在我情緒低落時， 給我關懷與支持；感謝逸帆和智升學長不厭其煩的指導我研究中的缺 失，且總能在我迷惘時為我解惑，也感謝實驗室的學弟妹，媛婷、柏毅、 小歐、家緯、仕成、韋勝、怡瑋、蒨儀、重融，彼此幫忙及勉勵。 最後，要感謝我的父母親，因為有他們的支持與鼓勵，讓我在求學 生涯無後顧之憂，得以順利完成研究所碩士學位，兩年來，感謝大家的 支持與幫忙，點點滴滴，永在我心，謹以此成果，獻給我的師長、家人、 同學及朋友，謝謝您們！.
(3) 目 錄 頁次 目錄....................................................................................................................... Ι 圖目錄................................................................................................................ IX 表目錄..............................................................................................................XIΙI 中文摘要...............................................................................................................1 英文摘要...............................................................................................................4 第一章 前言.........................................................................................................7 1.1 PTEN(PHOSPHATASE AND TENSIN HOMOLOGUE DELETED ON CHROMOSOME 10) ..............................................................................................7. 1.1.1 PTEN (PHOSPHATASE AND TENSIN HOMOLOGUE DELETED ON CHROMOSOME 10)的發現 ..................................................................................7. 1.1.2 PTEN 的分子結構功能 ...........................................................................7 1.1.3 PTEN 的生理功能 ...................................................................................9 1.1.3.1 腫瘤(癌症) ............................................................................................9 1.1.3.2 細胞大小 ...............................................................................................9 1.1.3.3 核內作用 .............................................................................................10 1.1.3.4 血管新生 .............................................................................................11 1.2 EDF-1（ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION-RELATED FACTOR-1）..............11 1.2.1 EDF-1（ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION-RELATED FACTOR-1）的 發現 .................................................................................................................11. I.
(4) 1.2.2 EDF-1 的分子結構功能 ........................................................................12 1.2.3 EDF-1 的功能 ........................................................................................12 1.3 PTEN 和 EDF-1 在鰻魚的研究現況 .......................................................14 1.3.1 PTEN 在鰻魚的研究現況 .....................................................................14 1.3.2 EDF-1 的功能在卵巢發育與血管新生（ANGIOGENESIS）的關係 .........................................................................................................................14 1.3.3 EDF-1 的可能功能 ................................................................................15 1.4 目的 ...........................................................................................................15. 第二章 材料與方法 ..........................................................................................18 2.1 試藥 ...........................................................................................................18 2.2 基因選殖 ...................................................................................................18 2.2.1 EDF-1 基因之選殖 ................................................................................18 2.2.2 EDF-1 5’RACE ......................................................................................20 2.2.3 EDF-1 3’RACE ......................................................................................21 2.3 活體實驗 ...................................................................................................22 2.3.1 日本鰻(ANGUILLA JAPONICA)來源與馴養環境 ......................................22 2.3.2 活體外源激素製備................................................................................22 2.3.2.1 鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE) ....................22 2.3.2.2 睪固酮(Testosterone)..........................................................................22 2.3.3 活體外源激素處理 ................................................................................22 2.3.4 GSI 0/0和RMI 0/00的測量.......................................................................23 II.
(5) 2.3.5 組織全 RNA 的抽取 .............................................................................23 2.4 離體實驗...................................................................................................24 2.4.1 細胞樣品................................................................................................24 2.4.2 紅體細胞的取得....................................................................................24 2.4.3 眼球細胞的取得....................................................................................25 2.4.4 眼睛細胞繼代培養................................................................................26 2.4.5 離體外源激素處理................................................................................26 2.4.6 細胞全 RNA 抽取 .................................................................................27 2.5 cDNA 的製備 ...........................................................................................27 2.6 RT-PCR(REVERSE TRANSCRIPTASE PCR)分析表現量...............................28 2.7 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色的製備...............................29 2.7.1 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之固定液的製備 ...........29 2.7.2 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之脫水至石蠟包埋 的製備.............................................................................................................29 2.7.3 石蠟切片................................................................................................30 2.8 切片染色...................................................................................................30 2.8.1 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之蘇木精伊紅染色 .......30 2.8.2 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之免疫組織化學染 色.....................................................................................................................31 2.9 細胞免疫染色...........................................................................................33 2.9.1 細胞免疫染色之製備............................................................................33 2.9.2 細胞免疫染色藥劑配置之製備 ...........................................................34 2.10 統計方法.................................................................................................35 III.
(6) 第三章. 結果.....................................................................................................36. 3.1 EDF-1 基因選殖結果分析.......................................................................36 3.2 基因表現分析最適當的 RT-PCR 反應週期數 .......................................36 3.3 日本鰻器官組織分佈與 PTEN LONG、PTEN SHORT 和 EDF-1 表現 量之關係 .........................................................................................................36 3.4 不同體重大小的養殖日本鰻其紅體與 PTEN 和 EDF-1 基因的關 係 .....................................................................................................................37 3.5 雌鰻以外源激素進行催熟過程中與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係......37 3.5.1 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的紅體組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係....................................................................................38 3.5.2 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的卵巢組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係....................................................................................38 3.5.3 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體萃取液和鯰魚腦下垂體+睪固酮之混 合液進行催熟過程中的紅體組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係............39 3.5.4 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體萃取液和鯰魚腦下垂體+睪固酮之混 合液進行催熟過程中的卵巢組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係............39 3.6 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢和紅體組織之切片染色.......40 3.6.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之切片染色................41 3.6.1.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之 HE 染色 .............41 3.6.1.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之 IHC 染色............41 3.6.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之切片染色................42 3.6.2.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之 HE 染色 .............42 3.6.2.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組職之 IHC 染色............42 IV.
(7) 3.7 分析長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化 .............................43 3.8 與 DMSO 作用的關係 .............................................................................44 3.8.1 分析 DMSO 與 PTEN、EDF-1 表現量的關係 ...................................44 3.8.2 PPAR AGONISTS 與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關係 .........................................................................................................................44 3.9 與 PPAR AGONISTS 作用的關係 ...............................................................45 3.9.1 分析 PPAR AGONISTS 與 PTEN、EDF-1 表現量的關係 .....................45 3.9.2 PPAR AGONISTS 與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關係 .........................................................................................................................45 3.10 與內皮細胞生長補充劑作用的關係.....................................................46 3.10.1 分析內皮細胞生長補充劑與 PTEN、EDF-1 表現量的關係...........46 3.10.2 內皮細胞生長補充劑與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現 的關係 .............................................................................................................47 3.11 與生長因子(IGF-1)作用的關係.............................................................47 3.11.1 分析生長因子(IGF-1)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係 ..................47 3.11.2 生長因子(IGF-1)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關 係 .....................................................................................................................48 3.12 與生長因子(胰島素,INSULIN)作用的關係 ............................................48 3.12.1 分析生長因子(胰島素,INSULIN)與 PTEN、EDF-1 表現量的關 係 .....................................................................................................................48 3.12.2 生長因子(胰島素,INSULIN)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光 表現的關係 .....................................................................................................48 3.13 與生長因子(BFGF)作用的關係.............................................................49 V.
(8) 3.13.1 分析生長因子(BFGF)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係...................49 3.13.2 生長因子(BFGF)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關 係 .....................................................................................................................49 3.14 與類固醇(睪固酮,TESTOSTERONE,T)作用的關係 .................................49 3.14.1 分析類固醇(睪固酮,TESTOSTERONE,T)與 PTEN、EDF-1 表現 量的關係 .........................................................................................................49 3.14.2 類固醇(睪固酮,TESTOSTERONE,T)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關係 ..................................................................................50. 3.15 與類固醇(雌性素,ESTRADIOL,E2)作用的關係......................................50 3.15.1 分析類固醇(雌性素,ESTRADIOL,E2)與 PTEN、EDF-1 表現量的 關係 .................................................................................................................50 3.15.2 類固醇(雌性素,ESTRADIOL,E2)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關係 .............................................................................................51 3.16 與類固醇(黃體激素,PROGESTERONE,P4)作用的關係...........................51 3.16.1 分析類固醇(黃體激素,PROGESTERONE,P4)與 PTEN、EDF-1 表 現量的關係 .....................................................................................................51 3.16.2 類固醇(黃體激素,PROGESTERONE,P4)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關係 ..................................................................................52. 3.17 與離子(硫化鋅,ZN)作用的關係 ............................................................52 3.17.1 分析離子(硫化鋅,ZN)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係 ..................52 3.17.2 離子(硫化鋅,ZN)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的關 係 .....................................................................................................................52 3.18 與離子(氯化鈷,COCL2)作用的關係 ......................................................53 VI.
(9) 3.18.1 分析離子(氯化鈷,COCL2)與PTEN、EDF-1 表現量的關係 .............53 3.18.2 離子(氯化鈷,COCL2)與PTEN LONG和PTEN SHORT螢光表現的 關係 .................................................................................................................53 3.19 與離子(硫化銅,CU2+)作用的關係..........................................................54 3.19.1 分析離子(硫化銅,CU2+)與PTEN、EDF-1 表現量的關係 ................54 3.19.2 離子(硫化銅,CU2+)與PTEN LONG和PTEN SHORT螢光表現的關 係 .....................................................................................................................54 3.20 與離子(硫酸亞鐵,FE)作用的關係 .........................................................55 3.20.1 分析離子(硫酸亞鐵,FE)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係...............55 3.20.2 離子(硫酸亞鐵,FE)與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的 關係 .................................................................................................................55. 第四章 討論.......................................................................................................56 4.1 日本鰻 EDF-1 基因..................................................................................56 4.2 日本鰻器官組織分佈與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 表現量之關係 .........................................................................................................................56 4.3 不同體重大小的養殖日本鰻其紅體與 PTEN 和 EDF-1 基因的關 係 .....................................................................................................................57 4.4 雌鰻以外源激素進行催熟過程中與 PTEN 和 EDF-1 的關係 .............57 4.5 長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化 .....................................60 4.6 PTEN LONG 與 PTEN SHORT 之差異性....................................................61 4.7 DMSO 與 PTEN 以及 EDF-1 表現量的關係 .........................................62 4.8 PPAR AGONISTS 與 PTEN 以及 EDF-1 表現量的關係 ..........................62 VII.
(10) 4.9 與生長因子作用的關係 ...........................................................................64 4.10 與類固醇作用的關係 .............................................................................67 4.11 與離子作用的關係 .................................................................................69 4.12 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 的調控比較..............................................72 第五章 結論.......................................................................................................74 第六章 圖表.......................................................................................................75 第七章 參考文獻 ........................................................................................... 123. VIII.
(11) 圖. 目. 錄. 圖-1. 哺乳動物 PTEN 分子結構.................................................................75. 圖-2. 日本鰻 PTEN 基因 .............................................................................76. 圖-3. 日本鰻 EDF-1 mRNA 序列 ...............................................................77. 圖-4. 日本鰻 EDF-1 的胺基酸序列比對....................................................78. 圖-5. EDF-1 物種親緣性樹狀圖.................................................................79. 圖-6. 基因表現分析最適當的 RT-PCR 反應週期數 .................................80. 圖-7. 日本鰻器官組織分佈與 PTEN long、PTEN short 和 EDF-1 表. 現量之關係 .....................................................................................................81 圖-8. 自然發育且不同體重大小的鰻魚其紅體與 PTEN 和 EDF-1. 基因的相關性 .................................................................................................82 圖-9. 雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的紅體組織與 PTEN 和. EDF-1 基因的關係 .........................................................................................83 圖-10 雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的卵巢組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係....................................................................................84 圖-11 雌鰻以鯰魚腦下垂體萃取液和鯰魚腦下垂體+睪固酮之混合 液進行催熟過程中的卵巢和紅體組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的關係 .........................................................................................................................85 圖-12 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之切片染色 ............86 圖-13 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之切片染色 ............87 圖-14 長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化...............................88 圖-15 離體培養條件之建立與 PTEN、EDF-1 表現量之關係 .................89 IX.
(12) 圖-16 離體培養條件之建立-PBS and DMSO 與 PTEN、EDF-1 表現 量的關係 .........................................................................................................90 圖-17 離體培養條件之建立與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強 度的關係 .........................................................................................................91 圖-18 分析 PPAR agonists 與 PTEN 、EDF-1 mRNA 表現量的關係 .........................................................................................................................92 圖-19 PPAR agonists 與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的 關係 .................................................................................................................93 圖-20 分析內皮細胞生長補充劑(ECGs,Endothelial Cell Growth supplement)與 PTEN 、EDF-1 mRNA 表現量的關係 ...............................94 圖-21 內皮細胞生長補充劑(ECGs,Endothelial Cell Growth supplement)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的關係..................95 圖-22 分析生長因子(IGF-1)與 PTEN、EDF-1 mRNA 表現量的關係 .........................................................................................................................96 圖-23 生長因子(IGF-1)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的 關係 .................................................................................................................97 圖-24 分析胰島素(Insulin)與 PTEN 、EDF-1 mRNA 表現量的關係 .........................................................................................................................98 圖-25 胰島素(Insulin)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的 關係 .................................................................................................................99 圖-26 分析生長因子(bFGF)與 PTEN 、EDF-1 mRNA 表現量............ 100 圖-27 鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的關係 .................................................................................. 101 X.
(13) 圖-28 分析類固醇（睪固酮,Testosterone)與 PTEN、EDF-1 表現量 的關係 .......................................................................................................... 102 圖-29 類固醇（睪固酮,Testosterone)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反應強度的關係 .................................................................................. 103 圖-30 分析類固醇(雌性素,Estradiol)與 PTEN、EDF-1 表現量的關 係 .................................................................................................................. 104 圖-31 類固醇(雌性素,Estradiol)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反 應強度的關係 .............................................................................................. 105 圖-32 分析類固醇(黃體激素,Progesterone)與 PTEN、EDF-1 表現量 的關係 .......................................................................................................... 106 圖-33 類固醇(黃體激素,Progesterone)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反應強度的關係 .................................................................................. 107 圖-34 分析離子(硫化鋅,Zn)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係 ............. 108 圖-35 離子(硫化鋅,Zn)作用 12 小時與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反應強度的關係 .................................................................................. 109 圖-36 離子(硫化鋅,Zn)作用 3 天與 PTEN long 和 PTEN short 免疫 反應強度的關係 ...........................................................................................110 圖-37 分析離子(氯化鈷,CoCl2)與PTEN、EDF-1 表現量的關係..........111 圖-38 離子(氯化鈷,CoCl2)作用 12 小時與PTEN long和PTEN short 免疫反應強度的關係 ...................................................................................112 圖-39 離子(氯化鈷,CoCl2)作用 3 天與PTEN long和PTEN short免疫 反應強度的關係 ...........................................................................................113 圖-40 分析離子(硫化銅,Cu2+)與PTEN、EDF-1 表現量的關係 ............114 XI.
(14) 圖-41 離子(硫化銅,Cu2+)作用 12 小時與PTEN long和PTEN short免 疫反應強度的關係 .......................................................................................115 圖-42 離子(硫化銅,Cu2+)作用 3 天與PTEN long和PTEN short免疫 反應強度的關係 ...........................................................................................116 圖-43 分析離子(硫酸亞鐵,Fe)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係............117 圖-44 離子(硫酸亞鐵,Fe)作用三天時與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反應強度的關係 ...................................................................................118. XII.
(15) 表. 目. 錄. 表-1 不同體型大小之養殖鰻與 PTEN 和 EDF-1 基因表現量關係 .......119 表-2. 催熟雌鰻之紅體發育與 PTEN 基因表現量、PTEN 免疫染色. 反應和 EDF-1 基因表現量關係................................................................. 120 表-3. 催熟雌鰻之卵巢發育與 PTEN 基因表現量、PTEN 免疫染色. 反應和 EDF-1 基因表現量關係................................................................. 121 表-4. 鰻魚紅體細胞與 PTEN 基因表現量、PTEN 免疫染色反應和. EDF-1 基因表現量關係.............................................................................. 122. XIII.
(16) 日本鰻魚紅體與卵巢組織在發育過程中其 PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)Homolog 和 EDF-1(Endothelial differentiation-related factor-1)表現與影響其表現因子 之研究. 指導教授：黃永森博士 國立高雄大學生命科學系. 學生：陳雅玫 國立高雄大學生物科技所. 摘要. PTEN (phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome 10，亦稱 MMAC1 or TEP1)為一種磷酸酶，擷抗磷脂酰肌醇激酶（PI3K；phosphoinositide 3-kinase）所 引起的生理活性。內皮分化因子(Endothlial differentiating-related Factor-1；EDF-1)， 其與血管內皮細胞分化相關。 我們選殖日本鰻的 EDF-1 基因序列，並探討鰻魚在發育過程中紅體和卵巢 PTEN long、PTEN short 和 EDF-1 基因的表現。在不同體型的養殖鰻之紅體發育(RMI 值) 會隨著其體重增加而增加。而 PTEN 和 EDF-1mRNA 表現量會隨著其紅體發育(RMI 值)增加而增加表現量的趨勢。催熟過程中，對於調控 PTEN 的作用不同，當紅體(RMI. -1-.
(17) 値)組織發育，其 PTEN mRNA 表現量和蛋白質都會增加，而當卵巢(GSI 値)發育， PTEN long 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育成負相關，但是 PTEN short 基因表現 量與卵巢組織(GSI 値)發育的相關性較不一致，而 PTEN 蛋白質會受到抑制。而當組 織不發育時，會減少 EDF-1 mRA 表現量，組織發育時，則會增加 EDF-1 mRA 表現 量。而添加睪固酮會抑制 PTEN 和 EDF-1 表現量，但會增加 PTEN 蛋白質免疫反應。 我們推測添加睪固酮之混合液進行催熟，會抑制 PTEN 和 EDF-1 基因表現量，使得 卵巢發育不會受到抑制。 離體(in vitro)實驗中，長期培養紅體細胞，對於PTEN基因而言似乎約 2~3 週就 會有一個週期性的波動，而EDF-1 表現量維持恆定。我們以PPAR agonists、生長因子、 類固醇和金屬離子處理紅體細胞，並進一步觀察PTEN long與PTEN short的基因表現 和蛋白質調控以及EDF-1 基因表現量是否具有相關性。在PPAR agonists(α、β/δ、γ) 刺激作用下，會增加PTEN基因和蛋白質與EDF-1 基因表現量。ECGs會抑制PTEN基 因表現，但會增加EDF-1 表現量。IGF-1 劑量為 10-7M時，會明顯增加PTEN long免疫 染色反應強度。Insulin會增加PTEN long基因表現量。類固醇(T、E2、P4)會增加PTEN 和EDF-1 基因表現量，並且T、P4 會增加PTEN long免疫染色反應的強度。Zn長時間 作用下，會抑制PTEN long免疫反應強度。CoCl2長時間作用下，會增加PTEN和EDF-1 表現量。Cu2+長時間作用下，會增加PTEN表現量，但會抑制PTEN long免疫反應的強 度。另外，免疫染色反應結果顯示，PTEN long蛋白質會在紅體細胞的細胞核周圍表 現，我們推測可能是在高爾基氏體表現，而PTEN short在紅體細胞的免疫反應比較沒 有專一性，似乎會在全細胞中都有表現。 總合以上結果，在鰻魚的紅體細胞中，PTEN long 和 PTEN short 的作用不同， 而且我們推測 PTEN long 與 PI3K 訊號傳遞路徑相關。而 PTEN short 的表現都沒有太. -2-.
(18) 大差異，我們推測 PTEN short 的功能似乎與染色體穩定性、DNA 修復、細胞週期停 止和細胞內穩定性相關。而 EDF-1 基因會受到生長因子、類固醇和二價離子所調控。. 關鍵字：紅體發育指數、卵巢發育指數、睪固酮、過氧化體增殖劑活化受器、生長 因子補充劑、類胰島素生長因子、胰島素增敏劑、鹼性纖維母細胞. -3-.
(19) Investigation of PTEN Homolog and EDF-1expression inJapanese eel(Anguilla japonica)rete mirabile and ovary tissues during development and the possible regulation studies. Advisor:Dr. Huang , Yung-Sen Department of life Science National University of Kaohsiung. Student：Chen, Ya-Mai Institure of Biotechnology National University of Kaohsiung. ABSTRACT PTEN (phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome 10, also called MMAC1 or TEP1) is a phosphatase ， PTEN against the bioactivity provoked by PI3K (phosphoinositide 3-kinase). EDF-1 (Endothelial differentiating-related Factor-1) is a transcriptional factor involved into angiogenesis and the differentiation of vascular endothelial cells. Used Japanese as the model, EDF-1 and two forms of PTEN genes have been cloned, we investigated the gene expression profiles in the gas glands as well as the ovary during the development of eel. The increase of RMI (rete mirabile index) was positive with the increase of body weight, the expression levels of both PTEN and EDF-1. -4-.
(20) were also increased with the increase of RMI. In the eels stimulated by catfish pituitary extracts, the tissue masses were also promoted, the expression levels as well as cellular proteins content was increased, the expression levels of PTEN-long form was decreased with increase of GSI (gonadal somatic index), while there was no correlation between GSI and the expression levels of PTEN-short form, the samples with higher PTEN-short form expression levels had the lower cellular proteins content. The expression levels of EDF-1 were increased in the developing ovary while the expression levels of EDF-1 were decreased in the non-hyperplasia tissue. The supplement of testosterone (T) decreased the expression levels of both PTEN as well as EDF-1, but the cellular proteins content of those were increased, it seemed that CPE supplement with T inhibited the expression levels of both PTEN and EDF-1 leaded the ovarian development. In vitro experiments showed that there was a fluctuation on the expression levels of PTEN for every 2-3 weeks to the long-term primary culture of gas glands cells as long as 8 weeks, this result was not observed in EDF-1. The primary culture of gas glands cells was treated with PPAR agonists, growth factors, steroids, and metal ions to see their effects on the different gene expression levels as well as correlation on gene expression and cellular proteins content. The PTEN production and EDF-1 expression levels were stimulated by PPAR agonists (α、β/δ、γ); 。ECGs inhibited the expression levels of PTEN but increased those of EDF-1. 10-7 M of IGF-1 increased cellular proteins content of PTEN-long; Insulin stimulated the expression of PTEN-long form. Steroids (T、E2、P4) stimulated the expression levels of PTEN and EDF-1, and the cellular proteins content of PTEN-long form was increased by T and P4. the production of PTEN-long form was effected by Zn, Co, and Cu. Our cellular. -5-.
(21) immunofluorescence staining showed that The PTEN-long form had a strong staining intensity around the nuclear, this area is presumed the Golgi apparatus, while the immuno-staining on PTEN-short form was more ubiquitous and widely distributed. In summary, from our data, we speculated that the physiological functions of PTEN-long and PTEN-short form are different; PTEN-long form seems to involve in the PI3K signal transduction pathway; the expression levels of PTEN-short were not effected by various treatments. Growth factors, steroids, and metal ions regulates the expression of EDF-1.. KEY WORDS：PTEN、PI3K、EDF-1、gas glands、GSI、steroids、PPAR、endothelial cells、IGF-1、insulin、bFGF. -6-.
(22) ㄧ、前言 1.1 PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10) 1.1.1 PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10)的發現 在多種人類晚期腫瘤中，發現染色體10q23的雜合性缺失（loss of heterozygosity；LOH），且在老鼠實驗中發現染色體10q23能抑制膠質母 細胞瘤(glioblastoma multiforme)的形成，暗示著此段10q23 可能存在腫瘤 抑制基因(Hsu et al., 1996)。於是在1997年，Li 等人利用表現差異分析法 （representational difference analysis, RDA) 在乳癌的兩個移植瘤中發現 了10q23 染色體特定區域的雜合性缺失，並透過外顯子俘獲分析法 （exon trap analysis）分離出一種新的基因，對其開放閱讀框架（open read reading frame；ORF） 序列分析顯示了它可能編碼蛋白質酪氨酸磷酸酶 （protein tyrosine phosphatase；PTP），且與張力蛋白(tensin) 有大片同源 區， 因此將其命名為 PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10）(Li et al., 1997)。. 1.1.2 PTEN 的分子結構功能 Phosphatidylinositols(Ptdlns)是一種磷酸酯質，由磷酸甘油酯 (phosphoglyceride)和肌醇環 (inositol ring)上的羥基(OH,hydroxyl group) 脂化而成，而脂質激酶和去磷酸酶分別會將肌醇環 (inositol ring)進行磷 酸化以及去磷酸化(Tolias et al., 1999；Oudit et al., 2004)。. -7-.
(23) Phosphatidylinositol-4-5-phosphate [Ptdlns(4,5)P2,PIP2]主要是 Ptdlns-3-4-5P3(PIP3)的前驅物，而 Ptdlns(3,4,5)P3 的生物合成是經由活化 class I PI3K 路徑訊號(Foster et al., 2003；Wymann et al., 2003)。PI3K 和 PTEN 最先調控 PIP3 和 Ptdlns(4,5)P2，再依次選擇目標基因傳遞和經由 選擇區域的結合，使得許多下游基因活化，例如:pleckstrin homology(PH) domain （Oudit et al, 2004） 。PTEN 為 3’脂質磷酸酶，亦是 mutated in multiple advanced cancer(MMAC1)和 TGFβ-regulated and epithhelial cell-enriched phosphatase(TEP1)( Leslie et al, 2002)。哺乳類動物 PTEN 蛋白包含兩個主 要的功能區域︰N 端去磷酸酶結構和 C 端 C2 結構，而去磷酸酶結構由 前端一個 PIP2 的結合區和磷酸酶活性區域(phosphatase)組成，C2 結構由 C2 區域和在 C 端未端 PSD-95/DIg/ZO-1(PDZ)區域所組成 (圖 1) (Leslie et al, 2002)。PTEN C2 功能區在其蛋白質穩固和催化反應位的生產取向扮 演重要的角色。另外，發現 PTEN C2 功能區蛋白能抑制細胞的遷移能 力，而不是依賴其脂質磷酸酶區域(Raftopoulou et al., 2004)。 PTEN 蛋白 除與上述的功能區外，其 N 端還與兩種細胞質蛋白同源， 即肌力蛋白 (Auxilin) 和張力蛋白(tensin)。前者與突觸小泡的運輸有關，後者為一種 細胞骨架蛋白，在細胞聚集黏著時， 與肌力蛋白 (Auxilin)一起形成複合 物，包含聚集粘連激脢 (focal adhesion kinase, FAK)、生長因子受體和整 合素 (integrin)等，其中整合素 (integrin)不但與細胞生長調節有關，也與 腫瘤的侵襲轉移及血管發生有關 (Tamura et al., 1998)。在 PTEN 蛋白 C 端序列上，含有一個三氨基酸的 C 末端區域（TKV-COOH），可與含有 PDZ 結構域的蛋白質結合，PDZ 結構域通常與多蛋白複合體的組裝相. -8-.
(24) 關。所以，儘管這幾個氨基酸的突變並不會引起 PTEN 抑癌活性的改變， 其可能對 PTEN 在細胞內的定位及與其它蛋白的相互作用有關 (Nick and Peter, 2004)。人類許多組織型態中已證實在發育期間 PTEN 具有高度的 表現(Gimm et al., 2000)，且人類多種腫瘤中已被普遍發現 PTEN 的 C124S 和 G129E 兩個活性位發生突變，進而證實了 PTEN 為一腫瘤抑制子(Li et al., 1997; Steck et al., 1997; Lee et al., 1999)。. 1.1.3 PTEN的生理功能 1.1.3.1 腫瘤(癌症) PTEN是一種雙重性的磷酸酶，能對抗酪氨酸激酶和抑制腫瘤細胞入 侵和轉移(Gimm et al., 2000)，PTEN負調控PI3K/AKT訊息路徑進而抑制 腫瘤生長 (Stahl et al., 2003)。對小鼠而言，PTEN亦存在於胚胎組織，且 PTEN基因異型合子的突變會造成多種組織形成腫瘤(Podsypanina et al., 1999)。在胰臟腫瘤中發現PTEN經由PI3K/Akt/VEGF/eNOS路徑調控 VEGF訊號途徑和血管新生(Ma et al., 2009)。在人類腦腫瘤的內皮細胞 中，發現腫瘤抑制因子PTEN和p53扮演供同阻礙腫瘤發展(Su et al., 2003)。. 1.1.3.2 細胞大小 PTEN對於細胞週期、細胞生長、細胞遷移和凋亡扮演重要的角色(Gimm et al., 2000)。PTEN主要作用受質是PIP3，將PIP3去磷酸化後形成PIP2， 可抑制由PIP3-PI3K所啟動的訊息傳遞路徑 (Maehama and Dixon, 1998)。而表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子、. -9-.
(25) 類胰島素生長因子、胰島素 (Kishomoto et al., 2003; Hamada et al., 2005) 以及內皮細胞生長因子 (Olsson et al., 2006) 的作用皆有PI3K的參與。 PTEN影響PI3K/AKT訊息路徑所調控的下游反應包括細胞生長，遷移及 存活 (Thompson and Thompson, 2004)，而PTEN負調控此訊息路徑進而抑 制正常組織和細胞過度生長(Stahl et al., 2003)。在齧齒類動物及果蠅中， PTEN在調控細胞大小及生長上扮演重要的角色(Kishimoto et al., 2003; Goberdhan et al., 1999) 在果蠅眼球的發育期間，PTEN的去活性或過度表 現皆會影響細胞大小，增生以及凋亡的正常表現 (Huang et al., 1999)。小 鼠剔除PTEN基因將會造成胚胎死亡 (Podsypanina et al., 1999)。PTEN負 調控PI3K/Akt路徑，演化保守性途徑其訊號下游生長因子，包括胰島素 (Insulin)和胰島素生長因子(Insulin-like growth factor 1)。在低等生物，最 初經由神經細胞結構產生其路徑參與能量新陳代謝、身體大小調節和胰 島素蛋白；對於高等生物，PI3K路徑調控胰島素在組織生長和新陳代謝 還尚未清楚。而在老鼠實驗中發現經由胰島素啟動子驅使目標基因，使 得PTEN在調控身體大小和葡萄糖代謝上扮演重要的角色。另外，在老 鼠，將部分的PTEN剔除，發現全身生長會受限但會增加胰島素靈敏性， 且在下視丘和胰臟β細胞中發現會增加PI3K訊號途徑的作用。在活體實驗 顯示在胰島素轉錄細胞中，PTEN可能扮演協調生長和新陳代謝的角色 (Nquven et al., 2006)。. 1.1.3.3 核內作用 PTEN在細胞核和細胞質所扮演的角色不同，在細胞質中，PTEN的 作用與PI3K訊號傳遞路徑相關，而在細胞核中，PTEN的作用與染色體穩. - 10 -.
(26) 定性、DNA修復、細胞週期停止和細胞內穩定性相關(Planchon et al., 2008)。. 1.1.3.4 血管新生 血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在內皮 細胞分化和血管生成扮演重要的角色，且會經由PI3K訊號途徑調其表現 (Jiang et al., 2000)。VEGF與VEGF-R2結合，會促進PI3K途徑下游訊號磷 酸化，磷酸化C-γ1、Sre家族酪氨酸激酶和其他訊號途徑(Ferrara,2000； Thakker et al., 1999)。而AKT活化透過HDM2和p70S6K1會誘導VEGF和缺 氧誘導因子-1(HIF-1)表現，進而誘導血管新生(Jiang et al., 2008)。研究報 告證明PTEN/PI3K訊號路徑會調控正常的血管發育和腫瘤血管新生 (Hamada et al., 2005)。利用siRNA剔除法將PTEN作用於VEGF表現和調控 血管新生上，發現將PTEN剔除會增加VEGF分泌，調控血管內皮細胞增 殖和遷移，進而增加血管新生(Ma et al., 2009)。在鼠類大動脈環(arotery ring)微血管生長的體外測試，當PTEN 表現被抑制時有較長的微血管絲 生成，相反的，過度表現正常 PTEN 則會抑制內皮細胞增生、遷移以及 微血管絲生成 (Huang et al., 2002)。在斑馬魚胚胎發育期間，PTEN 基 因的剔除亦會導致 AKT 磷酸化表現量增加和促進正常的血管新生作用 (Croushore et al., 2005)。. 1.2 EDF-1（Endothelial differentiation-related factor-1） 1.2.1 EDF-1（Endothelial differentiation-related factor-1）的發 現. - 11 -.
(27) 內皮分化因子(Endothlial differentiating-related Factor-1；EDF-1)，亦 稱為 hMBF-1(multiprotein-bridging factor 1)(Kabe et al., 1999)。於 1998 年，在人類免疫缺乏病毒的 TAT 胜肽(HIV-TAT)感染內皮細胞，再以 RNA 指紋法鑑定因子差別表現，發現此新的基因與血管內皮細胞分化相關， 故命名為 Endothlial differentiating-related Factor-1；EDF-1 (Dragoni et al., 1998)。. 1.2.2 EDF-1 的分子結構功能 EDF-1 是一個低分子量的多胜肽，在內皮細胞中經由感染 HIV-1-Tat 或佛波醇脂 TPA(phorbol ester TPA)進而向下游調控內皮細胞分化 (Bernardini et al., 2005)。從酵母菌到人類其序列具有高度保留性，且在人 類的心臟和胰臟觀察到具高度表現(Kabe et al., 1999)。人類 EDF-1 功能與 家蠶(Bormbyx mori)的 MBF-1 為同源物種，其具有轉錄輔助活化因子的 功能，而且會經由此功能與 TATA 結合蛋白(TATA binding protein；TBP) 相互作用(Mariotti et al., 2000；Ballabio et al., 2004)。在人類和老鼠的 EDF-1 蛋白具有一段 IQ domain，約 20 個胺基酸，其中包含攜鈣素結合 區域和蛋白激酶 C (protein kinase C；PKC)的磷酸作用位，進而調節與攜 鈣素的結合(Rhoad et al., 1997)。. 1.2.3 EDF-1 的功能 HIV-TAT 會降低內皮細胞內 EDF-1 mRNA 的表現量，從而得知 EDF-1 在轉錄調控和血管新生之間的關係非常重要。EDF-1 轉譯後，其. - 12 -.
(28) 由蛋白激酶 C 和蛋白激酶 A 進行磷酸化作用，而造成細胞內表現位置和 蛋白質功能的不同 (Mariotti et al., 2000；Ballabio et al., 2004)。EDF-1 在 細胞質的角色為攜鈣素結合蛋白，而在細胞核為轉錄輔活化物(Ballabio et al., 2004)。EDF-1 在人類內皮細胞分化扮演重要的角色，當抑制 EDF-1 轉譯時，會抑制內皮細胞生長(Dragoni et al., 1998)以及在血管內皮細胞不 增殖的情況下，EDF-1 會向下游調控(Mariotti et al., 2000)，但不會影響其 他細胞種類生長(Bernardini et al.,2005)。當內皮細胞為靜止或衰老的狀況 時，將會使得 EDF-1 減少，而那是因為蛋白分解酶會將蛋白分解的緣故。 從老鼠衰老的微血管內皮細胞中發現 EDF-1 大部分在核表現(Bernardini et al., 2005)。當微血管內皮細胞於增殖的狀況下，EDF-1 會抑制內皮細胞 生長(Dragoni et al., 1998)，但當內皮細胞於衰老的時候，EDF-1 則會提供 新的分子參與血管新生之調控(Bernardini et al., 2005)。 利用免疫染色法發現hMBF-1會在細胞質中表現，但是當hMBF-1與 核蛋白Ad4BP/SF-1結合，則會在細胞核中表現(Kabe et al., 1999)。另外， MBF-1是一種核內受體的輔因子，會活化fushi tarazn factor 1(FTZ-F1)，而 FTZ-F1為核受器，其最早於果蠅中發現。MBF-1會刺激類固醇生成因子 -1(steroidogenic factor 1)轉錄活化，且人類同源染色體FTZ-F1也參與類固 醇生成。MBF-1會刺激增加非類固醇核內受體的轉錄活性，進而參與脂 質新陳代謝，例如肝受器同源染色體1(Liver Receptor Homolog 1)、肝X受 器α(Liver X receptor alpha)以及過氧物酶體增生劑活化受體γ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma；PPAR γ)(Brendel., 2002)。. - 13 -.
(29) 1.3 PTEN和EDF-1 在鰻魚的研究現況 1.3.1 PTEN 在鰻魚的研究現況 已選殖出兩種日本鰻 PTEN 的異構物 (PTEN Long- or Short-form Like)(圖二)。在離體實驗中，以生長因子 IGF-1 與胰島素增敏劑 Troglitazone 處理鰻魚細胞，結果顯示 IGF-1 會抑制細胞 PTEN 表現，而 Troglitazone 刺激 PTEN 表現量上升。在活體實驗中，觀察鰻魚正常成長 發育過程以及使用外源促性腺激素刺激的過程中，在卵巢組織中，PTEN 表現量與組織增長呈正相關，與 VEGF 表現量呈負相關，且卵巢生長質 量相對於 VEGF/PTEN 比值呈高度正相關。在紅體組織中，PTEN 表現 量與組織增長呈正相關，但 VEGF 在後期被抑制表現，然而，紅體組織 生長質量相對於 VEGF/PTEN 比值兩者間仍呈高度正相關。故推測 PTEN 似乎對組織發育增長有較顯著的影響(陳, 2007)。在斑馬魚中，有兩種 PTEN 異構物 (PTEN A 和 PTEN B)且各有兩種不同基因剪除形式 (Long 和 Short 形式)已被發表於 NCBI 資料庫，推測其分別在斑馬魚胚胎發育 形成的各類組織上有不同的調節功能(Croushore et al., 2005)。但對於兩種 日本鰻 PTEN 的異構物的作用結果為何？而在紅體細胞中，以 PPAR agonists(α、β/δ、γ)、生長因子(ECGs、bFGF 和 Insulin)、類固醇(睪固酮、 雌性素和助孕素)和離子(Zn、Co、Cu 和 Fe)作用情況下，對於兩種日本 鰻 PTEN 的異構物的調控為何？無論在活體或離體實驗中，對於兩種日 本鰻 PTEN 的異構物的基因表現或蛋白質表現，都需進一步的研究及探 討其功能角色及作用表現。. 1.3.2 EDF-1 的功能在卵巢發育與血管新生（angiogenesis）的關. - 14 -.
(30) 係 目前 EDF-1 的相關研究很少，在血管新生的相關研究更是少之又 少，只知其參與內皮細胞分化之調控。首先，選殖日本鰻 EDF-1 mRNA， 並分析其在活體實驗中，利用外源激素刺激催熟過程中，對於發育和血 管新生的關係，以及在離體實驗中，EDF-1 的表現量與其調控的關係。. 1.3.3 EDF-1 的可能功能 目前研究報告指出已知 EDF-1 與細胞分化相關，當細胞持續生長情 況下，其會抑制細胞分化。EDF-1 除了在細胞質的角色為攜鈣素結合蛋 白，而在細胞核為轉錄輔活化物。而且與調控類固醇賀爾蒙合成相關。 以及參與脂質代謝，其會增加核受體的轉錄活性。我們在活體實驗中， 以不同體重的養殖鰻以及施打外源激素催熟雌鰻，再進一步觀察其 mRNA 表現量之相關性。在離體實驗中，觀察長期培養紅體細胞，以及 以 PPAR agonists、生長因子、類固醇和離子作用於紅體細胞，再進一步 觀察其 mRNA 表現量之相關性。. 1.4 目的 鰻魚屬於鰻鱺科(Anguillidae)，鰻屬(Anguillus)，是一種非常特殊的 魚類，全世界總共有十八種。鰻魚因為奇特的生活史，一直以來對鰻魚 的生態都是個謎；台灣地區鰻魚的種類有四種，最常見者為日本鰻 ( Anguilla japonica) 及鱸鰻(A. marmorata)；鰻魚在演化上屬於原始脊椎 動物，其生長到不同時期時會有變態發生而改變外觀；跟鮭魚有著相反 的生活史，鰻魚會在河川中長大、成熟後洄游到海洋中產卵，一生只產. - 15 -.
(31) 一次卵，產卵之後就死亡。鰻魚在卵孵化之後，最先形成柳葉鰻 (Letocephalus)、然後變態成玻璃鰻(glass eel)、再來是鰻線(elvers)、黃鰻 (yellow eel) ，最後變態成銀鰻(silver eel) 而降海產卵(Tzeng et al., 2000)。鰻魚為目前廣泛養殖的魚種中，唯一尚必須利用野生苗作為種苗 來源的魚種，因此，鰻產業極度依賴天然鰻線之供給，形成產業發展上 之主要瓶頸。尤其近年來，受到河川污染、水庫建造、棲息地被破壞， 氣候變遷以及天然鰻線過漁等諸多因素的影響，導致鰻線產量之長期趨 勢有更為下降之現象(Tzeng et al.,1995)。以目前採捕到的最成熟的野生銀 鰻，其雌魚之性腺僅達油滴期(Oil dropiet stage)或是初級卵黃球期 (Primary yolk globule stage)而已，生殖腺指數(Gonadosomatic index,GSI) 約為 1-3%之間，與產卵時 GSI 可達 40%相比，仍處於早期發育階段。使 得鰻魚人工催熟必須依賴長期注射異源性促性腺激素 (Gonadonoptn,GTH)，才能強迫鰻魚生殖腺的進一步成熟。探討鰻魚人工 繁殖迄今未能突破的原因，有三大難關，一、對鰻魚性成熟的機制暸解 不足 ，二、鰻魚之催熟過程冗長，導致受精率與孵化率之不穩定，三 、 仔魚飼育所須之條件尚未掌握。 解剖型態上最為明顯的變化為雌鰻卵巢的發育，而由於血管新生作 用被誘發，進而使微血管絲佈滿卵巢葉面且明顯可見 (Muller et al., 2004)。另一個血管新生作用旺盛的組織為一氣囊腺(亦稱紅體, rete mirabile)，為控制氣體分泌及調節深海壓力環境的器官。其主要由許多動 脈及靜脈微血管網組成，然而，降海繁殖時需調節氣囊增大以應對深海 環境，此時紅體組織亦會隨之增長 (Yamada et al., 2001)，日本鰻發育中. - 16 -.
(32) 氣囊腺體紅體組織的質量會與年齡增長呈正相關，尤其與日本鰻成長階 段 (銀鰻，黃鰻) 相關性大，黃鰻紅體組織質量大小皆比銀鰻小 (Kleckner, 1980; Yamada et al., 2004)，在人工催熟的日本鰻中亦有相同的現象 (Yamada et al., 2001)。紅體組織的組成中含大量顯著的內皮細胞 (Krogh, 1959, cited by Wanger et al., 1987, therein)，已有文獻指出紅體的內皮細胞 總量及密度會隨著年齡或是生殖階段而增加，且其他種類的細胞數會相 對被降低 (Kleckner, 1980 ; Bendayan and Rasio, 1997 ; Yamada et al., 2001 ; Huang et al., 2006)。然而，在日本鰻人工繁殖所面臨的問題中，其 中有一部分的原因是由於卵細胞發育不同步，所以我們推測可能為營養 或激素獲得不均造成。在哺乳動物中，卵巢的血管新生對於卵巢中濾泡 成熟以及黃體生成是相當重要的(Shimizu et al., 2003 ; Kaczmarek et al., 2005)。 目前已知，當降低 PTEN 表現量有助於活化 PI3K-AKT 路徑，進而 增加細胞或組織生長，若生長因子刺激血管生成同時提供足夠的養份及 激素，將會使卵巢發育。相反的，以非自然的方式促進發育，將會破壞 生理的平衡，使細胞或組織生長變異。不論在原始或高等脊椎動物中， 器官或組織發育均需要血管或循環系統的建立來支持。由於卵巢的發育 需要藉由血管來提供養份，故我們探討日本鰻魚紅體與卵巢組織在發育 過程中其 PTEN Homolog 和 EDF-1-like 表現與影響其表現因子之研究。. - 17 -.
(33) 二、材料與方法 2.1 試藥 R。 - Fenofibrate ( PPAR α 活化劑；PPAR α agonists)，購自SIGMA○ - 2-Bromohexadecanoic acid (PPAR β 活化劑；PPAR β agonists) ，購自 R。 SIGMA ALDRICH○ -胰島素增敏劑(Troglitazone； PPAR γ活化劑；PPAR γ agonists） ，購自 R 。 SIGMA○ 。. -兔子血清 ( rabbit serum )，購自喜馬拉雅生物科技有限公司(Himalaya Biotech Ltd.) - VEGF 抗體之血清 ( anti - VEGF serum ) ，購自喜馬拉雅生物科技有限 公司(Himalaya Biotech Ltd.) - Angpt 1 抗體之血清 ( anti - Angpt 1 serum ) ，購自喜馬拉雅生物科技有 限公司(Himalaya Biotech Ltd.) -促進內皮細胞生長之補充劑( Endothelial Cell Growth supplement； R ECGs ) ，購自 SIGMA○ R -硫化鋅 ( Zn；Zinc sulfide ) ，購自 SIGMA ALDRICH○ R -氯化鈷 ( Cobalt Chloride；CoCl2 ) ，購自SIGMA○ R -硫化銅 ( Copper(II)sulfate；Cu2+ ) ，購自SIGMA○ -硫酸亞鐵 ( Ferrous Sulfate；Fe ) ，購自和光純藥工業株式會社 -睪固酮 ( Testosterone；T ) ，購自 SIGMA Fluka R -雌二醇 (β- Estradiol；E2 ) ，購自 SIGMA○ R -黃體激素 ( Progesterone；P4 ) ，購自 SIGMA○. - 18 -.
(34) R -胰島素生長因子 ( Insulin ) ，購自 SIGMA○ -吳郭魚類胰島素生長因子-1 (Tilapia Insulin-Like growth factor-1； IGF-1) ，吳郭魚 IGF-1(純度 90%，由中央研究院吳金冽老師提供) -鹼性纖維母細胞生長因子( basic Fibroblast growth factor；bEGF ) ，購自 Invitrogen Corporation, USA. 2.2 基因選殖 2.2.1EDF-1 基因之選殖 利用 NCBI 以序列相似性，挑選魚類(斑馬魚)基因作為設計變性引子 的模板。之後，以日本鰻 cDNA 作為模板及設計之變性引子進行聚合脢 連鎖反應(PCR)，步驟為： 以梯度實驗測試適合的引子黏合(annealing)溫度 (若反應無條帶出現則返回重新設計引子) ↓ 若有條帶出現則進行切膠純化(Viogene Gel-M Kit) ↓ 以 yT&A 載體進行 T-A 選殖 (yT&ACloning Vector Kit, Yeastern Biotech Co., Ltd). ↓ 以 Primers(M13F 及 M13R)進行 PCR 篩選菌落 ↓ 選殖出之菌落經培養後抽取質體，並以質體為模板分別作三管 PCR 反. - 19 -.
(35) 應，三管分別的引子為(目標基因 Forward+Reverse ; 僅有目標基因 Forward ; 僅有目標基因 Reverse)，此目的可檢驗三種可能結果： 1.確定選殖基因為該設計引子所選殖出 2.排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 所選殖出 3. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Reverse 所選殖出 挑選檢驗無誤的質體送定序公司分析查核結果(若結果經分析不符則重 新設計引子)。定序結果若成功選殖出所需基因，則進行 5’RACE(Clontech) 及 3’RACE 實驗(Roche Applied Science, Germany)。. 2.2.2 EDF-1 5’RACE 首先，製作日本鰻cDNA(Clontech)，取出 2 μl組織全RNA溶液並以 DEPC水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm、280nm 和260 nm / 280 nm UV 波長吸光值，計算出RNA的濃度(RNA量μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。 個別算出含有 1 μg RNA所需的RNA溶液體積，以規格化(Normalize)所有 的樣本，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit User Manual透過 反轉錄合成所有mRNA的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 200 μl PCR tube中依序加入 1μg total RNA後，用DEPC水將總體積補至 3 μl，再 加入 1 μl5’-CDS primerA及 1 μl SMART IL A oligo，將此反應溶液混合均 勻後，置於PCR 反應器中以 70℃加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷卻 2 分 鐘後，加入 2 μl之 5X First-strand buffer、1 μl 之 20mM DTT、1 μl 之 10mM dNTP Mix及 3 μl 之MMLV reverse transcrptase，混合均勻並短暫離心後於. - 20 -.
(36) PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 1 小時 30 分鐘，快速置於冰上冷 卻 2 分鐘後，加入 100μl之Tricine-EDTA buffer( 總反應體積為 110 μl )， 混合均勻並短暫離心後於PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。 最後產物即為First-strand cDNAs，可用於基因選殖。 設計特異性 reverse 引子，以全組織 RNA 所轉錄的 cDNA(Clontech) 為模板，接著以 10X UPM 和特異性 reverse 引子進行 PCR 反應。往後步 驟如同 2.1.1 選殖基因方法。. 2.2.3 EDF-1 3’RACE 首先，取出 2 μl組織全RNA溶液並以DEPC水稀釋二百倍，以分 光光度計量測 260nm、280nm 和260 nm / 280 nm UV波長吸光值，計算出RNA 的濃度(RNA量μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5 μg RNA 所需的RNA溶液體積，以規格化(Normalize)所有的樣本，利用 SuperScript™II Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen Corporation, USA)透過 反轉錄合成所有mRNA的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 200 μl PCR tube 中依序加入 5μg total RNA後，用DEPC水將總體積補至 11 μl， 最後加入 1 μl Vial 8 (Roche) 引子及 1 μl dNTP mix，將此反應溶液混合均 勻後，置於PCR 反應器中以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分 鐘後，加入 4 μl之 5X First-strand buffer、2.5 μl 之 0.1M DTT及 0.5 μl SuperScript™II Rtase ( 總反應體積為 20 μl )，混合均勻並短暫離心後於 PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 52 分鐘，70℃反應 15 分鐘。最後 產物即為First-strand cDNAs。接下來，設計特異性Forward引子，以全組 織RNA所轉錄的cDNA為模板(Roche)，接著以Vial 9(Roche)和特異性. - 21 -.
(37) Forward引子進行PCR反應。往後步驟如同 2.1.1 選殖基因方法。. 2.3 活體實驗 2.3.1 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境 本實驗所使用的鰻魚購自鰻魚養殖場。為生長一至二年的日本鰻(Anguilla japonica)。實驗前馴養在由淡水鹽化成全海水約一星期，不餵食。. 2.3.2 活體外源激素製備 2.3.2.1 鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE) 購自當地養殖場的泰國鯰魚腦下垂體(每顆約 4.2mg，保存於丙酮 中)，將其磨碎後，與磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate Buffered Saline；PBS)混 合均勻，儲存於-20℃中。施打日本鰻劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重 （KgBW）。. 2.3.2.2 睪固酮(Testosterone) 購自 SIGMA-Fluka，將睪固酮溶於酒精後，再稀釋於磷酸鹽緩衝溶 液中，儲存於-20℃中。施打日本鰻劑量約 3μg 睪固酮/每公斤魚重 (KgBW)。. 2.3.3 活體外源激素處理 將日本鰻以 0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉後，在其腹部施打泰國鯰魚 腦下垂體萃取液，每週施打一次，並在其未施打泰國鯰魚腦下垂體萃取 液前以及在施打泰國鯰魚腦下垂體萃取液第 3、6、9 針後的 72 小時採集 性腺和紅體組織。 另外，在日本鰻腹部施打泰國鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮混合. - 22 -.
(38) 液，每週施打一次，並在第 9 針後的 72 小時採集性腺和紅體組織。. 2.3.4 GSI 0/0和RMI 0/00的測量 將日本鰻麻醉後，以秤測量其體重後，利用解剖器具將鰻魚性腺和 紅體組織取出後，以微量天秤秤重，利用下列公式計算出： 生殖腺重指數(Gonado-Somatic Index ; GSI) *GSI ( 0/0 ) = (生殖腺重/體重) ×100％ 紅體重指數(Rete Mirabile Index ; RMI) *RMI ( 0/00 ) = (紅體總重/體重) ×10000/00. 2.3.5 組織全 RNA 的抽取 1.5 ml微量離心管(Eppendorf)中含研磨珠【此研磨珠泡於 DEPC(Diethyl Pyrocarbonate)水中，再以 37℃水浴中 6 小時，將DEPC水 倒掉，再以高溫高壓下滅菌 15 分鐘後，置於 70℃烘箱中烘乾，保存於 4 ℃以備使用】和 500 μL TRI® Reagent，再將日本鰻性腺組織或紅體組織 放入 1.5 ml 微量離心管中，並置於冰上，以研磨震盪機將組織磨碎後， 以 12000 rpm，4℃，離心 10 分鐘。使用微量滴管取上清液，移入新 1.5ml 微量離心管中，加入 200 μL BCP或氯仿，輕輕搖晃混合均勻且靜置於室 溫 10 分鐘後，以 12000 rpm，4℃，離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含 RNA)，下層為有機相，兩相之間有白色的蛋白質層且包含DNA，小心地 吸取上清液，約 200 μL上清液，移入新 1.5 ml 微量離心管中，加入 500 μL 異丙醇混合均勻後，輕輕搖晃混合均勻，以 12000 rpm，4℃，離心 10 分 鐘。移去上清液，以 500 μL 75%酒精清洗白色沉澱，吸除酒精後，放置 無菌操作臺中自然乾燥白色沉澱物，待其變半透明後，以DEPC水(此水. - 23 -.
(39) 需經高溫高壓滅菌)溶解白色沉澱物，並保存於-70℃。. 2.4 離體實驗 2.4.1 細胞樣品 將日本鰻以 0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉後，依實驗需求取得紅體和 眼睛組織，並進一步取得紅體和眼睛之細胞。. 2.4.2.紅體細胞的取得 在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶取 8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml) 取 8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液）中使用滅菌解剖剪去除結締組織並將組織剪碎後， 放入配置好的酵素混合液中，反應條件為 4℃過夜(overnight)作用後，再 於室溫中作用ㄧ小時後，置於冰上約 3 分鐘，再以無菌滴管吸除酵素後， 並將組織移置 15 ml微量離心管中，加入 6~7 mL 磷酸鹽緩衝溶液，以 1mL 針筒(拔除針頭部分)沖刷細胞(此為利用機械作用原理)，再以過濾網 (70μm)過濾，約反覆一到二次後，將其內容物移置 15 ml離心管，再以 4500rpm，4℃，離心 8 分鐘。以無菌滴管吸除上清液，加入含 10%胎牛 血清培養液(M199)打散細胞，使細胞和 10 %胎牛血清培養液(M199)混合 均勻(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl的細胞懸浮液與 100μl的trypan blue均勻混合，取出混合後的細胞 10μl放入細胞計數器 (hemacytometer)中，以顯微鏡觀察細胞數量，並計算細胞計數器九宮格. - 24 -.
(40) 裡四直角大格的活細胞數目。若是死細胞會被trypan blue染成藍色(因 trypan blue是染細胞核，細胞破裂後才會裸露出細胞核)，活細胞則不呈 色。且取得紅體組織時，因其含紅血球，而以顯微鏡觀察紅血球為橢圓 形、形狀規則，而細胞形狀較不規則。細胞總數=(細胞計數器上四直角 大格的活細胞數/4)×104。經細胞計數之後的細胞總數，計算細胞數的濃 度約每毫升 105~106的細胞數，將其平均種入 12 孔細胞培養盤中，並以 含 10%胎牛血清的培養液培養三天。之後每三天，若細胞生長狀況良好 則吸除培養液且添加 10%胎牛血清的培養液(M199)培養，並培養於 25℃，5％CO2中直到為進行實驗所需之細胞量，即可加入欲處理的外源 激素。另外，培養的前一天，12 孔細胞培養盤需貼附(coating)ㄧ層明膠(1 ％的gelatin；購自SIGMA)約 12 小時以上(一般至少 20 分鐘以上)，之後 吸除明膠，再以DEPC水清洗ㄧ次，待乾燥後即可使用。. 2.4.3 眼球細胞的取得 在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶 8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml)取 8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm 的無菌過濾膜至 50ml 離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液)中使用滅菌解剖剪將水晶體取出後，放入配置好的酵 素混合液中，反應條件為 4℃過夜(overnight)作用後，再於室溫中作用ㄧ 小時後，置於冰上約 3 分鐘，再以無菌滴管吸除酵素後，並將組織移置 15 ml 離心管中，加入 6~7 mL 磷酸鹽緩衝溶液，以 1mL 針筒(拔除針頭 部分)沖刷細胞(此為利用機械作用原理)，再以過濾網(70μm)過濾，約反. - 25 -.
(41) 覆一到二次後，再將其移置 15ml 微量離心管， 以 4500rpm，4℃，離心 8 分鐘。以無菌滴管吸除上清液，以含 10%胎牛血清培養液(M199)打散 細胞，使細胞和 10 %胎牛血清培養液(M199)混合均勻，且補至 10ml，最 後將細胞液倒入 T-75 細胞培養瓶，完成細胞初代培養。. 2.4.4 眼睛細胞繼代培養 將培養於 T-75 培養瓶中貼附細胞繼代培養。首先，倒除培養瓶中的 培養液並以磷酸鹽緩衝溶液清洗 2~3 次後，加入 37℃Trypsin 5~6 ml 於培 養瓶中，輕搖使覆蓋培養瓶底部後開始拍打三分鐘，過程中以倒立顯微 鏡觀察細胞切除的狀態調整酵素作用的時間，經酵切可見細胞漂浮於液 面後，立即加入 10%胎牛血清培養液 5~6ml 中止酵素活性(於冰上作業)， 均勻混合後倒入 15ml 離心管，以 4500rpm ，4℃，離心 8 分鐘，離心後 吸除上清液並加入 3~4ml 10%胎牛血清培養液(M199)打散細胞，使細胞 和 10 %胎牛血清培養液(M199)混合均勻，且補至 10ml，最後將細胞液倒 入 T-75 細胞培養瓶，完成細胞繼代培養。. 2.4.5 離體外源激素處理 首先，以無菌微量滴管吸除 12 孔細胞培養盤中的培養液並以 PBS 清洗 2 ~ 3 次後，加入 0.1 %或不含胎牛血清的培養液(M199)培養細胞 30 分鐘後，加入欲處理的外源激素。以實驗的作用時間而定，若是一天內 則以不含胎牛血清的培養液(M199)培養，而一天以上的作用時間，則以 0.1 %或不含胎牛血清的培養液(M199) 培養，並且需於三天更換培養 液，且內含欲處理的外源激素。. 2.4.6 細胞全 RNA 抽取. - 26 -.
(42) 利用Viogene公司的total RNA Mini kit抽取細胞全RNA。首先，吸 除培養液並以磷酸鹽緩衝溶液沖洗兩次。12 孔的培養盤中，每孔加入 350 μl的RX buffer(每一毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol)，輕輕 敲打後靜置 5 分鐘後，加入同體積(350 μl) 75 %酒精(需以高純度酒精配 置)並均勻混合。將混合液置入Total RNA Mini column中，以 13000rpm， 4℃，離心 1 分鐘。離心後倒除下清液，加入 0.5 ml WF buffer，以 13000rpm，4℃，離心 1 分鐘(WF的作用為使RNA鍵結於column)。離心 後倒除下清液，加入 0.7ml WS buffer，以 13000rpm，4℃，離心 1 分鐘(WF 的作用為沖刷非鍵結於column的物質)。離心後倒除下清液，再以 13000 rpm，4℃，離心 3 分鐘後(此步驟目的在於更完全去除酒精成分)，將column 放入新的 1.5ml 微量離心管中並加入 15 μl的RNase-free ddH2O(置於 column中央)，靜置 1 ~ 2 分鐘後，以 13000rpm，4℃，離心 2 分鐘。離心 後的下清液即為細胞全RNA，需置於-70℃下保存。. 2.5 cDNA 的製備 取出 2 μl組織全RNA溶液並以DEPC水稀釋二百倍，以分光光度計量 測 260nm、280nm 和260 nm / 280 nm UV波長吸光值，計算出RNA的濃度(RNA 量μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5 μg RNA所需的RNA溶 液體積，以規格化(Normalize)所有的樣本，利用SuperScript™II Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen Corporation, USA)透過反轉錄合成所有mRNA 的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 200 μl PCR tube 中依序加入 5μg total RNA後，用DEPC水將總體積補至 11 μl，最後加入 1 μl Vial 8. - 27 -.
(43) (Roche) 引子及 1 μl dNTP mix，將此反應溶液混合均勻後，置於PCR 反 應器中以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分鐘後，加入 4 μl之 5X First-strand buffer、2.5 μl 之 0.1M DTT及 0.5 μl SuperScript™II Rtase ( 總反應體積為 20 μl )，混合均勻並短暫離心後於PCR 反應器中，反應 條件為 42℃反應 52 分鐘，70℃反應 15 分鐘。最後產物即為First-strand cDNAs，可用於基因選殖及聚合脢連鎖反應的模板。. 2.6 RT-PCR(reverse transcriptase PCR)分析表現量 將實驗鰻的性腺或紅體組織抽取全 RNA 逆轉錄為 cDNA(Roche) 後，以 cDNA 為模板及欲分析基因的專一性引子經由 PCR 反應提升樣品 濃度以進行分析。PCR 反應產物經 DNA 電泳分析後，利用 Ezlab 膠片影 像分析軟體比較表現量之差異。其中，以 cytochrome b 作標準基準基因 (Internal standard)。最後，以 Sigma Plot 軟體進行數據分析。 分析基因各設計引子為： PTEN Long form-Like(PTEN long forward，PTEN long reverse) PTEN long f 124~147：5’-CGGGTGTCATGATTTGTGCTTACT -3’ PTEN long r 939~962：5’-CGGGGTCAGAGTCAGTGGTGT -3’ PTEN Short form-Like(PTEN short forward，PTEN short reverse) PTEN short f 192~210：5’-CTTCTACGGCGAAGTCAGG -3’ PTEN short r 693~673：5’-GGTGAGCGACAGGATGAGGTA -3’ Cytochrome b(cyto-b forward , cyto-b reverse) Cyto-b fw：5’-CACAAATCCTTACAGGACTATTCC-3’. - 28 -.
(44) Cyto-b rv：5’-GTAAAGGTATGAGCCGTAGTAAAG-3’ EDF-1(EDF-1 forward，EDF-1 reverse) EDF-1 f 27：5’- CGA GGG AAG GAT ATT GGT GA -3’ EDF-1 r 360：5’- CAA ATC TGG AAA TGC AGG GT -3’. 2.7 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色的製備 2.7.1 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之固定液的製備 將日本鰻性腺部份組織浸泡於固定液中【Bouin’s solution(購自 SIGMA○R )或 Paraformaldehyde(購自 SIGMA○R ；2 g Paraformaldehyde 加熱 溶解於磷酸鹽緩衝溶液中） 】 ，並保存於 4℃中。. 2.7.2 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之脫水至石蠟包 埋的製備 使用 50%酒精洗滌數次之後浸泡於 50%酒精 4 小時且放置震盪儀搖 晃(此步驟目的為移除苦味酸(Picric acid)以防傷害組織)，完成後儲存於 70%酒精中。 進行修片(Trimming)步驟，修整組織厚度為 3mm 後置於包埋盒。 脫水(Dehydration)步驟，包埋盒內之組織以 70 %酒精浸泡 1 小時、 80 %酒精浸泡 1 小時、95 %酒精浸泡 1 小時、100 %酒精浸泡 50 分鐘(因 酒精會使組織皺縮或變形，因此不能浸泡於高濃度久經過久，尤其是 100%酒精)，以上皆需放置震盪儀搖晃。 清洗(Cleaning)步驟，包埋盒內之組織使用二甲苯(Xylene)浸泡組織 於室溫 1 小時以脫除酒精部份，且二甲苯可溶於石蠟中。. - 29 -.
(45) 浸潤(Infiltration)步驟，包埋盒內之組織浸泡二甲苯於室溫 1 小時的 組織換至 65℃二甲苯中浸泡 1 小時，之後，換至二甲苯：石蠟(1：1)的 比例混和液中於 65℃浸泡 1 小時，最後，換至全蠟中於 52~62℃浸泡 1 小時(此步驟為使用硬石蠟(溶點 52~62℃)，若石蠟過熱，組織與石蠟將產 生裂痕)。 包埋(Embedding)步驟，首先，將包埋模形(鐵製)置於加熱板上溫熱， 再將溫熱石蠟倒入包埋模形內(避免產生氣體)，接著將包埋模型置於桌面 上，置入組織(切面朝下)，再將塑膠板放入包埋模形中，隨後立即加入溫 石蠟補足包埋模形 (使含有組織的石蠟能與塑膠板緊密連結)，將其置於 冰上使其冷卻靜置(包埋模形的溫度要ㄧ致，以避免冷卻不均，而造成組 織與石蠟將產生裂痕)，冷卻成形後將石蠟塊取出整修成梯型狀。儲存於 -70℃冰箱中以利石蠟切片。. 2.7.3 石蠟切片 首先，使用石蠟切片機，調整間距為 5μm 進行切割（樣本置於冰 中） 。置於冷水槽中展開，以一般玻片(為未貼附(coating)的載玻片，避免 組織黏附在玻片上面)再移至熱水(約 40℃)中伸展，以 Coating Slide 撈取 後，置於加熱板上烘乾。以 65℃烘箱中烤片， 30 分鐘，即可保存。. 2.8 切片染色 2.8.1 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之蘇木精伊紅染 色 以 65℃烘箱中烤片，5 分鐘，Coating Slide 在室溫中冷卻後，. - 30 -.
(46) xylene(無水)浸泡 10 分鐘，xylene(含水)浸泡 10 分鐘，100％酒精(無水) 浸泡 5 分鐘，100％酒精(含水)浸泡 1 分鐘，95％酒精浸泡 25 秒，90％酒 精浸泡 25 秒，80％酒精 浸泡 25 秒，70％酒精浸泡 25 秒後，50％酒精 浸泡 25 秒後，以二次水清洗 5 分鐘，蘇木精(Hematoxylin) 浸泡 20 分鐘， 水洗蘇木精，scott solution(固定液)3 分鐘，水洗 scott solution，50％酒精 浸泡 1~2 分鐘，70％酒精浸泡 2~3 分鐘，伊紅(Eosin Y；使用前加 2~3 滴 醋酸) 浸泡 5 分鐘，80％酒精浸泡 1 分鐘，90％酒精浸泡 1 分鐘，95％ 酒精浸泡 1 分鐘，100％酒精(含水)浸泡 2~3 分鐘，100％酒精(無水)浸泡 2~3 分鐘，xylene(含水)浸泡 3~5 分鐘，浸泡於 xylene(無水)，封片。. 2.8.2 日本鰻性腺和紅體組織石蠟組織切片染色之免疫組織化學 染色 方法一: 以 65℃烘箱中烤片， 5 分鐘，Coating Slide在室溫中冷卻後，進行 脫臘步驟， xylene浸泡 10 分鐘，進行兩次，100％ 酒精浸泡 2 分鐘，進 行兩次，90％酒精浸泡 2 分鐘，80％酒精 浸泡 2 分鐘，70％酒精浸泡 2 分鐘後，以水清洗 5 分鐘，置於磷酸鹽緩衝溶液中，滴 3％ H2O2(deperoxidase)於組織上，靜置 5 分鐘，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，(利用此時間預熱Citrate buffer，功率 100％，3 分鐘「要注 意是否有乾掉的情形，加水補回原容量」 ，將Coating Slide浸泡於Citrate buffer，功率 70％，7 分鐘，兩次，在隔冰水回溫 10~15 分鐘後，以磷酸 鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，置於潮濕盒中以一級抗體 ，以磷酸 鹽緩衝溶液進行 1：1000 稀釋】 於室溫中反應(PTEN long反應 20 分鐘；. - 31 -.
(47) PTEN short反應 40 分鐘)，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，於 潮濕盒中以HRP Label於室溫中反應 20 分鐘，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清 洗 2 分鐘，3 次，再滴DAB於組織上呈色反應 3 分鐘 【DAB chromogen 1 滴 / DAB buffer 1c.c.（配置於避光的微量離心管中） 】 ，以流動水清洗 Coating Slide上的組織 5 分鐘後，組織依序以 70％酒精、80％酒精、90 ％酒精、100％酒精分別 10 ~ 20 秒進行脫水，再置於 70℃烘箱中烘乾， 約 10 分鐘後，在室溫中冷卻，泡於xylene中(乾淨的xylene)，進行封片。 利用正立顯微鏡觀察染色情形(若具PTEN的胞器則呈褐色)，以Viewfinder Lite系統照相。 方法二: 以 65℃烘箱中烤片， 5 分鐘，Coating Slide在室溫中冷卻後，進行 脫臘步驟， xylene浸泡 10 分鐘，進行兩次，100％ 酒精浸泡 2 分鐘，進 行兩次，90％酒精浸泡 2 分鐘，80％酒精 浸泡 2 分鐘，70％酒精浸泡 2 分鐘後，以水清洗 5 分鐘，置於磷酸鹽緩衝溶液中，滴 3％ H2O2(deperoxidase)於組織上，靜置 5 分鐘，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，滴Immuno DNA Digester於組織上作用 10 分鐘，以磷酸鹽緩 衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，置於潮濕盒中以一級抗體 【以磷酸鹽緩 衝溶液進行 1：1000 稀釋】 於室溫中反應(PTEN long反應 20 分鐘；PTEN short反應 40 分鐘)，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分鐘，3 次，於潮濕盒 中以HRP Label於室溫中反應 20 分鐘，以磷酸鹽緩衝溶液浸泡清洗 2 分 鐘，3 次，再滴DAB於組織上呈色反應 3 分鐘【DAB chromogen 1 滴 / DAB buffer 1c.c.（配置於避光的微量離心管中）】，以流動水清洗Coating. - 32 -.
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