第四章 討論
4.12 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 的調控比較
我們以PPAR agonists、生長因子、類固醇和金屬離子處理紅體細胞，
並進一步觀察PTEN long與PTEN short的基因表現和蛋白質調控是否有相 關性。以生長因子之IGF-1 處理紅體細胞，發現PTEN long、PTEN short 基因表現量和PTEN short免疫反應強度都沒有太大相關性，但是卻觀察到 IGF-1 劑量為 10-7M時，會明顯增加PTEN long免疫染色反應，其原因須 進一步探討。另外，在Insulin處理紅體細胞，發現PTEN short基因表現量 PTEN long和PTEN short免疫反應強度都沒有太大相關性，但是卻觀察到 PTEN long基因表現量明顯增加。由這兩個結果顯示，我們推測，在鰻魚 的紅體細胞中，當IGF-1 和Insulin過度活化時，會使得PTEN long負調控
PI3K/AKT路徑，使得抑制細胞過度生長。紅體細胞在長時間的受鋅離子 作用下，會抑制PTEN long蛋白質表現，但是對於PTEN short似乎沒有太 大相關性。
我們推測，鰻魚的紅體細胞和人類呼吸道上皮細胞相同會隨著鋅離子作 用時間增長，使得減少PTEN long 蛋白質表現。而在鋅離子作用下，會 活化Akt，而減少 PTEN 磷酸化(Wu et al., 2003)。文獻指出哺乳動物之 PTEN 在細胞核和細胞質所扮演的角色不同，在細胞質中，PTEN 的作用與PI3K 訊號傳遞路徑相關，而在細胞核中，PTEN 的作用與染色體穩定性、DNA 修復、細胞週期停止和細胞內穩定性相關(Planchon et al., 2008)。從這三 個實驗發現鰻魚的紅體細胞，PTEN long 和 PTEN short 的作用不同，而 且我們推測PTEN long 與 PI3K 訊號傳遞路徑相關。而 PTEN short 的表 現都沒有太大差異，我們推測PTEN short 的功能似乎與染色體穩定性、
DNA 修復、細胞週期停止和細胞內穩定性相關。
五、結論
1. 從活體實驗中推測在紅體和卵巢中，對於調控 PTEN 的作用不同，當 紅體(RMI 値)組織發育，其 PTEN mRNA 表現量和蛋白質都會增加，而 當卵巢(GSI 値)發育，PTEN long 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育成負 相關，但是 PTEN short 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育的正負相關性 較不一致，而 PTEN 蛋白質會受到抑制。而當紅體或卵巢組織不發育時，
會減少 EDF-1 mRA 表現量，組織發育時，則會增加 EDF-1 mRA 表現量。
而添加睪固酮會抑制 PTEN 和 EDF-1 表現量，但會增加 PTEN 蛋白質免 疫反應。
2. 從 IGF-1、Insulin 和鋅離子作用於紅體細胞結果顯示，我們推測，在 鰻魚的紅體細胞中，PTEN long 和 PTEN short 的作用不同，而且我們推 測 PTEN long 與 PI3K 訊號傳遞路徑相關。而 PTEN short 的表現都沒有 太大差異，我們推測 PTEN short 的功能似乎與染色體穩定性、DNA 修復、
細胞週期停止和細胞內穩定性相關。EDF-1 基因在鰻魚的紅體細胞中，
會受到生長因子、類固醇和二價離子調控。
六、圖表
來源：Leslie et al,2002
圖1、哺乳動物PTEN分子結構
哺乳類動物的PTEN蛋白約有403個胺基酸。其中包括兩個必要活性區：N 端去磷酸酶結構及C端C2結構。而其N端前端為PtIns(4,5)P2 結合位和磷 酸酶活性區域(7~185胺基酸)。在C2結構為C2區域(186~351胺基酸)C端未 端有一段PDZ結合位。(Leslie et al,2002)。
5’
5’
3’
3’
Long form Short form 長短差異區
多核酸差異區
45bp 69bp
來源：陳逸帆(2007)
圖 2、日本鰻 PTEN 基因
日本鰻 PTEN Long form 與 PTEN Short form 之間的差異：
1.比較長度：PTEN Long form 比 PTEN Short form 多 69bp
2.鄰近3端的多核酸差異區：PTEN Long form與PTEN Short form有45bp的 差異
1-TCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACGCGGAGAAGAGGTCGAAACTTCAAAGAAGTGGGCCGCAGGC CAGAACAAGCAGCACCTGGTGGCGAAGAACACTGCAAAGCTGGA CCGCGAGACAGAGGAGCTGCAACACCAGCGTGTGAGCCTGGAGGT GGGAAAGGTCATCCAACAGGGTCGCCAGAACAAAGGCCTGACGCA GAAGGACCTGGCAACCAAAATCAACGAGAAGCCCCAGGTAATCGC AGACTATGAATGTGGAAAAGCCATTCCCAACAACCAAGTGATGGGC AAGATCGAGAGAGCTATCGGGCTGAAGCTGCGAGGGAAGGATATT GGTGAACCCCTCGAAGCGGGACCCAAGAAGAAATGAAAACAAAG CCTCGAAGTCAGCCCATCCCTCATTCCCCATTCCCCATCCCCCTAAT CCCTAAAAATCTCTGATTGATGCAGACCCCCCACTACCTGGGCTGAT TCACTTGGATCCCTCTGGGGTCCAGGTGTCCATCAAATTTCCAAGTT TAAGAATGAGGAGCTTTCAGTGCAGAACCAAATCCCAAAGCGCTG TTATTGATTCCTTTTTTTTGCATGACACTATATTTCAATTGCCGAATAA AGACAAAGTGTCACACAAAAACCCTGCATTTCCAGATTTGAAGCTT GGAATTCGCCCGGGTACCGAGCTCGCCCTATAGTGAGTCGTATACAA TCACTGAAGTG-741
圖 3、日本鰻 EDF-1 mRNA 序列 (741bps)
圖 4、日本鰻 EDF-1 的胺基酸序列比對
遺傳相關係數(Genetic similarity ；GS) 0 227.7
50 100
150 200
Homo sapiens- alpha .SEQ Homo sapiens- beta .SEQ Rana catesbeiana .SEQ Osmerus mordax .SEQ Gallus gallus .SEQ Mus musculus .SEQ Danio rerio .SEQ A japonica .seq Salmo salar .SEQ
Oncorhynchus mykiss .SEQ
圖 5、鰻魚已選殖出部分 EDF-1 分子與其他物種相似度關係圖 (以 DNASTAR 之程式分析)
(A) (B)
(A)
體重 (g)
100 150 200 250 300 350 400 450
紅體體重(g)
PTEN short 表現量
0
0 針 3 針 6 針 9 針(組別)
(arbitrary unit) RMI值
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
PTEN short表現量
0
(arbitrary unit) RMI值
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
PTEN short 表現量
0
PTEN short 表現量
0
A、C、D、G、H、K、L 圖為第一次實驗組，B、E、F、I、J、M、N 圖 為第二次實驗組。
0 針 (組別)
A、C、D、G、H 圖為第一次實驗組，B、E、F、I、J、K、L 圖為第二 次實驗組。
9針 9針 + T(組別)
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
(G) (H) (I) (J)
(K) (L) (M)
(N) (O) (P) (Q)
(R) (S) (T)
圖 12、雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之切片染色 A、
G~M
B、C 圖為 HE 染色，D~T 圖為 IHC 染色。
圖為 PTEN long 之 IHC 染色，N~T 為 PTEN short 之 IHC 染色
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
(G) (H) (I)
(J) (K) (L)
(M) (N) (O)
(P) (Q) (R)
圖 13、雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之切片染色 A、B、C 圖為 HE 染色，D~R 圖為 IHC 染色。
G~L 圖為 PTEN long 之 IHC 染色，M~R 為 PTEN short 之 IHC 染色
2 3 4 5 6 7(週數)
(DMSO)
D、G 為 PTEN long mRNA 表現量，B、E、H 為 PTEN short mRNA 量，C、F、I 為 EDF-1 mRNA 表現量
PBS DMSO
(A) (B) (C) (D)
(E) (F) (G) (H)
(I) (J ) (K) (L)
(M) (N) (O) (P)
(DMSO) PBS 2.5ul 5ul 10ul
PTEN long螢光表現
0 4 8 12 16 20
(Q)
(arbitrary unit)
(DMSO)
PBS 2.5 ul 5 ul 10 ul
PTEN short 螢光表現
0 10 20 30 40
(R)
(arbitrary unit)
圖17、離體培養條件之建立與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的 關係。A、E、I、M、C、G、K、O 圖為可見光；B、F、J、N、D、H、
L、P 圖為螢光。A、B、E、F、I、J、M、N、Q 圖為 PTEN long 表現圖；
(PPAR agonists)
EDF-1表現量 (arbitrary unit)
sts)
(A) (B) (C) (D)
PTEN short 螢光表現
0
PTEN long 螢光表現 (arbitrary unit)
(O)
圖19、PPAR agonists 與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的關係
DMSO α β γ
A、B、E、F、I、J、M、N、Q 圖為 PTEN long 表現圖；C、D、G、H、
(ECGs) PBS 75ug 150ug 300ug
PTEN long表現量 PBS 75ug 150ug300ug
PTEN short表現量 PBS 75ug 150ug 300ug
EDF-1表現量
圖 20、分析內皮細胞生長補充劑(ECGs,Endothelial Cell Growth supplement)與 PTEN 、EDF-1 mRNA 表現量的關係
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H)
( I ) ( J )
PBS ECGs-150ug
PTEN long螢光表現
0 2 4 6 8 10
(arbitrary unit)
(I)
PBS ECGs-150ug
PTEN short螢光表現
0 2 4 6 8 10
(J)
(arbitrary unit)
圖 21、內皮細胞生長補充劑(ECGs,Endothelial Cell Growth supplement)與
PTEN long 表現量
PTEN short 表現量
0
圖 22、分析生長因子(IGF-1)與 PTEN、EDF-1 mRNA 表現量的關係 A、C、E 圖為第一次實驗組，B、D、F 圖為第二次實驗組。
(A) (B) (C) (D)
(E) (F) (G) (H)
(I) (J) (K) (L)
(M) (N) (O) (P)
PTEN long螢光表現
0 5 10 15 20 25
PBS 10-9 10-8
10-7
(Q)
(arbitrary unit)
PTEN short螢光表現
0 2 4 6 8 10
PBS 10-9 10-8
10-7
(arbitrary unit)
(R)
M M
圖 23、生長因子(IGF-1)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的關係
PTEN long表現量
(A) (B) (C) (D)
圖 25、胰島素(Insulin)與 PTEN long、PTEN short 免疫反應強度的關係
PTEN long表現量
(A) (B) (C) (D)
PBS 10-10 10-9 10-8
(arbitrary unit)
PBS 10-10 10-9 10-8
(arbitrary unit)
(bFGF)
M M
圖 27、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)與 PTEN long、PTEN short 免疫 反應強度的關係
PTEN long表現量
圖 28、分析類固醇（睪固酮,Testosterone)與 PTEN、EDF-1 表現量的關 係。A、C、E 圖為第一次實驗組，B、D、F 圖為第二次實驗組。
(A) (B) (C) (D) PTEN short螢光表現
0
圖 29、類固醇（睪固酮,Testosterone)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反 應強度的關係
(A)
圖 30、分析類固醇(雌性素,Estradiol)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
(A) (B) (C) (D)
圖 31、類固醇(雌性素,Estradiol)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反應強 度的關係
PTEN long表現量
圖 32、分析類固醇(黃體激素,Progesterone)與 PTEN、EDF-1 表現量的關 係
(A) (B) (C) (D)
圖 33、類固醇(黃體激素,Progesterone)與 PTEN long 和 PTEN short 免疫 反應強度的關係
(A)
(A) (B) (C) (D)
(A) (B) (C) (D)
(A)
(A) (B) (C) (D)
圖 38、離子(氯化鈷,CoCl2)作用 12 小時與PTEN long和PTEN short免疫反 應強度的關係
(A) (B) (C) (D)
圖 39、離子(氯化鈷,CoCl2)作用 3 天與PTEN long和PTEN short免疫反應 強度的關係
PTEN long表現量
(arbitrary unit) EDF 1表現量
0.0
(A) (B) (C) (D)
圖 41、離子(硫化銅,Cu2+)作用 12 小時與PTEN long和PTEN short免疫反 應強度的關係
(A) (B) (C) (D)
PTEN long表現量
CTL 10-8M10-7M 10-6M (Fe)
CTL 10-8M10-7M 10-6M (Fe)
CTL 10-8M10-7M 10-6M (Fe)
(arbitrary unit)
(C)
圖43、分析離子(硫酸亞鐵,Fe)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
(A) (B) (C) (D)
(E) (F) (G) (H)
(I ) (J ) (K) (L)
(M) (N)
CTL
PTEN long 螢光表現
0 2 4 6 8 10 12 14
(arbitrary unit)
(O)
10-8M 10-7M 10-6M
PTEN short 螢光表現
0 2 4 6 8 10 12
CTL
(arbitrary unit)
10-7M 10-6M
(P)
圖44、離子(硫酸亞鐵,Fe)作用三天時與 PTEN long 和 PTEN short 免疫反 應強度的關係
RMI 値 PTEN long mRNA
PTEN short mRNA
EDF-1 mRNA 不同體
型大小
↑ ↑ X ↑ X ↑ X ↑
※ ↑ ↑ = 呈正相關，且明顯增加
※ X ↑ = 沒有太大相關，但呈現增加的趨勢
表1、不同體型大小之養殖鰻與 PTEN 和 EDF-1 基因表現量關係
RMI 値 PTEN long mRNA
PTEN short mRNA
PTEN long Protein PTEN short Protein 腦下垂
GSI 値 PTEN long mRNA
PTEN short mRNA
PTEN long Protein PTEN short Protein 腦下垂
PTEN long
PTEN short Protein
七、參考文獻
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