目的

鰻魚屬於鰻鱺科(Anguillidae)，鰻屬(Anguillus)，是一種非常特殊的 魚類，全世界總共有十八種。鰻魚因為奇特的生活史，一直以來對鰻魚 的生態都是個謎；台灣地區鰻魚的種類有四種，最常見者為日本鰻 ( Anguilla japonica) 及鱸鰻(A. marmorata)；鰻魚在演化上屬於原始脊椎 動物，其生長到不同時期時會有變態發生而改變外觀；跟鮭魚有著相反 的生活史，鰻魚會在河川中長大、成熟後洄游到海洋中產卵，一生只產

一次卵，產卵之後就死亡。鰻魚在卵孵化之後，最先形成柳葉鰻

(Letocephalus)、然後變態成玻璃鰻(glass eel)、再來是鰻線(elvers)、黃鰻 (yellow eel) ，最後變態成銀鰻(silver eel) 而降海產卵(Tzeng et al.,

2000)。鰻魚為目前廣泛養殖的魚種中，唯一尚必須利用野生苗作為種苗 來源的魚種，因此，鰻產業極度依賴天然鰻線之供給，形成產業發展上 之主要瓶頸。尤其近年來，受到河川污染、水庫建造、棲息地被破壞，

氣候變遷以及天然鰻線過漁等諸多因素的影響，導致鰻線產量之長期趨 勢有更為下降之現象(Tzeng et al.,1995)。以目前採捕到的最成熟的野生銀 鰻，其雌魚之性腺僅達油滴期(Oil dropiet stage)或是初級卵黃球期

(Primary yolk globule stage)而已，生殖腺指數(Gonadosomatic index,GSI) 約為1-3%之間，與產卵時 GSI 可達 40%相比，仍處於早期發育階段。使 得鰻魚人工催熟必須依賴長期注射異源性促性腺激素

(Gonadonoptn,GTH)，才能強迫鰻魚生殖腺的進一步成熟。探討鰻魚人工 繁殖迄今未能突破的原因，有三大難關，一、對鰻魚性成熟的機制暸解 不足 ，二、鰻魚之催熟過程冗長，導致受精率與孵化率之不穩定，三 、 仔魚飼育所須之條件尚未掌握。

解剖型態上最為明顯的變化為雌鰻卵巢的發育，而由於血管新生作 用被誘發，進而使微血管絲佈滿卵巢葉面且明顯可見 (Muller et al., 2004)。另一個血管新生作用旺盛的組織為一氣囊腺(亦稱紅體, rete mirabile)，為控制氣體分泌及調節深海壓力環境的器官。其主要由許多動 脈及靜脈微血管網組成，然而，降海繁殖時需調節氣囊增大以應對深海 環境，此時紅體組織亦會隨之增長 (Yamada et al., 2001)，日本鰻發育中

氣囊腺體紅體組織的質量會與年齡增長呈正相關，尤其與日本鰻成長階 段 (銀鰻，黃鰻) 相關性大，黃鰻紅體組織質量大小皆比銀鰻小 (Kleckner, 1980; Yamada et al., 2004)，在人工催熟的日本鰻中亦有相同的現象

(Yamada et al., 2001)。紅體組織的組成中含大量顯著的內皮細胞 (Krogh, 1959, cited by Wanger et al., 1987, therein)，已有文獻指出紅體的內皮細胞 總量及密度會隨著年齡或是生殖階段而增加，且其他種類的細胞數會相 對被降低 (Kleckner, 1980 ; Bendayan and Rasio, 1997 ; Yamada et al., 2001 ; Huang et al., 2006)。然而，在日本鰻人工繁殖所面臨的問題中，其 中有一部分的原因是由於卵細胞發育不同步，所以我們推測可能為營養 或激素獲得不均造成。在哺乳動物中，卵巢的血管新生對於卵巢中濾泡 成熟以及黃體生成是相當重要的(Shimizu et al., 2003 ; Kaczmarek et al., 2005)。

目前已知，當降低PTEN 表現量有助於活化 PI3K-AKT 路徑，進而 增加細胞或組織生長，若生長因子刺激血管生成同時提供足夠的養份及 激素，將會使卵巢發育。相反的，以非自然的方式促進發育，將會破壞 生理的平衡，使細胞或組織生長變異。不論在原始或高等脊椎動物中，

器官或組織發育均需要血管或循環系統的建立來支持。由於卵巢的發育 需要藉由血管來提供養份，故我們探討日本鰻魚紅體與卵巢組織在發育 過程中其PTEN Homolog 和 EDF-1-like 表現與影響其表現因子之研究。

二、材料與方法

2.1 試藥

- Fenofibrate ( PPAR α 活化劑；PPAR α agonists)，購自SIGMA○R 。 - 2-Bromohexadecanoic acid (PPAR β 活化劑；PPAR β agonists) ，購自 SIGMA ALDRICH○R 。

-胰島素增敏劑(Troglitazone； PPAR γ活化劑；PPAR γ agonists） ，購自 SIGMA○R^。。

-兔子血清 ( rabbit serum )，購自喜馬拉雅生物科技有限公司(Himalaya Biotech Ltd.)

- VEGF 抗體之血清 ( anti - VEGF serum ) ，購自喜馬拉雅生物科技有限 公司(Himalaya Biotech Ltd.)

- Angpt 1 抗體之血清 ( anti - Angpt 1 serum ) ，購自喜馬拉雅生物科技有 限公司(Himalaya Biotech Ltd.)

-促進內皮細胞生長之補充劑( Endothelial Cell Growth supplement；

ECGs ) ，購自 SIGMA○R

-硫化鋅 ( Zn；Zinc sulfide ) ，購自 SIGMA ALDRICH○R ) ，購自SIGMA○R -氯化鈷 ( Cobalt Chloride；CoCl₂

2+ ) ，購自SIGMA○R -硫化銅 ( Copper(II)sulfate；Cu

-硫酸亞鐵 ( Ferrous Sulfate；Fe ) ，購自和光純藥工業株式會社 -睪固酮 ( Testosterone；T ) ，購自 SIGMA Fluka

-雌二醇 (β- Estradiol；E2 ) ，購自 SIGMA○R -黃體激素 ( Progesterone；P4 ) ，購自 SIGMA○R

-胰島素生長因子 ( Insulin ) ，購自 SIGMA○R

-吳郭魚類胰島素生長因子-1 (Tilapia Insulin-Like growth factor-1；

IGF-1) ，吳郭魚 IGF-1(純度 90%，由中央研究院吳金冽老師提供) -鹼性纖維母細胞生長因子( basic Fibroblast growth factor；bEGF ) ，購自 Invitrogen Corporation, USA

2.2 基因選殖

2.2.1EDF-1 基因之選殖

利用NCBI 以序列相似性，挑選魚類(斑馬魚)基因作為設計變性引子 的模板。之後，以日本鰻cDNA 作為模板及設計之變性引子進行聚合脢 連鎖反應(PCR)，步驟為：

以梯度實驗測試適合的引子黏合(annealing)溫度 (若反應無條帶出現則返回重新設計引子)

↓

若有條帶出現則進行切膠純化(Viogene Gel-M Kit)

↓

以 yT&A 載體進行 T-A 選殖

(yT&ACloning Vector Kit, Yeastern Biotech Co., Ltd).

↓

以 Primers(M13F 及 M13R)進行 PCR 篩選菌落

↓

選殖出之菌落經培養後抽取質體，並以質體為模板分別作三管PCR 反

應，三管分別的引子為(目標基因 Forward+Reverse ; 僅有目標基因 Forward ; 僅有目標基因 Reverse)，此目的可檢驗三種可能結果：

1.確定選殖基因為該設計引子所選殖出

2.排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Forward 所選殖出

3. 排除可能在相同位子大小的條帶是由單一引子 Reverse 所選殖出

挑選檢驗無誤的質體送定序公司分析查核結果(若結果經分析不符則重 新設計引子)。定序結果若成功選殖出所需基因，則進行 5’RACE(Clontech) 及 3’RACE 實驗(Roche Applied Science, Germany)。

2.2.2 EDF-1 5’RACE

首先，製作日本鰻cDNA(Clontech)，取出 2 μl組織全RNA溶液並以 DEPC水稀釋二百倍，以分光光度計量測 260nm、280nm 和^{260 nm} / _{280 nm} UV 波長吸光值，計算出RNA的濃度(RNA量μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。

個別算出含有1 μg RNA所需的RNA溶液體積，以規格化(Normalize)所有 的樣本，利用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit User Manual透過 反轉錄合成所有mRNA的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 200 μl PCR tube中依序加入 1μg total RNA後，用DEPC水將總體積補至 3 μl，再 加入1 μl5’-CDS primerA及 1 μl SMART IL A oligo，將此反應溶液混合均 勻後，置於PCR 反應器中以 70℃加熱 2 分鐘後，快速置於冰上冷卻 2 分 鐘後，加入2 μl之 5X First-strand buffer、1 μl 之 20mM DTT、1 μl 之 10mM dNTP Mix及 3 μl 之MMLV reverse transcrptase，混合均勻並短暫離心後於

PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 1 小時 30 分鐘，快速置於冰上冷 卻2 分鐘後，加入 100μl之Tricine-EDTA buffer( 總反應體積為 110 μl )，

混合均勻並短暫離心後於PCR 反應器中，反應條件為 72℃反應 7 分鐘。

最後產物即為First-strand cDNAs，可用於基因選殖。

設計特異性 reverse 引子，以全組織 RNA 所轉錄的 cDNA(Clontech) 為模板，接著以10X UPM 和特異性 reverse 引子進行 PCR 反應。往後步 驟如同2.1.1 ^{選殖基因方法。}

2.2.3 EDF-1 3’RACE

首先，取出2 μl組織全RNA溶液並以DEPC水稀釋二百倍，以分

光光度計量測260nm、280nm 和^{260 nm} / _{280 nm} UV波長吸光值，計算出RNA 的濃度(RNA量μg/ml= O.D.260×40×稀釋倍數)。個別算出含有 5 μg RNA 所需的RNA溶液體積，以規格化(Normalize)所有的樣本，利用

SuperScript^™II Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen Corporation, USA)透過 反轉錄合成所有mRNA的First-strand cDNAs：首先在RNase-free之 200 μl PCR tube 中依序加入 5μg total RNA後，用DEPC水將總體積補至 11 μl，

最後加入1 μl Vial 8 (Roche) 引子及 1 μl dNTP mix，將此反應溶液混合均 勻後，置於PCR 反應器中以 65℃加熱 5 分鐘後，快速置於冰上冷卻 1 分 鐘後，加入4 μl之 5X First-strand buffer、2.5 μl 之 0.1M DTT及 0.5 μl SuperScript^™II Rtase ( 總反應體積為 20 μl )，混合均勻並短暫離心後於 PCR 反應器中，反應條件為 42℃反應 52 分鐘，70℃反應 15 分鐘。最後 產物即為First-strand cDNAs。接下來，設計特異性Forward引子，以全組 織RNA所轉錄的cDNA為模板(Roche)，接著以Vial 9(Roche)和特異性

Forward引子進行PCR反應。往後步驟如同 2.1.1 選殖基因方法。

2.3 活體實驗

2.3.1 日本鰻(Anguilla japonica)來源與馴養環境

本實驗所使用的鰻魚購自鰻魚養殖場。為生長一至二年的日本鰻(Anguilla japonica)。實驗前馴養在由淡水鹽化成全海水約一星期，不餵食。

2.3.2 活體外源激素製備

2.3.2.1 鯰魚腦下垂體萃取液(Catfish Pituitary Exacts；CPE)

購自當地養殖場的泰國鯰魚腦下垂體(每顆約 4.2mg，保存於丙酮 中)，將其磨碎後，與磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate Buffered Saline；PBS)混 合均勻，儲存於-20℃中。施打日本鰻劑量約 2 顆腦下垂體/每公斤魚重

（KgBW）。

2.3.2.2 睪固酮(Testosterone)

購自 SIGMA-Fluka，將睪固酮溶於酒精後，再稀釋於磷酸鹽緩衝溶 液中，儲存於-20℃中。施打日本鰻劑量約 3μg 睪固酮/每公斤魚重 (KgBW)。

2.3.3 活體外源激素處理

將日本鰻以0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉後，在其腹部施打泰國鯰魚 腦下垂體萃取液，每週施打一次，並在其未施打泰國鯰魚腦下垂體萃取 液前以及在施打泰國鯰魚腦下垂體萃取液第3、6、9 針後的 72 小時採集 性腺和紅體組織。

另外，在日本鰻腹部施打泰國鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮混合

液，每週施打一次，並在第9 針後的 72 小時採集性腺和紅體組織。

2.3.4 GSI ⁰/0

和RMI

的測量

將日本鰻麻醉後，以秤測量其體重後，利用解剖器具將鰻魚性腺和 紅體組織取出後，以微量天秤秤重，利用下列公式計算出：

生殖腺重指數(Gonado-Somatic Index ; GSI)

*GSI ( ⁰/₀ ) = (生殖腺重/體重) ×100％

紅體重指數(Rete Mirabile Index ; RMI)

*RMI ( /0 ₀₀ ) = (紅體總重/體重) ×1000⁰/₀₀

2.3.5 組織全 RNA 的抽取

1.5 ml微量離心管(Eppendorf)中含研磨珠【此研磨珠泡於

DEPC(Diethyl Pyrocarbonate)水中，再以 37℃水浴中 6 小時，將DEPC水 倒掉，再以高溫高壓下滅菌15 分鐘後，置於 70℃烘箱中烘乾，保存於 4

℃以備使用】和500 μL TRI^® Reagent，再將日本鰻性腺組織或紅體組織 放入1.5 ml 微量離心管中，並置於冰上，以研磨震盪機將組織磨碎後，

以12000 rpm，4℃，離心 10 分鐘。使用微量滴管取上清液，移入新 1.5ml 微量離心管中，加入200 μL BCP或氯仿，輕輕搖晃混合均勻且靜置於室 溫10 分鐘後，以 12000 rpm，4℃，離心 15 分鐘。此時上層為水相(內含 RNA)，下層為有機相，兩相之間有白色的蛋白質層且包含DNA，小心地 吸取上清液，約200 μL上清液，移入新 1.5 ml 微量離心管中，加入 500 μL 異丙醇混合均勻後，輕輕搖晃混合均勻，以12000 rpm，4℃，離心 10 分 鐘。移去上清液，以500 μL 75%酒精清洗白色沉澱，吸除酒精後，放置 無菌操作臺中自然乾燥白色沉澱物，待其變半透明後，以DEPC水(此水

需經高溫高壓滅菌)溶解白色沉澱物，並保存於-70℃。

2.4 離體實驗 2.4.1 細胞樣品

將日本鰻以0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉後，依實驗需求取得紅體和 眼睛組織，並進一步取得紅體和眼睛之細胞。

2.4.2.紅體細胞的取得

在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶取8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml) 取8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液）中使用滅菌解剖剪去除結締組織並將組織剪碎後，

在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶取8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml) 取8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液）中使用滅菌解剖剪去除結締組織並將組織剪碎後，