第二章 材料與方法
2.9 細胞免疫染色
2.9.2 細胞免疫染色藥劑配置之製備
- 10 倍PBS： Na2HPO4 取 39.834g、KH2PO4 取 3g、NaCl取 85g，加入 500 mL的水，再調PH值到 7.4，再補水到 1000mL，將其以高溫高壓滅菌。
- 3.7％的福馬林(Paraformaldehyde）：
3.7g 的福馬林(購自 SIGMA)溶於 100g 的 PBS 中。
- 填塞緩衝溶液(Blocking buffer)：
1ml 的 gelatin(購自 SIGMA)、500μl 的 Triton X-100(購自 SIGMA) 補磷酸鹽緩衝溶液至50ml。
- PTEN long(購自 Himalaya Biotech Ltd.)和 PTEN short(購自 Himalaya Biotech Ltd.) ㄧ級抗體：
1/200 = PTEN ㄧ級抗體/填塞緩衝溶液 - 螢光二級抗體(購自 Gaithersburg,MD,USA)：
1/200 =螢光二級抗體/填塞緩衝溶液
2.10 統計方法
實驗數據計算的表示方法為平均值±平均標準誤差(mean±SEM)，實 驗數據結果以Student’s t-test 分析統計(SigmaPlot 2000,USA)。當 P<0.05(P value)時，視為有統計上的差異。
三、結果
3.1 EDF-1 基因選殖結果分析
目前已選殖出日本鰻的 EDF-1 部份基因序列，約 741 個鹼基，247 個胺基酸，內含3 端末端序列，目前剩 5 端末端的序列未完全選殖出來(圖 3)。利用 NCBI 基因資料庫進行胺基酸比對，發現與大西洋鮭魚(Salmo salar)的胺基酸序列最相近，約有 93％的相似度(圖 4)，其次為美洲胡瓜 魚(Osmerus mordax)，約有 89％的相似度。在多物種親緣性樹狀圖，也發 現與大西洋鮭魚最為相近(圖 5)。
3.2 基因表現分析最適當的 RT-PCR 反應週期數
利用鰻魚cDNA，以 RT-PCR 分析 cyto-b、PTEN long、PTEN short 和 EDF-1 基因的最適合 RT-PCR 反應的週期數，即呈產物與週期數直線 部份。從其得知 cyto-b 在 26~28 週期數中表現量最適當(圖 6A)；PTEN long 在28~32 週期數中表現量最適當(圖 6B)；PTEN short 在 28~30 週期數中 表現量最適當(圖 6C) ；EDF-1 在 32~34 週期數中表現量最適當(圖 6D)。
3.3 日本鰻器官組織分佈與 PTEN long、PTEN short 和 EDF-1
表現量之關係
觀察3 尾雄鰻，體重分別為 375、450.6 和 404.7 公克取得日本鰻的 十一種器官組織，其中包括眼睛、腦、大動脈、肝臟、紅體、前腎、後 腎、脾臟、心臟、肌肉和胰臟。將這十一種組織以RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現量，進而觀察其組織與 PTEN 和 EDF-1 表現量之關係。結
果顯示 PTEN long 在眼睛(51±1U)、腦(55±8U)、大動脈(59±3U)、後腎(53
±3U)、脾臟(56±0.4U)、心臟(60±10U)、肌肉(54±7U)和胰臟(56±7U)的表 現量較多，而在肝臟(35±7.5U)、紅體(40±1U)和前腎(43±3U)的表現量則 較少(圖 7A)。PTEN short 在大動脈(78±18U)、後腎(78±17U)和心臟(82±
0.9U)的表現量較多，而在眼睛(53±1U)、肝臟(43±10U)、紅體(53±1U)和 前腎(56±6U)的表現量則較少(圖 7B)。EDF-1 在大動脈中表現量最多(1.22
±0.2U)，其次是心臟(2±0.16U)、肌肉(2.07±0.52U)和胰臟(2.15±0.48U)，而 在脾臟中表現量最少(0.61±0.03U)，且與在大動脈中相差約四倍(圖 7C)。
3.4 不同體重大小的養殖日本鰻其紅體與 PTEN 和 EDF-1 基因
的關係
觀察18 尾日本鰻，以體重分為三組，分別為 100~200、200~300、
300~400 公克，每組各六尾，而其體重大小與體內紅體組織的相關性，結 果顯示RMI值會隨著其體重增加而增加(r2=0.6348；圖 8A)。
隨之，以RT-PCR分析PTEN和EDF-1 表現量，進而觀察其RMI值與 PTEN和EDF-1 表現量之關係。結果顯示PTEN long會隨著其RMI值增加 而增加表現量的趨勢(r2=0.009267；圖 8B)，而PTEN short也隨著其RMI 值增加而增加表現量的趨勢 (r2=0.0040412；圖 8C)。EDF-1 會隨著其RMI 值增加而增加其表現量(r2=0.0878；圖 8D)。
3.5 雌鰻以外源激素進行催熟過程中與 PTEN 和 EDF-1 基因的
關係
進行本實驗需購得約 60 尾日本鰻，且實驗前馴養在由淡水鹽化成全 海水約一星期，且不餵食，並每週施打外源激素，共施打九針。
第一次實驗分為四組，分別為未施打外源激素(0 針)以及施打鯰魚腦 下垂體萃取液第3、6、9 針後 72 小時採樣，稱為 0 針組、3 針組、6 針 組、9 針組，並以 RT-PCR 分析紅體和卵巢組織之 PTEN 和 EDF-1 表現 量。
第二次實驗分為五組，分別為未施打外源激素(0 針)、施打鯰魚腦下 垂體萃取液第3、6、9 針以及施打鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮之混合 液第9 針後 72 小時採樣，稱為 0 針組、3 針組、6 針組、9 針組和 9 針 +T 組，並以 RT-PCR 分析紅體和卵巢組織之 PTEN 和 EDF-1 表現量。
3.5.1 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的紅體組織與
PTEN 和 EDF-1 基因的關係
兩次實驗結果顯示在催熟過程中，會隨著施打鯰魚腦下垂體萃取液 的針數增加，而增加其紅體組織(RMI値)發育(圖 9A、B)。隨之，觀察其 PTEN和EDF-1 表現量與RMI值的關係；兩次實驗結果顯示其RMI值增加 則會使PTEN long(r2=0.1828；r2=0.0908) (圖 9C、D、E、F)、PTEN
short(r2=0.303；r2=0.0759) (圖 9G、H、I、J)和EDF-1(r2=0.0327；r2=0.2359) (圖 9K、L、M、N)表現量都有增加的趨勢。
3.5.2 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體進行催熟過程中的卵巢組織與
PTEN 和 EDF-1 基因的關係
兩次實驗結果顯示在催熟過程中，會隨著施打鯰魚腦下垂體萃取液 的針數增加，而增加其卵巢組織(GSI値)發育 (圖 10A、B)。隨之，觀察
其PTEN和EDF-1 表現量；第一次實驗結果顯示在 6 針組會增加其PTEN long(比 0 針組增加 1.364 倍)(圖 10C)和PTEN short(比 0 針組增加 1.135 倍) (圖 10G)表現量，但在 9 針組時則抑制PTEN long(比 0 針組減少 0.827 倍) 和PTEN short(比 0 針組減少 0.589 倍)表現量，但是隨著卵巢組織(GSI値) 發育增加，會抑制PTEN long（r2=0.0311）和PTEN short表現量（r2=0.0693）
(圖 10D、H)。而在第二次實驗結果顯示施打萃取液會抑制其PTEN long 表現量(3 針比 0 針組減少 0.64 倍，6 針比 0 針組減少 0.48 倍，9 針比 0 針組減少0.93 倍)(圖 10E)，而在 3 針組、6 針組，會抑制PTEN short表現 量(3 針比 0 針組減少 0.67 倍，6 針比 0 針組減少 0. 8 倍)，但在 9 針組時 會增加其PTEN short表現量(比 0 針組增加 1.75 倍) (圖 10I)，但是隨著卵 巢組織(GSI値)發育增加，會抑制PTEN long表現量（r2=0.0628）(圖 10F)，
而刺激PTEN short表現量（r2=0.1041）(圖 10J)。在兩次實驗結果顯示催 熟過程中會抑制其EDF-1 表現量(3 針比 0 針組減少 0.66 倍，6 針比 0 針 組減少0.45 倍，9 針比 0 針組減少 0.88 倍) (圖 10K)，但但是隨著卵巢組 織(GSI値)發育增加，會抑制EDF-1 表現量（r2=0.0665）(圖 10L)。
3.5.3 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體萃取液和鯰魚腦下垂體+睪固酮
之混合液進行催熟過程中的紅體組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的 關係
結果顯示在催熟過程中，在施打添加睪固酮之混合液與未添加的紅 體(RMI 値分別為 0.5465±0.14U、0.5696±0.0611U)發育並沒有明顯差異(圖 11A)。隨之，觀察其 PTEN 和 EDF-1 表現量；結果顯示在施打添加睪固 酮之混合液比未添加的紅體，其明顯抑制 PTEN long、PTEN short 和
EDF-1 表現量(圖 11C、D、E)，且 9 針+T 組比 9 針組的 PTEN long 表現 量減少約0.47 倍(圖 11C)，9 針+T 組比 9 針組的 PTEN short 表現量減少 約0.28 倍(圖 11D)，9 針+T 組比 9 針組的 EDF-1 表現量減少約 0.45 倍(圖 11E)。
3.5.4 分析雌鰻以鯰魚腦下垂體萃取液和鯰魚腦下垂體+睪固酮
之混合液進行催熟過程中的卵巢組織與 PTEN 和 EDF-1 基因的 關係
結果顯示在催熟過程中，在施打添加睪固酮之混合液比未添加的卵 巢(GSI 値)發育更為明顯，且 9 針+T 組比 9 針組的卵巢發育(GSI 値)約增 加1.67 倍(圖 11B)。隨之，觀察其 PTEN 和 EDF-1 表現量；結果顯示在 施打添加睪固酮之混合液比未添加的卵巢，其明顯抑制 PTEN long、PTEN short 和 EDF-1 表現量(圖 11F、G、H)，而 9 針+T 組比 9 針組的 PTEN long 表現量減少約0.26 倍(圖 11F)，9 針+T 組比 9 針組的 PTEN short 表現量 減少約0.28 倍(圖 11G)，9 針+T 組比 9 針組的 EDF-1 表現量減少約 0.4 倍(圖 11H)。
3.6 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢和紅體組織之切片
染色
將雌鰻每週施打外源激素進行催熟。首先，實驗取樣分為五組，分 別為未施打外源激素(0 針)、施打鯰魚腦下垂體萃取液第 3、6、9 針以及 施打鯰魚腦下垂體萃取液和睪固酮之混合液第9 針後 72 小時採樣，稱為 0 針組、3 針組、6 針組、9 針組和 9 針+T 組，再進行蘇木精伊紅染色
(Hematoxylin and Eosin Stain；HE Stain)和免疫組織化學染色 (Immunochistochemistry Stain；IHC Stain)。
3.6.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之切片染色 3.6.1.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之 HE 染色
首先，將實驗樣本之紅體組織進行 HE 染色，結果顯示在紅體組織 的微血管中央有觀察到紅色的染色情形，且未紅色的中央也有觀察到藍 紫色的染色情形(圖 12A、B、C；分別為 0 針、6 針、9 針+T)。
3.6.1.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的紅體組織之 IHC 染
色
將實驗樣本之紅體組織進行IHC染色，若組織具有PTEN long和PTEN
short表現，則會呈現褐色。結果顯示在紅體組織之微血管管壁都有觀察 到PTEN long和PTEN short的染色情形。另外，在 0 針、6 針和 9 針+T 之紅體組織進行IHC染色，並以不接上一抗(為negative control)，結果顯 示在紅體組織上無任何顏色呈現(圖 12D、E、F)，只觀察到紅體的結構。
進一步觀察，當紅體組織之 PTEN long mRNA 表現量，分別為高、
低時，結果顯示其紅體組織之微血管管壁所觀察到PTEN long 的免疫反 應染色情形呈正相關 (圖 12G、H 和 I、J)。另外，觀察 9 針+T 之紅體組 織進行IHC 染色，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量最低，但是 PTEN long 的 IHC 染色情形呈現卻是高表現(圖 12K、L、M)。
當紅體組織之 PTEN short mRNA 表現量，分別為高、低時，結果顯 示其紅體組織之微血管管壁所觀察到PTEN short 的免疫反應染色情形呈 正相關 (圖 12N、O 和 P、Q)。另外，觀察 9 針+T 之紅體組織進行 IHC
染色，結果顯示其 PTEN short mRNA 表現量最低，但是 PTEN short 的 IHC 染色情形呈現卻是高表現(圖 12R、S、T)。
3.6.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之切片染色 3.6.2.1 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之 HE 染色
首先，將實驗樣本之卵巢組織進行 HE 染色，結果顯示在濾泡核仁 有觀察到紅色的染色情形，但都未觀察到藍紫色的染色情形(圖 13A、B；
分別為0 針組、6 針組)，而其 0 針組卵徑大小約為 100~200μm，6 針組 卵徑大小約為200~300μm。在 9 針+T 的卵巢組織，在卵細胞周圍和卵巢 之濾泡層都有觀察到紅色的染色情形，但也未觀察到藍紫色的染色情形 (圖 13C)，其卵徑大小約為 300~400μm。
3.6.2.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組職之 IHC 染
色
將實驗樣本之卵巢組織進行IHC染色，若組織具有PTEN long和PTEN
short表現，則會呈現褐色。結果顯示在卵巢之濾泡層都有觀察到PTEN long和PTEN short的染色情形。另外，在 0 針、6 針和 9 針+T之卵巢組 織進行IHC染色，並以不接上一抗(為negative control)，結果顯示在卵巢 組織上無任何顏色呈現(圖 13D、E、F)，只觀察到卵巢的結構。
進一步觀察，當卵巢組織之 PTEN long mRNA 表現量，分別為高、
中等、低時，結果顯示其卵巢之濾泡層所觀察到PTEN long 的染色情形，
反而為低、中等、高(圖 13G、H、I)。另外，觀察 9 針+T 之卵巢組織進 行IHC 染色，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量最低，而且 PTEN long 的IHC 染色情形也呈現最低(圖 13J、K、L)。
當卵巢組織之 PTEN short mRNA 表現量，分別為高、中等、低時，
結果顯示其卵巢之濾泡層所觀察到PTEN short 的染色情形，反而為低、
中等、高(圖 13M、N、O)。另外，觀察 9 針+T 之卵巢組織進行 IHC 染 色，結果顯示其 PTEN short mRNA 表現量最低，而且 PTEN short 的 IHC 染色情形也呈現最低(圖 13P、Q、R)。
3.7 分析長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化
將紅體細胞培養於含 10％胎牛血清之培養液中，每週抽取紅體細胞 mRNA，並以 RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現量。
第一次實驗進行七週，在 2~7 週抽取紅體細胞 mRNA，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量在第三週明顯增加(比第二週增加 2.02 倍)(圖 14A)。PTEN short mRNA 表現量都沒有明顯差異，但在第七週時，則明 顯減少其表現量(比第二週減少 0.7 倍) (圖 14C)。EDF-1 mRNA 表現量也 沒有明顯差異，除了在第三週時，有減少其表現量(比第二週減少 0.68 倍) (圖 14E)。
第二次實驗進行八週，在 2~8 週抽取紅體細胞 mRNA，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量在第三週有減少(比第二週減少 0.71 倍)，但在第 四週明顯增加(比第二週增加 1.24 倍)，接著又慢慢減少(第五週比第二週 減少0.91 倍，第六週比第二週減少 0.71 倍，第七週比第二週減少 0.66 倍，第八週比第二週減少0.87 倍) (圖 14B)。PTEN short mRNA 表現量在 第四週明顯增加(比第二週增加 1.84 倍)，接著又慢慢減少(第五週比第二 週增加1.84 倍，但比第四週減少 0.68 倍，第六週比第二週增加 1.26 倍，