離子(硫酸亞鐵,F E )與 PTEN LONG 和 PTEN SHORT 螢光表現的

3.20.2 離子(硫酸亞鐵,Fe)與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現

的關係

分別以PBS(10 μl)、Fe (10^-8 M、10^-7 M、10^-6 M)處理紅體細胞三天，

結果顯示在Fe作用下，對於PTEN long免疫反應的強度(圖 44B、F、J、N、

Q)和PTEN short免疫反應的強度(圖 44D、H、L、P、R)沒有太大差異。

四、討論

4.1 日本鰻 EDF-1 基因

^文獻指出EDF-1 是一個低分子量的多胜肽，從酵母菌到人類其序列 具有高度保留性，且在人類的心臟和胰臟觀察到具高度表現(Kabe et al.,1999)。而我們選殖出日本鰻的 EDF-1 部份基因序列，約 741 個鹼基，

247 個胺基酸，內含 3 端末端序列，目前剩 5 端末端的序列未完全選殖出 來(圖 3)。利用 NCBI 基因資料庫進行胺基酸比對，發現與大西洋鮭魚 (Salmo salar)的胺基酸最相近，約有 93％的相似度(圖 4)，其次為美洲胡 瓜魚(Osmerus mordax)，約有 89％的相似度。在多物種親緣性樹狀圖，也 發現與大西洋鮭魚最為相近(圖 5)。且在日本鰻器官組織中 EDF-1 基因在 大動脈中表現量最多，其次是心臟、肌肉和胰臟(圖 7C)。EDF-1 基因在 不同的組織具有不同的表現強度，其生理意義要進一步的了解。

4.2 日本鰻器官組織分佈與 PTEN long 和 PTEN short 表現量之

關係

我們以 RT-PCR 分析 PTEN long 和 PTEN short 表現量，進而觀察鰻 魚組織與 PTEN long 和 PTEN short 表現量之關係。發現 PTEN long 在眼 睛、腦、大動脈、後腎、脾臟、心臟、肌肉和胰臟的表現量較多，而在 肝臟、紅體和前腎的表現量則較少(圖 7A)。PTEN short 在大動脈、後腎 和心臟的表現量較多，而在眼睛、肝臟、紅體和前腎的表現量則較少(圖 7B)。不同的鰻魚器官組織具有不同的 PTEN 基因表現強度，其生理意義 並不清楚。

4.3 不同體重大小的養殖日本鰻其紅體與 PTEN 和 EDF-1 基因

的關係

觀察 18 尾日本鰻，其體重大小與體內紅體組織的相關性，結果顯示 RMI 值會隨著其體重增加而增加(圖 8A)與 Yamada 和陳等人(陳, 2007；

Yamada et. al., 2001)的結果一致。以 RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現 量，結果顯示 PTEN 表現量會隨著其紅體發育(RMI 值)而增加其表現量的 趨勢，但這與陳(陳, 2007)的結果不一致，於 2007 年，陳之研究論文中，

發現 PTEN 表現量與生長總重的相關性呈負相關。文獻指出在內皮細胞 中，PTEN 已被證實會負調控 PI3K-AKT 的訊息傳遞路徑，進而拮抗血管 新生(Huang and Kontos, 2002)。而 PTEN 對於日本鰻紅體在正常發育的情 況下，其 PTEN 表現量應該與生長因子維持恆定的表現量，避免血管新 生與細胞增殖作用過度生長。所以我們推測生長因子與抑制因子以動態 平衡調節生理作用(Hanahan and Folkman., 1996)，當生長因子啟動組織增 長的引擎，而抑制因子則如煞車系統隨時調控組織增長狀態以維持組織 的正常發育。

另外，文獻指出 EDF-1 會抑制細胞分化，在細胞增殖持續情況下會 增加EDF-1 表現，而細胞靜置狀態下會抑制 EDF-1 表現(Bernardini et al., 2005)。我們觀察到當鰻魚的紅體發育的情況下，會使 EDF-1 基因表現量 增加。我們推測EDF-1 會抑制鰻魚的紅體過度發育。

4.4 雌鰻以外源激素進行催熟過程中與 PTEN 和 EDF-1 的關係

以鯰魚腦下垂體催熟過程中，會增加其紅體(RMI 値)組織發育 (圖

9A、B)。且 PTEN long(圖 9C、D、E、F)、PTEN short(圖 9G、H、I、J) 和 EDF-1(圖 9K、L、M、N)表現量都有增加的趨勢。與不同體重大小的 養殖日本鰻其紅體的 PTEN 和 EDF-1 基因表現量的趨勢相同。隨之，紅 體組織進行IHC 染色，觀察紅體組織之微血管管壁，發現 PTEN long 與 PTEN short 的免疫染色情形與其紅體的 PTEN 基因表現量呈正相關。鯰 魚腦下垂體促進紅體組織發育，而 PTEN 和 EDF-1 基因表現量以及 PTEN 之IHC 染色，隨著紅體(RMI 値)組織發育，增加其表現。反之，以鯰魚 腦下垂體催熟過程中，會增加其卵巢(GSI 値)發育(圖 10A、B)。而 PTEN long 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育成負相關，但是 PTEN short 基 因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育的正負相關性較不一致。而 EDF-1 基 因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育成負相關。隨之，卵巢(GSI 値)組織進 行IHC 染色，而依據(山本等,1974)所述之日本鰻卵細胞分期，共分為十 期，第一期為卵原細胞期(0ogonia stage)，卵徑約 10~20 μm 左右；第二期 為染色絲核仁期(Chromatin nucleolar stage)，卵徑約 55 μm 左右；第三期 為周邊核仁期(Perinucleolar stage)，卵徑約 99 μm 左右，細胞核周圍有許 多核仁顆粒；第四期為油滴期(Oildroplet stage)，卵徑約 120~150 μm 左 右，油滴由細胞質邊緣開始堆積，漸漸往細胞核周邊堆積，最後充滿整 個細胞質；第五期為第一卵黃球期(Primary yolk globule stage)，卵徑約 200~230 μm 左右，卵黃球開始在細胞質邊緣堆積；第六期為第二卵黃球 期(Secondary yolk globule stage)，卵徑約 450 μm 左右，卵黃球繼續堆積；

第七期為第三卵黃球期(Tertiary yolk globule stage)，卵徑約 600 μm 左右，

卵黃球堆積充滿整個細胞質；第八期為核移動期(Migratory nucleus

stage)，卵徑約 750-850 μm 左右，細胞核往邊緣移動，準備進行減數分裂；

第九期為最後成熟期(Final maturation stage)，卵徑約 900-1070 μm 左右，

細胞核消失進行減數分裂；第十期為排卵期(ovulating stage)，成熟透明的 卵細胞由濾泡中排出。結果顯示，其PTEN 會在卵巢的濾泡層被觀察到 免疫反應染色情形，而我們發現 PTEN mRNA 表現量與 PTEN 之 IHC 染 色呈負相關。我們推測在催熟過程中，卵巢(GSI 値)組織持續發育時，

PTEN 的表現下降，但是當卵巢(GSI 値)組織發育近乎成熟時，PTEN 則 又會啟動其功能，進而調節正常的發育情形。PTEN long 和 PTEN short 基因表現量與免疫染色反應強度呈負相關，推測在卵巢，PTEN 的轉錄和 轉譯是分開。。

文獻指出注射外源性的鮭魚腦下垂體研磨液可促進卵巢從卵原細胞 至成熟卵細胞一連串卵黃蓄積過程，甚至達吸水卵階段，顯示在催熟過 程中注射外源性的鮭魚腦下垂體研磨液是必要的。但單獨使用鮭魚腦下 垂體研磨液處理組卵胞卵徑頻度分佈廣，呈現雙峰且非同步化現象，單 獨施打甲基睪固酮(17α-methyltestosterone ,17MT)或雌二醇

(Estradiol-17β,E2)處理組則對卵黃蓄積效果不大。外源性性類固醇，尤其 為甲基睪固酮併用鮭魚腦下垂體研磨液確實可促進日本鰻的卵巢發育至 卵黃蓄積甚至達吸水卵之階段，卵徑頻度呈單峰之同步化現象(王, 1999)。我們以鯰魚腦下垂體+睪固酮之混合液進行催熟，發現以含有睪 固酮之混合液與未含睪固酮之混合液催熟，紅體(RMI 値)發育沒有太大 差異，但是 PTEN 和 EDF-1mRNA 表現量卻明顯受到抑制，但是 PTEN 之IHC 染色卻與 PTEN mRNA 表現量呈負相關。在催熟過程中，添加睪

固酮之混合液比未添加的使卵巢(GSI 値)發育更為明顯，而 PTEN 和 EDF-1mRNA 表現量卻明顯受到抑制，而卵巢組織進行 IHC 染色，其 PTEN 會在卵巢的濾泡層被觀察到染色情形，也與 PTEN mRNA 表現量 呈正相關。

以兩種方式催熟(添加和無添加睪固酮)過程中推測，當紅體(RMI 値) 組織發育，其 PTEN mRNA 表現量和蛋白質都會增加，但是添加睪固酮 促使紅體(RMI 値)組織發育，卻會抑制 PTEN mRNA 表現量；而當卵巢 (GSI 値)發育，PTEN long 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育成負相關，

但是 PTEN short 基因表現量與卵巢組織(GSI 値)發育的相關性較不一 致。而PTEN 蛋白質會受到抑制。這似乎也代表著 PTEN 在不同的組織 中作用的方式會有所不同。另外，在只以鯰魚腦下垂體催熟過程中，刺 激紅體(RMI 値)發育，也同時刺激 EDF-1mRNA 表現量增加，但是以鯰 魚腦下垂體+睪固酮之混合液進行催熟，卻抑制 EDF-1mRNA 表現量，而 紅體(RMI 値)發育卻沒有持續增加；但在以兩種方式催熟過程中，發現 卵巢(GSI 値)發育中，EDF-1mRNA 表現量會受到抑制。所以，我們推測 在發育的情況下，會抑制 EDF-1mRNA 表現量，而不發育的情況下，則 會增加 EDF-1mRNA 表現量。催熟過程中，發現以有添加睪固酮之混合 液進行催熟，會抑制 EDF-1mRNA 表現量。

4.5 長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化

將紅體細胞培養於含10％胎牛血清之培養液中，培養至七或八周，

並每週抽取紅體細胞mRNA，並以 RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現量。

發現會在三或四週時會，PTEN long 表現量會增加，在四週時以及六或七 週時，PTEN short 表現量會增加。我們推測對於 PTEN 基因而言似乎約 2~3 週就會有一個週期性的波動，而且 PTEN long 和 PTEN short 對於調 節紅體細胞的生長似乎是不一樣的。

反之，在此期間，對於 EDF-1 基因而言似乎沒有太大影響其表現量。

當微血管內皮細胞於增殖的狀況下，會增加EDF-1 表現(Dragoni et al., 1998)。我們推測在紅體細胞可能為不分化的狀態，使得 EDF-1 表現量維 持恆定。

4.6 PTEN long 與 PTEN short 之差異性

報告指出日本鰻 PTEN 基因有兩種異構物存在，分別稱為 PTEN Long-以及 Short-form，序列中有兩段明顯的差異片段，一為長鏈較短鏈 PTEN 多出 69 個鹼基(23 個胺基酸)，另一個為高度差異性的區域。(陳, 2007)。而且缺失片段與斑馬魚 PTEN b form 完全吻合，缺失的胜肽片段 似乎有幫助蛋白摺疊的功能(Croushore et al., 2005)，而高度變異區則可能 與 PTEN C2 區域鍵結膜上的作用位有關(Lee et al., 1999)。免疫染色反應 結果顯示，PTEN long 蛋白質會在紅體細胞的細胞核周圍表現，我們推測 可能是在高爾基氏體表現，而PTEN short 在紅體細胞的免疫反應比較沒 有專一性，似乎會在全細胞中都有表現。另外，我們將紅體細胞培養於 第十一天後，以PBS、DMSO、PPAR agonist 以及鋅離子處理紅體細胞，

發現PTEN short 蛋白質會聚集在細胞核表現，也會像 PTEN long 蛋白質 一樣，在細胞核周圍具有其免疫活性。在老鼠實驗中發現PTEN 同源染

色體PTEN 2，而 PTEN 2 比 PTEN 多出 31 個胺基酸。PTEN 2 由延長胺 基末端區域四個可能跨膜構形、脂質磷酸酶區域和可能脂質結合C2 區域 組成。PTEN 2 唯有在老鼠的睪丸和第二精母細胞表現，且會經由胺基末 端跨膜區與高爾基氏體結合(Yan et al., 2001)。

4.7 DMSO 與 PTEN 以及 EDF-1 表現量的關係

分別以 PBS 和 DMSO 處理紅體細胞 6、12、24 小時，以 RT-PCR 分 析 PTEN 和 EDF-1 表現量，結果顯示在 6 小時，PTEN long(圖 15A)、PTEN short(圖 15B)和 EDF-1(圖 15C)表現量會隨著 DMSO 劑量增加而增加其表 現量。在12 和 24 小時，PTEN long(圖 15D、G)、PTEN short(圖 15E、

H)和 EDF-1(圖 15F、I)表現量則不會受到 DMSO 劑量影響。但在 24 小時，

PTEN long 和 PTEN short 表現量，兩者卻出現明顯差距，故再進一步進 行實驗。分別以PBS(5μl/ml)與 DMSO(5μl/ml)處理紅體細胞 12、24、48 小時，結果顯示在12、24、48 小時，PTEN short(圖 16A、C、E)比 PTEN long(圖 16B、D、F)表現量，大約多出 0.5~1 倍左右。隨之，分別以 PBS(10μl/ml)、DMSO(2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml)處理紅體細胞 12 小時，

結果顯示PTEN long(圖 17B、F、J、N、Q)和 PTEN short(圖 17D、H、L、

P、R)免疫反應的強度不會受到 DMSO 劑量影響。由以上結果推測在 12

P、R)免疫反應的強度不會受到 DMSO 劑量影響。由以上結果推測在 12