第三章 結果
3.6 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢和紅體組織之切片染色
3.6.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組織之切片染色
首先，將實驗樣本之卵巢組織進行 HE 染色，結果顯示在濾泡核仁 有觀察到紅色的染色情形，但都未觀察到藍紫色的染色情形(圖 13A、B；
分別為0 針組、6 針組)，而其 0 針組卵徑大小約為 100~200μm，6 針組 卵徑大小約為200~300μm。在 9 針+T 的卵巢組織，在卵細胞周圍和卵巢 之濾泡層都有觀察到紅色的染色情形，但也未觀察到藍紫色的染色情形 (圖 13C)，其卵徑大小約為 300~400μm。
3.6.2.2 雌鰻以外源激素進行催熟過程中的卵巢組職之 IHC 染
色
將實驗樣本之卵巢組織進行IHC染色，若組織具有PTEN long和PTEN
short表現，則會呈現褐色。結果顯示在卵巢之濾泡層都有觀察到PTEN long和PTEN short的染色情形。另外，在 0 針、6 針和 9 針+T之卵巢組 織進行IHC染色，並以不接上一抗(為negative control)，結果顯示在卵巢 組織上無任何顏色呈現(圖 13D、E、F)，只觀察到卵巢的結構。
進一步觀察，當卵巢組織之 PTEN long mRNA 表現量，分別為高、
中等、低時，結果顯示其卵巢之濾泡層所觀察到PTEN long 的染色情形，
反而為低、中等、高(圖 13G、H、I)。另外，觀察 9 針+T 之卵巢組織進 行IHC 染色，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量最低，而且 PTEN long 的IHC 染色情形也呈現最低(圖 13J、K、L)。
當卵巢組織之 PTEN short mRNA 表現量，分別為高、中等、低時，
結果顯示其卵巢之濾泡層所觀察到PTEN short 的染色情形，反而為低、
中等、高(圖 13M、N、O)。另外，觀察 9 針+T 之卵巢組織進行 IHC 染 色，結果顯示其 PTEN short mRNA 表現量最低，而且 PTEN short 的 IHC 染色情形也呈現最低(圖 13P、Q、R)。
3.7 分析長期紅體細胞培養其 PTEN 和 EDF-1 的變化
將紅體細胞培養於含 10％胎牛血清之培養液中，每週抽取紅體細胞 mRNA，並以 RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現量。
第一次實驗進行七週，在 2~7 週抽取紅體細胞 mRNA，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量在第三週明顯增加(比第二週增加 2.02 倍)(圖 14A)。PTEN short mRNA 表現量都沒有明顯差異，但在第七週時，則明 顯減少其表現量(比第二週減少 0.7 倍) (圖 14C)。EDF-1 mRNA 表現量也 沒有明顯差異，除了在第三週時，有減少其表現量(比第二週減少 0.68 倍) (圖 14E)。
第二次實驗進行八週，在 2~8 週抽取紅體細胞 mRNA，結果顯示其 PTEN long mRNA 表現量在第三週有減少(比第二週減少 0.71 倍)，但在第 四週明顯增加(比第二週增加 1.24 倍)，接著又慢慢減少(第五週比第二週 減少0.91 倍，第六週比第二週減少 0.71 倍，第七週比第二週減少 0.66 倍，第八週比第二週減少0.87 倍) (圖 14B)。PTEN short mRNA 表現量在 第四週明顯增加(比第二週增加 1.84 倍)，接著又慢慢減少(第五週比第二 週增加1.84 倍，但比第四週減少 0.68 倍，第六週比第二週增加 1.26 倍，
但第四週減少0.61 倍)，在第七週時又明顯增加(比第二週增加 1.92 倍)，
而在第八週時，又減少其表現量(比第二週增加 1.65 倍，但比第七週減少 0.86 倍) (圖 14D)。EDF-1 mRNA 表現量也沒有明顯差異，但在第七週時，
有增加其表現量(比第二週增加 3.08 倍) (圖 14F)。
3.8 與 DMSO 作用的關係
3.8.1 分析 DMSO 與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
分別以PBS(10μl/ml)、DMSO(2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml)處理紅體細 胞6、12、24 小時，以 RT-PCR 分析 PTEN 和 EDF-1 表現量，結果顯示 在6 小時，PTEN long(與控制組比分別增加 1.32 倍、1.94 倍、2.09 倍)(圖 15A)、PTEN short(與控制組比分別增加 1.25 倍、1.65 倍、1.53 倍) (圖 15B) 和 EDF-1(與控制組比分別增加 1.25 倍、1.73 倍、1.86 倍) (圖 15C)表現量 會隨著DMSO 劑量增加而增加其表現量。在 12 和 24 小時，PTEN long(圖 15D、G)、PTEN short(圖 15E、H)和 EDF-1(圖 15F、I)表現量則不會受到 DMSO 劑量影響。但在 24 小時，PTEN long 和 PTEN short 表現量，兩者 卻出現明顯差距，故再進一步進行實驗。
分別以 PBS(5μl/ml)與 DMSO(5μl/ml)處理紅體細胞 12、24、48 小時，
結果顯示在12、24、48 小時，PTEN short(圖 16A、C、E)比 PTEN long(圖 16B、D、F)表現量，大約多出 0.5~1 倍左右。
3.8.2 PPAR agonists 與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的關
係
分別以 PBS(10μl/ml)、DMSO(2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml)處理紅體細
胞12 小時，結果顯示 PTEN long(圖 17B、F、J、N、Q)和 PTEN short(圖 17D、H、L、P、R)免疫反應的強度不會受到 DMSO 劑量影響。
3.9 與 PPAR agonists 作用的關係
3.9.1 分析 PPAR agonists 與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
分別以DMSO(5μl)、PPAR α agonist(10μM)、PPAR β/δ
agonist(10μM)、PPAR γ agonist(10μM)處理紅體細胞 12 小時，再以 RT-PCR 分析其 PTEN 和 EDF-1 表現量。
結果顯示在PPAR α agonist 刺激作用下，對於 PTEN long 表現量沒有 影響；在PPAR β/δ agonist 作用下，會使 PTEN long 表現量增加(比控制 組增加1.18 倍)；而在 PPAR γ agonist 作用下，PTEN long 表現量明顯增 加(比控制組增加 1.63 倍) (圖 18A)。在 PPAR α agonist 作用下，PTEN short 表現量有增加的趨勢(比控制組增加 1.14 倍)；在 PPAR β/δ agonist 作用 下，會使 PTEN short 表現量增加(比控制組增加 1.21 倍)；而在 PPAR γ agonist 作用下， PTEN short 表現量明顯增加(比控制組增加 1.47 倍) (圖 18B)。在 PPAR α agonist 作用下，EDF-1 表現量增加(比控制組增加 1.11 倍)；在 PPAR β/δ agonist 作用下，會使 EDF-1 表現量有增加的趨勢(比控 制組增加1.04 倍)；而在 PPAR γ agonist 作用下，EDF-1 表現量明顯增加 (比控制組增加 1.24 倍) (圖 18C)。
3.9.2 PPAR agonists 與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的關
係
分別以DMSO(5μl/ml)、PPAR α agonist(10μM)、PPARβ/δ
agonist(10μM)、PPAR γ agonist(10μM)處理紅體細胞 12 小時，結果顯示 在PPAR α agonist、PPAR β agonist 和 PPAR γ agonist 作用下，PTEN long 免疫反應的強度都有增加的趨勢(與控制組比分別增加 1.08 倍、1.19 倍、
1.32 倍) (圖 19 B、F、J、N、Q)。在 PPAR α agonist 和 PPAR β/δ agonist 作用下，會使PTEN short 免疫反應的強度增加(與控制組比分別增加 1.31 倍、1.38 倍)；而在 PPAR γ agonist 作用下，PTEN short 螢光表現會明顯 增加(比控制組增加 1.62 倍) (圖 19C、G、K、O、R)。
3.10 與內皮細胞生長補充劑作用的關係
3.10.1 分析內皮細胞生長補充劑與 PTEN、EDF-1 表現量的關
係
分別以PBS(100 μl/ml)、內皮細胞生長補充劑(Endothelial Cell Growth supplement；ECGs；75 μg、150 μg、300 μg)處理紅體細胞 12 小時，再以 RT-PCR 分析其 PTEN 和 EDF-1 表現量。結果顯示在 ECGs 作用下，會抑 制 PTEN long 表現量(與控制組比分別減少 0.65 倍、0.75 倍、0.85 倍)，
但是隨著劑量的增加抑制的效果卻有變差的趨勢(圖 20A)。在劑量為 75 μg 的 ECGs 作用下，會抑制 PTEN short 表現量(比控制組減少 0.89 倍)，
而在劑量為150 μg 的 ECGs 作用下，則明顯抑制 PTEN short 表現量(比控 制組減少0.72 倍)，但是在劑量為 300 μg 的 ECGs 作用下，卻增加 PTEN short 表現量(比控制組增加 1.08 倍) (圖 20B)。在劑量為 75 μg 的 ECGs 作用下，會抑制 EDF-1 表現量(比控制組減少 0.87 倍)，而在劑量為 150 μg 的ECGs 作用下，則明顯增加 EDF-1 表現量(比控制組增加 1.67 倍)，但
是在劑量為300 μg 的 ECGs 作用下，增加 EDF-1 表現量(比控制組增加 1.39 倍)卻沒有劑量為 150 μg 的 ECGs 作用效果好(圖 20C)。
3.10.2 內皮細胞生長補充劑與 PTEN long 和 PTEN short 螢光
表現的關係
分別以PBS(50 μl/ml)、ECGs(150 μg)處理紅體細胞 12 小時，結果顯 示在ECGs 作用下，對於 PTEN long(圖 21B、D、I)和 PTEN short(圖 21F、
H、J) 免疫反應的強度沒有明顯差異。
3.11 與生長因子(IGF-1)作用的關係
3.11.1 分析生長因子(IGF-1)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
分別以PBS(10 μl/ml)、IGF-1(10-9 M、10-8 M、10-7 M)處理紅體細胞
24 小時，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量，且重覆兩次實驗。
第一次實驗結果顯示在IGF-1 作用下，對於PTEN long(分別為
164.39±27.86U、196.97±5.86U、160.38±5.1U、179±10.4U)、PTEN short(分 別為255.99±3.1U、247.77±26.21U、225.14±10.91U、248.16±10.12U)和 EDF-1(分別為 1.27±0.05U、1.32±0.1U、1.28±0.07U、1.08±0.23U)表現量，
沒有太大差異性，但是有呈現受IGF-1 作用抑制其表現量的趨勢(圖 22A、
C、E)。第二次實驗結果顯示在IGF-1 作用下，會抑制其PTEN long(比控 制組分別減少0.81 倍、0.85 倍、0.91 倍)、PTEN short(比控制組分別減少 0.89 倍、0.93 倍)和EDF-1(比控制組分別減少 0.83 倍、0.75 倍)的表現量 之趨勢 (圖 22B、D、F)，但是劑量為 10-7，卻會增加PTEN short(比控制 組增加1.04 倍)和EDF-1 (比控制組增加 1.49 倍)。
3.11.2 生長因子(IGF-1)與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的
關係
分別以PBS(10 μl)、IGF-1(10-9 M、10-8 M、10-7 M)處理紅體細胞 24 小時，結果顯示在IGF-1 劑量為 10-9、10-8會抑制PTEN long免疫反應的強 度(比控制組分別減少 0.77 倍、0.9 倍) (圖 23B、F、J、Q)，但是劑量為 10-7，卻會增加PTEN long免疫反應的強度(比控制組增加 1.3 倍) (圖 23B、
N、Q)。在IGF-1 作用下，對於PTEN short(圖 23D、H、L、P、R) 免疫 反應的強度沒有明顯差異。
3.12 與生長因子(胰島素,Insulin)作用的關係
3.12.1 分析生長因子(胰島素,Insulin)與 PTEN、EDF-1 表現量
的關係
分別以PBS(10 μl/ml)、Insulin (10-9 M、10-8 M、10-7 M)處理紅體細胞
24 小時，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果顯示在Insulin 作用下，會增加PTEN long(比控制組分別增加 1.48 倍、1.5 倍、1.32 倍)、 PTEN short(比控制組分別增加 1.28 倍、1.58 倍、1.36 倍)表現量(圖 24A、
B)。對於EDF-1 表現量沒有差異(圖 24C)。
3.12.2 生長因子(胰島素,Insulin)與 PTEN long 和 PTEN short 螢
光表現的關係
分別以PBS(10 μl/ml)、Insulin (10-9 M、10-8 M、10-7 M)處理紅體 細胞24 小時，結果顯示在Insulin作用下，對於PTEN long和PTEN short 免疫反應的強度，沒有太大差異(圖 25B、F、J、；D、H、L、N)。
3.13 與生長因子(bFGF)作用的關係
3.13.1 分析生長因子(bFGF)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
分別以PBS(10 μl/ml)、bFGF (10-10 M、10-9 M、10-8 M)處理紅體細胞
24 小時，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果顯示在bFGF作 用下，PTEN long表現量有隨著劑量增加而使其表現量增加的趨勢(比控 制組分別減少0.9 倍、比控制組分別增加 1.04 倍、1.13 倍) (圖 26A)。在 bFGF作用下，會抑制PTEN short(比控制組分別減少 0.73 倍、0.92 倍、0.98 倍)和EDF-1(比控制組分別減少 0.77 倍、0.86 倍、0.91 倍)表現量，但隨 著增加bFGF劑量會使PTEN short和EDF-1 表現量增加(圖 26B、C)。
3.13.2 生長因子(bFGF)與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的
關係
分別以PBS(10 μl/ml)、bFGF (10-10 M、10-9 M、10-8 M)處理紅體細胞 24 小時，在bFGF作用下，會抑制PTEN long免疫反應強度的趨勢(比控制 組分別減少0.8 倍、0.92 倍、0.79 倍) (圖 27B、F、J、N、Q)，但對於PTEN short免疫反應的強度，沒有太大差異(圖 27D、H、L、P、R)。
3.14 與類固醇(睪固酮,Testosterone,T)作用的關係
3.14.1 分析類固醇(睪固酮,Testosterone,T)與 PTEN、EDF-1 表
現量的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Testosterone (10-8 M、10-7 M、10-6
M)處理紅體細胞三天，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果 顯示在Testosterone作用下，明顯增加PTEN long(第一次實驗，比控制組
分別增加1.48 倍、1.4 倍、1.28 倍；第二次實驗，比控制組分別增加 1.73 倍、1.63 倍、1.35 倍)、PTEN short(第一次實驗，比控制組分別增加 1.36 倍、1.2 倍、1.09 倍；第二次實驗，比控制組分別增加 1.93 倍、1.98 倍、
1.57 倍)和EDF-1(第一次實驗，比控制組分別增加 1.4 倍、1.38 倍、1.02 倍；第二次實驗，比控制組分別增加1.5 倍、1.45 倍、1.25 倍)表現量(圖 28A、B；C、D；E、F)。
3.14.2 類固醇(睪固酮,Testosterone,T)與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Testosterone (10-8 M、10-7 M、10-6
M)處理紅體細胞三天，結果顯示在Testosterone作用下，明顯增加PTEN long免疫反應的強度（比控制組分別增加 2.37 倍、2.43 倍、2.03 倍）(圖 29B、F、J、N、Q)，但是對於PTEN short免疫反應的強度，沒有太大差 異(圖 29D、H、L、P、R)。
3.15 與類固醇(雌性素,Estradiol,E2)作用的關係
3.15.1 分析類固醇(雌性素,Estradiol,E2)與 PTEN、EDF-1 表現
量的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Estradiol (10-8 M、10-7 M、10-6 M)
處理紅體細胞三天，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果顯 示在Estradiol作用下，明顯增加PTEN long（比控制組分別增加 1.35 倍、
1.17 倍、1.09 倍）、PTEN short（比控制組分別增加 1.3 倍、1.41 倍、1.19 倍）和EDF-1（比控制組分別增加 1.26 倍、1.15 倍、1.02 倍）表現量(圖
30A、B、C)。
3.15.2 類固醇(雌性素,Estradiol,E2)與 PTEN long 和 PTEN short
螢光表現的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Estradiol (10-8 M、10-7 M、10-6 M)
處理紅體細胞三天，結果顯示在Estradiol作用下，對於PTEN long (圖 31B、F、J、N、Q)和PTEN short免疫反應的強度，沒有太大差異(圖 31D、
H、L、P、R)。
3.16 與類固醇(黃體激素,Progesterone,P4)作用的關係
3.16.1 分析類固醇(黃體激素,Progesterone,P4)與 PTEN、EDF-1
表現量的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Progesterone (10-8 M、10-7 M、10-6
M)處理紅體細胞三天，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果 顯示在Progesterone作用下，明顯增加PTEN long(第一次實驗，比控制組 分別增加1.28 倍、1.17 倍、1.14 倍；第二次實驗，比控制組分別增加 1.37 倍、1.29 倍、1.05 倍)、PTEN short(第一次實驗，比控制組分別增加 1.29 倍、1.15 倍、1.17 倍；第二次實驗，比控制組分別增加 1.22 倍、1.19 倍、
比控制組減少0.92 倍)和EDF-1(第一次實驗，比控制組分別增加 1.37 倍、
1.29 倍、1.05 倍；第二次實驗，比控制組分別增加 3.98 倍、3.08 倍、1.77 倍)表現量(圖 32A、B；C、D；E、F)。
3.16.2 類固醇(黃體激素,Progesterone,P4)與 PTEN long 和 PTEN short 螢光表現的關係
分別以Alcohol(99.8％；10 μl/ml)、Progesterone (10-8 M、10-7 M、10-6 M) 處理紅體細胞三天，結果顯示在Progesterone作用下，會增加PTEN long 免疫反應強度的趨勢（比控制組分別增加1.13 倍、1.1 倍、1.24 倍）(圖 33B、F、J、N、Q)，但是會減少PTEN short免疫反應的強度（比控制組 分別減少0.91 倍、0.77 倍、0.93 倍）(圖 33D、H、L、P、R)。
3.17 與離子(硫化鋅,Zn)作用的關係
3.17.1 分析離子(硫化鋅,Zn)與 PTEN、EDF-1 表現量的關係
分別以PBS(10 μl/ml)、Zn (10-7 M、10-6 M、10-5 M)處理紅體細胞 12
小時和三天，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果顯示在Zn 作用下，明顯增加PTEN long（作用 12 小時，比控制組分別增加 1.43 倍、
小時和三天，再以RT-PCR分析其PTEN和EDF-1 表現量。結果顯示在Zn 作用下，明顯增加PTEN long（作用 12 小時，比控制組分別增加 1.43 倍、