行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
綠豆抗蟲蛋白質之抗蟲功能與機制(1/2)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC91-2317-B-002-025-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學昆蟲學系暨研究所 計畫主持人： 洪淑彬 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中
華
民
國 92 年 5 月 23 日
抗蟲蛋白質的功能基因體學的研究與應用
子計劃四--綠豆抗蟲蛋白之抗蟲功能與機制
台大昆蟲系 洪淑彬
計畫編號：NSC 92-2317-B-002-008
摘要
為探討綠豆抗蟲蛋白 VrCRP 的 抗蟲活性，首先我們以 VrCRP 蜜水來 餵食東方果實蠅(Bactrocera dorsalis) 及東方果實蠅寄生蜂— 跳腳小蜂 (Dihhinus giffardii)，結果其壽命及死 亡率與對照組並無顯著差異。其次則 是餵食斜紋夜盜(Spodoptera litura Fabicius)幼蟲含有抗蟲綠豆粉的人工 飼料,結果在生長及存活率上，皆較對 照組顯著為低。最後將四紋豆象 (Callosobruchus maculatus 4c6-4 品系) 飼養於含有 VrCRP 的抗蟲品系綠豆 (VC 6089A)中,進行五個世代試驗 後，豆象的存活率並沒有顯著的提 高，顯示族群對抗蟲綠豆抗性的發展 緩慢，但羽化成蟲的生殖力卻有顯著 增加的情形，因此仍有可能產生對抗 蟲綠豆具抗性的豆象族群。總之，我 們發現 VrCRP 對於膜翅目及雙翅目 的影響不大，對於鱗翅目及鞘翅目的 影響較為顯著，值得進行進一步的試 驗。目的
本計劃主要是以計劃中所提供 的綠豆抗蟲蛋白質 VrCRP 做抗蟲活 性的研究，並就昆蟲分類群中危害台 灣主要作物的重要害蟲、可能危害之 非標的天敵和有用昆蟲為目標，規劃 出以下六種受試昆蟲： 1)東方果實蠅(Bactrocera dorsalis) 。 2)東方果實蠅寄生蜂— 跳腳小蜂 (Dihhinus giffardii)。 3)斜紋夜盜(Spodoptera litura Fabicius) 。 4)四紋豆象(Callosobruchus maculatas 4c6-4 品系)。 5)桃蚜（Myzus persicae）。 6)蜜蜂（Apis mellifera）。 目前進行中的為 1) ~ 4)的昆蟲， 我們期望找出 VrCRP 是否對此四種 受試昆蟲有影響，並找出此防禦素的 抗蟲範圍、及對非標的昆蟲可能造成 的影響。材料與方法
VrCRP 對東方果實蠅(Bactrocera dorsalis) 及跳腳小蜂(Dihhinus giffardii)之影響 以羽化 3-5 天之東方果實蠅成蟲 為實驗對象，將其飼養於 31ml 之塑 膠透明離心管，每管 10 隻，飼養環 境為 25℃、50±5%RH、12:12(D:L)。 分別配製含 0%及 0.2%VrCRP 之 water agar(表一)為飼料，每種飼料兩 重複，每天更換新飼料且觀察其死亡 率，共五天。五天後，兩種處理皆餵 以不含 VrCRP 之 water agar，每天更 換飼料及觀察死亡率直到所有蟲皆 死亡為止。 以剛羽化之跳腳小蜂成蟲為實 驗對象，將其飼養於 31ml 之塑膠透 明離心管，每管 8 隻，飼養環境為 25 ℃、50±5%RH、12:12(D:L)。分別配 製含 0%及 0.2%VrCRP 之 water agar(表三)為飼料，每種飼料兩重複， 每天更換新飼料且觀察其死亡率，共 五天。五天後，兩種處理皆餵以不含 VrCRP 之 water agar，每天更換飼料 及觀察死亡率直到所有蟲皆死亡為 止。 VrCRP 對斜紋夜盜(Spodoptera litura Fabicius)之影響 分別配製不含綠豆、含感蟲綠豆(1973A)及含抗蟲綠豆(6089A) 這三 種的人工飼料(表五)，以六合一培養 皿為飼養容器，分別放入四齡斜紋夜 盜幼蟲，且每種處理皆兩盒(12 隻)。 每天觀察並記錄 a)死亡率 b)蟲重 c) 化蛹率 d)蛹重 e)羽化率。飼育環 境：25℃、75±5%RH、12:12(D:L)。 累代生長於抗蟲品系綠豆對四紋豆象之 影響 將四紋豆象(Callosobruchus maculatus 4c6-4 品系)飼養於含有 VrCRP 的抗蟲品系綠豆(VC 6089A) 中，紀錄能從抗蟲綠豆中成功羽化之 蟲體的各項生活史特性，並將這些具 抗性的雌雄蟲個別交配，再置入抗蟲 綠豆中。經過五代之篩選，觀察每一 代四紋豆象生活史特性改變的情 形，並探討抗性傳遞的情況與其衍生 的問題。
結果與討論
以含有 VrCRP 之 water agar 餵食 東方果實蠅(Bactrocera dorsalis)及跳 腳小蜂(Dihhinus giffardii)後，發現和 餵食不含 VrCRP 之 water agar 的相 比，兩種蟲皆較早出現死亡，且壽命 較短，但兩組差距並不顯著 (表二、 圖一)、(表四、圖二)。因此在這個實 驗中，我們可初步發現 VrCRP 對膜翅 目及雙翅目的影響不大，就防治方面 而言可能並沒有太大的功用；不過對 膜翅目天敵之負面影響也可能不大。 在斜紋夜盜(Spodoptera litura Fabicius)的實驗中，目前我們實驗只 進行到幼蟲的階段，不過在我們初步 觀察斜紋夜盜幼蟲的死亡率及生長 情形後，發現餵食含 VrCRP 之抗蟲綠 豆（6089A）人工飼料的斜紋夜盜幼 蟲，比餵食其他兩種飼料的幼蟲生長 皆較緩慢，且有較高的死亡率(圖三~ 圖五)。因此我們認為 VrCRP 對鱗翅 目的影響較顯著，不過因為我們餵食 的是抗蟲綠豆粉，所以也有可能是綠 豆本身營養成分影響到斜紋夜盜的 死亡率和生長，接下來我們以純的 VrCRP 來做試驗，以確實了解 VrCRP 對斜紋夜盜的影響情形。 關於四紋豆象(Callosobruchus maculatus 4c6-4 品系)在抗蟲品系綠 豆上的累代生長情形，每一代生活史 特性的表現如表六及圖六至九所 示，其中在這五代間具顯著差異的特 性包括雄成蟲的壽命，雌蟲的生殖 力，以及每代雌蟲所生後代的死亡 率。在雌蟲生殖力方面，由圖八可以 看出雌豆象一開始三代在抗蟲豆上 的生殖力逐漸降低，不過卻在第四代 (F3 子代)顯著的攀升，在圖九雌蟲後 代死亡率方面亦呈現相符合的後代 死亡率降低之結果，雖然進行五個世 代試驗，豆象的存活率並沒有顯著的 提高，顯示族群對抗蟲綠豆抗性的發 展緩慢，但因生殖力有顯著上升的現 象，因此仍有可能產生對抗蟲綠豆具 抗性的豆象族群。此結果提供 VrCRP 在未來生物製劑的開發上必須考量 的課題。參考文獻
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含 0% VrCRP 之 water agar ---共 1.7g 含 0.2% VrCRP 之 water agar---共 1.7g VrCRP 0g 0.0034g Agar 0.02g 0.02g 蔗糖 0.5g 0.5g 酵母粉 0.1g 0.1g 蒸餾水 1.046g 1.08g 表三 跳腳小蜂之人工飼料配方 含 0% VrCRP 之 water agar ---共 0.8g 含 0.2% VrCRP 之 water agar ---共 0.8g VrCRP 0g 0.0016g Agar 0.016g 0.016g 蜂蜜 0.08g 0.08g 蒸餾水 0.704g 0.7024g 表二 VrCRP 對東方果實蠅之影響 處理 N 平均(天) SE P 無 VrCRP 20 21.45 1.05 0.110 有 VrCRP 20 18.35 1.57 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 5 10 15 20 25 30 Days Mortality Defensin Control 圖一 VrCRP 對東方果實蠅死亡率之 影響情形 表四 VrCRP 對跳腳小蜂之影響 處理 N 平均(天) SE P 無 VrCRP 16 23.44 0.86 0.084 有 VrCRP 16 20.88 1.14 圖二 VrCRP 對跳腳小蜂死亡率之影 響 表五 斜紋夜盜之人工飼料配方 ＜營養粉末＞ (1)不含綠豆粉 (2)含感蟲綠豆粉 (3)含抗蟲綠豆粉 Kidney bean（花豆 粉） 132 g Mung bean (1973A) 132g Mung bean (6089A) 132g Soybean powder（黃豆粉） 132 g Wheat germ（小麥胚芽 E 粉） 264 g Yeast powder（酵母粉） 120 g ＜化學藥劑＞ Ascorbic acids 12 g 1-cysteine 1.2 g Sorbic acids 0.6 g Methy1-p-hydroxybanzoate 6 g Chloramphenicol 0.6 g ＜其他＞ Agar 42 g Dist. water 1800 ml -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 5 10 15 20 25 30 Days Mortality Defensin Control
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 Days Mortality (%) soybean susceptable resistance 圖三 不同處理對斜紋夜盜死亡率之 影響 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 3 6 9 12 15 Days Body weight (g) soybean susceptable rsistance 圖四 不同處理對斜紋夜盜生長的影 響 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 3 6 9 12 Days RGR soybean susceptable rsistance a a a b a a b a b b a 圖五 不同處理對斜紋夜盜 RGR 的影 響 25 30 35 40 P F1 F2 F3 F4 Generations
Larval development time (day)
Female Male
圖六 累代生長於抗蟲品系綠豆對
四紋豆象幼蟲發育期之影響情形
表六 累代生長於抗蟲品系綠豆對四紋豆象各種生活史特性所造成之影響情形
Generations Development time female male Longevity female male Fecundity Emergence rate Sex ratio f : m P 31.8 30.2 13.1 11.6ab 87.5ab 3.6% 8 : 5 F1 30.5 32.5 12.5 13.4a 83.8ab 2% 6 : 8 F2 30.5 32.0 13.6 10.5b 57.0b 1.99% 8 : 2
F3 30.3 30.9 11.4 12.7ab 104.0a 3.7% 8 : 9
5 10 15 20 P F1 F2 F3 F4 Generations
Adult longevity (day)
Female Male 圖七 累代生長於抗蟲品系綠豆對四紋豆象成蟲壽命之影響情形 20 40 60 80 100 120 P F1 F2 F3 F4 Generations Fecundity 圖八 累代生長於抗蟲品系綠豆對四紋 豆象雌蟲生殖力之影響情形 0.93 0.94 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99 P F1 F2 F3 Generations
Mortality rate at next
generation(%)
