大黃酚對人類肝癌細胞株Hep3B及肺癌細胞株A549生長抑制的分子作用機轉研究;The Molecular Mechanism of Growth Inhibition Effects Of Chrysophanol on Human Hepatoma Hep 3B Cells And Lung Carcinoma A549 Cells

全文

(1)中國醫藥大學中國醫學研究所碩士論文編號：GICMS-317. 指導教授：江素瑛助理教授共同指導教授：鍾景光. 教授. 林昭庚. 教授. 論文題目. 大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 生長抑制的分子作用機轉研究 The Molecular Mechanism of Growth Inhibition Effects Of Chrysophanol on Human Hepatoma Hep3B Cells And Lung Carcinoma A549 Cells. 研究生：倪健航. 中華民國九十六年七月二十三日.

(2) 目錄中文摘要 --------------------------------------------------------------------------1 第一章前言 ---------------------------------------------------------------------1 第一節研究背景. -----------------------------------------------------------------1. 第二節研究目的 ------------------------------------------------------------------1. 第二章緒論. ---------------------------------------------------------------------3. 第一節大黃酚（Chrysophanol） -------------------------------------------------3 第二節肝癌與肺癌 ---------------------------------------------------------------5 第三節細胞週期. ----------------------------------------------------------------11. 第四節細胞轉移. ---------------------------------------------------------------14. 第五節細胞壞死與細胞凋亡的比較 -----------------------------------------17. 第三章研究設計與研究架構 ---------------------------------------------20 第一節研究設計 ----------------------------------------------------------------20 第二節研究架構 ----------------------------------------------------------------20. 第四章材料與方法第一節實驗材料一. 細胞來源. ----------------------------------------------------------21. ---------------------------------------------------------------21 -----------------------------------------------------------21. 二. 實驗藥物 ------------------------------------------------------------22 三. 藥品試劑 ------------------------------------------------------------22 四. 儀器設備 ------------------------------------------------------------25 第二節實驗方法 ----------------------------------------------------------------26 一. 細胞解凍 ------------------------------------------------------------26 二. 人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 的培養. ------------27. 三. 細胞計數與細胞死活的辨別 ------------------------------------28 四. 大黃酚與 PBS 的配製. --------------------------------------------28. 五. 檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 生長的影響 ---------------------------------------------------------------29 A . 利用倒立式位相差顯微鏡觀察細胞形態的變化 ----------29 B . 利用流式細胞儀檢測細胞存活率 ----------------------------29 iii.

(3) 六. 檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 細胞週期的影響 ---------------------------------------------------------32 A . 利用流式細胞儀分析人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 的細胞週期 ----------------------------------------------32 B . 利用西方墨點法（Western blotting）檢測參與 Hep3B 與 A549 細胞週期的調控蛋白表現量的差異 ----------------32 七. 檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 產生細胞壞死的影響 ---------------------------------------------------39 A. 利用 DAPI 染色觀察細胞核內 DNA 破壞情況 B. 利用 Comet assay 觀察細胞拖尾的情況. ------------39. -------------------40. C. 利用流式細胞儀檢測細胞內粒線體膜電位、ROS、鈣離子在大黃酚作用下的變化. -------------------------------------42. 八. 檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 內 ATP 產量的變化. ---------------------------------------------------47. 九. 檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 轉移能力的影響. ----------------------------------------------------------49. A. 細胞移行實驗（Migration assay）-------------------------------49 B. 細胞穿透試驗（Invasion assay） ------------------------------49 C. 西方墨點法檢測參與 Hep3B 與 A549 細胞轉移的調控蛋白表現量的差異十. 統計方法. ----------------------------------------------50. ------------------------------------------------------------50. 第五章實驗結果 ------------------------------------------------------51 第一節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 與肺癌細胞株 A549 形態的影響. ---------------------------------------------------------------------51. 第二節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 抑制增殖作用 --------------------------------------------------------------------58 第三節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 細胞週期的影響 ----------------------------------------------------------------61 第四節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 細胞內粒線體膜電位的影響. -------------------------------------------------74 iv.

(4) 第五節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 細胞內活性氧化物（ROS）產生之影響. -------------------------------------79. 第六節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞 A549 細胞內鈣 2+. 離子（Ca ）產生之影響. --------------------------------------------85. 第七節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 細胞內 ATP 產生之影響 -------------------------------------------------------89 第八節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 細胞內 DNA 產生之影響. ------------------------------------------------------92. 第九節西方墨點法檢測參與 Hep3B 與 A549 細胞壞死的調控蛋白表現量的差異. ----------------------------------------------------------97. 第十節大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 在轉移相關步驟所造成的影響 ---------------------------------------------108 （一）以細胞移動試驗分析大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 之細胞移動現象的影響. --------------------------------------------------108. （二）以細胞穿透試驗分析大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 的細胞穿透現象之影響 ------------------------------------------------111 （三）利用西方點墨法探討大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 細胞轉移相關調控蛋白表現量的差異 ---------------------------------112 （四）以細胞移動試驗分析大黃酚對人類肺癌細胞株 A549 的細胞移動現象之影響 ------------------------------------------------------116 （五）以細胞穿透試驗分析大黃酚對人類肺癌細胞株 A549 之細胞穿透現象之影響 ------------------------------------------------------119 （六）利用西方點墨法探討大黃酚對 A549 細胞轉移相關調控蛋白之表現量的差異. -----------------------------------------------------120. 第六章討論 ------------------------------------------------------------------124 第七章結論 -----------------------------------------------------------------129 參考文獻 -----------------------------------------------------------------------131 Abstract. ------------------------------------------------------------------------145. v.

(5) 圖目錄圖 2-1 大黃酚的化學結構. -------------------------------------------------------3. 圖 2-2 細胞凋亡與細胞壞死的形態區別 ------------------------------------18 圖 3-1 實驗架構 ------------------------------------------------------------------20 圖 4-2-A 流式細胞儀 Propidium Iodide 染色之細胞存活率分析圖--------30 圖 4-2-B 西方墨點法-轉漬夾的內部組成 ------------------------------------37 圖 4-2-C DAPI 染劑鍵結在 DNA 雙股螺旋小溝上 ------------------------39 圖 4-2-D MMP 軟體的分析圖 --------------------------------------------------43 圖 4-2-E ROS 軟體分析圖 -------------------------------------------------------44 圖 4-2-F 鈣離子軟體分析圖-------------------------------------------------------46 圖5-1-A Hep3B細胞處理chrysophanol 24小時形態變化. -----------------52. 圖 5-1-B Hep3B 細胞處理 chrysophanol 48 小時形態變化 ----------------53 圖 5-1-C Hep3B 細胞處理 chrysophanol 72 小時形態變化 ----------------54 圖 5-1-D A549 細胞處理 chrysophanol 24 小時形態變化 ------------------55 圖 5-1-E A549 細胞處理 chrysophanol 48 小時形態變化 ------------------56 圖 5-1-F A549 細胞處理 chrysophanol 72 小時形態變化 ------------------57 圖 5-2-A Hep3B 細胞處理 chrysophanol 各個時間點存活率變化 --------59 圖 5-2-B A549 細胞處理 chrysophanol 各個時間點存活率變化 ----------60 圖 5-3-A Hep3B 細胞處理 chrysophanol 24 小時細胞週期變化 ----------62 圖 5-3-B Hep3B 細胞處理 chrysophanol 48 小時細胞週期變化 ----------63 圖 5-3-C Hep3B 細胞處理 chrysophanol 72 小時細胞週期變化 ----------64 圖 5-3-D Hep3B 細胞處理 chrysophanol 不同時間的細胞週期電腦分析圖. ------------------------------------------------------------------------65. 圖 5-3-E Hep3B 細胞處理 chrysophanol 不同時間的細胞週期變化 -----66 圖 5-3-F A549 細胞處理 chrysophanol 24 小時細胞週期變化. -----------67. 圖 5-3-G A549 細胞處理 chrysophanol 48 小時細胞週期變化 ------------68 圖 5-3-H 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 CDK2 和 thymidylate synthase 之變化 ----------------------------69 圖 5-3-I 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 cyclin-D 和 p21 之變化 -----------------------------------------------70 vi.

(6) 圖 5-3-J 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 p27 和 p53 之變化. -----------------------------------------------------------71. 圖 5-3-K 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 CDK2 和 thymidylate synthase 之變化 ----------------------------72 圖 5-3-L 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 cyclin D 之變化. -------------------------------------------------------73. 圖 5-4-A chrysophanol 對 Hep3B 細胞內粒線體膜電位的影響 -----------75 圖 5-4-B chrysophanol 對 Hep3B 粒線體膜電位影響的相對量統計圖 --77 圖 5-4-C chrysophanol 對 A549 粒線體膜電位的影響 ----------------------78 圖 5-5-A chrysophanol 對 Hep3B 細胞內 ROS 之 6 小時內的影響 --------80 圖 5-5-B chrysophanol 對 Hep3B 之 12 到 72 小時的 ROS 的影響 ---------82 圖 5-5-C chrysophanol 對 Hep3B 的 ROS 的相對表現量統計圖 ----------83 圖 5-5-D chrysophanol 對 A549 細胞內 ROS 的影響 ------------------------84 圖 5-6-A chrysophanol 對 Hep3B 細胞內鈣離子 6 小時內的影響 --------86 2+. 圖 5-6-B chrysophanol 對 Hep3B 之 Ca. 6 小時內的表現量之統計圖 --87. 圖 5-6-C chrysophanol 對 A549 細胞內鈣離子的影響 ----------------------88 圖 5-7-A 細胞內 ATP 濃度檢測原理 -------------------------------------------89 圖 5-7-B chrysophanol 對 Hep3B 細胞內 ATP 之的影響 --------------------90 圖 5-7-C chrysophanol 對 A549 細胞內 ATP 之的影響 ---------------------91 圖 5-8-A DAPI 試驗來觀察 chrysophanol 對 Hep3B 的 DNA 傷害 --------93 圖 5-8-B 利用彗星試驗來觀察 A549 的拖尾現象 --------------------------94 圖 5-8-C DAPI 試驗來觀察 chrysophanol 對 Hep3B 的 DNA 傷害 --------95 圖 5-8-D 利用彗星試驗來觀察 A549 的拖尾現象. --------------------------96. 圖 5-9-A 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 GST 的變化 ------------------------------------------------------------97 圖 5-9-B 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 SOD（Mn）和 SOD（Cu）的變. ------------------------------------98. 圖 5-9-C 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 catalase 和 PARP 的變化 ---------------------------------------------99 圖 5-9-D 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 vii.

(7) caspase 8 和 caspase 9 的變化 -------------------------------------100 圖 5-9-E 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 cytochrome c 和 Apaf-1 的變化 -----------------------------------101 圖 5-9-F 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 AIF 的變化 -----------------------------------------------------------102 圖 5-9-G 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 GST 和 catalase 的變化. --------------------------------------------103. 圖 5-9-H 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 SOD（Mn）和 SOD（Cu）的變化 -------------------------------104 圖 5-9-I 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 cytochrome c 和 PARP 的變化. ------------------------------------105. 圖 5-9-J 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 caspase 3 和 caspase 8 的變化 -------------------------------------106 圖 5-9-K 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 Apaf-1 和 AIF 的變化 -----------------------------------------------107 圖 5-10-A～E chrysophanol 對於 Hep3B 細胞移動現象之影響. -------108. 圖 5-10-F chrysophanol 對於 Hep3B 細胞穿透現象之影響 --------------111 圖 5-10-G 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 PI3K 和 ERK 的變化 ----------------------------------------------112 圖 5-10-H 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 MMP-1 和 MMP-2 的變化 ----------------------------------------113 圖 5-10-I 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 MMP-7 和 COX-2 的變. --------------------------------------------114. 圖 5-10-J 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 Hep3B 細胞內蛋白 VEGF 和 EPO 的變化 -----------------------------------------------115 圖 5-10-K～O chrysophanol 對 A549 細胞移動現象之影響 -------------116 圖 5-10-P chrysophanol 對於 A549 細胞穿透現象之影響 ----------------119 圖 5-10-Q 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 PI3K 和 ERK 的變化 ----------------------------------------------120 圖 5-10-R 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 viii.

(8) JNK 和 MMP-1 的變化 ---------------------------------------------121 圖 5-10-S 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 MMP-7、MMP-9 和 NF-κB 的變化 ------------------------------122 圖 5-10-T 以西方墨點法分析 chrysophanol 對於 A549 細胞內蛋白 VEGF 和 EPO 的變化 ---------------------------------------------123 圖 7-1 大黃酚影響細胞週期的路徑圖 -------------------------------------130 圖 7-2 大黃酚影響細胞壞死的路徑圖 -------------------------------------130. ix.

(9) 表目錄表 2-1：細胞凋亡與細胞壞死在形態上的差異 ----------------------------17 表 4-1：Hep3B 細胞株相關資料. -----------------------------------------------21. 表 4-2：A549 細胞株相關資料 -------------------------------------------------22 表 4-3：10 倍磷酸鹽緩衝溶液 --------------------------------------------------29 表 4-4：蛋白質標準品之配製 --------------------------------------------------33 表 4-5：SDS-PAGE 下層膠（separation gel）之配製及組成. ----------------34. 表 4-6：SDS-PAGE 上層膠（stacking gel）之配製及組成. ------------------34. 表 4-7：Running buffer（1.5 M Tris-HCl, pH 8.8）之組成. ------------------35. 表 4-8：Stacking buffer（0.5 M Tris-HCl, pH 6.8）之組成 -----------------35 表 4-9：轉印緩衝液（Transfer buffer）之組成 --------------------------------37 表 4-10：PBS-tween 20 之組成 -------------------------------------------------38 表 4-11：comet assay 之 lysis buffer 配製. -------------------------------------41. 表 4-12：alkaline buffer 之配製 ------------------------------------------------41 表 4-13：Tris buffer 之配製. -----------------------------------------------------41. x.

(10) 縮寫對照表 AIF. Apoptosis Inducing Factor. Apaf-1 APS. Apoptosis activating factor-1 Ammonium persulfate. ARNT. Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator. ATP. Adenosine 5'-triphosphate. Caspase. Cysteine asparate protease. CDK2 COX-2. Cyclin-Dependent Kinase 2 Cyclooxgenase 2. DAPI. 4',6-diamidino-2-phenylindole. DMSO. Dimethyl sulfoxide. D.D.Water. Double Deionized Water. DioC6. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide. DMEM. Dulbecco's Modified Eagle's Medium. DTT. Dithiothreitol. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid. ELISA. Enzyme-linked immunosorbent assay. Emodin ERK. 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone Extracellular signal-regulated kinase. Endo-G. Endonuclease G. EPO. Erythropoietin. FACS. Fluorescence Activated Cell Sorting. FBS. Fetal Bovine Serum. GADD153 GRP78. Growth arrest and dna damage-inducible gene 153 Glucose-regulated protein 78. GSH. Glutathione. GST. Glutathione s-transferase. HIF-1. Transcription factor Hypoxia-Inducible Factor 1 xi.

(11) H2DCFDA. 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate. Indo-1-AM. [1-[2-amino-5(4-carboxylindol-2-yl)-phenoxy]-2-(2’a mino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid. JNK. Jun N-terminal kinase. LG LMA. L-glutamate Low-meliting gel. MTT. 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-. MAPK. phenytetrazoliumromide Mitogen-activated protein kinase. MMP（Δψm） Mitochondrial membrane potential MMPS. Matrix metalloproteinases. NAC NFκB. N-acetyl cysteine Nuclear factor-kappa B. NMA. Normal melting point agarose. PS. Penicillin / Streptomycin. PARP. Poly(ADP-ribose)polymerases. PI. Propidium Iodide. PBS. Phosphate Buffered Saline. PI3K. Phosphoinositide-3 kinase. PVDF. Polyvinylidene Difluoride. ROS. Reactive Oxygen Species. SDS-PAGE. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. SOD. Superoxide Dismutase. TEMED. N,N,N',N'-Tetrame. TNF. Tumor necrosis factor. TRAIL. Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand. xii.

(12) 中文摘要研究生：倪健航指導教授：江素瑛博士中國醫藥大學中國醫學研究所大黃酚（chrysophanol, 1,8-Dihydroxy-3-methyl-9,10-anthracenedion）是從蓼科植物大黃萃取得來的蒽醌類（anthraquinone）衍生物的生物鹼。一些相關文獻顯示大黃酚具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗老化、降血脂、治療動脈粥狀硬化、抗記憶衰退、與抗癌作用。大黃酚的抗癌分子作用機轉尚未被詳細報導。本研究即針對人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 來探討大黃酚是否具有抑制這兩株細胞的增殖及轉移相關表現的能力。由存活率結果顯示，在處理大黃酚 24 小時後，大黃酚對 Hep3B 細胞與 A549 細胞的增殖就能有效的抑制，其 IC50 皆大約為 50μM。由細胞形態變化、DAPI 試驗陽性表現及彗星試驗的拖尾現象，顯示大黃酚對於此兩株細胞的 DNA 具有破壞的能力，進而導致細胞死亡。大黃酚使細胞內的活性氧化物（ROS）增加、鈣離子（Ca2+）濃度增加，進而粒線體膜電位改變及 ATP 濃度下降；但 Apaf-1 (Apoptosis protease activating factor-1) 、caspase 8 與 caspase 9 蛋白質表現量無顯著變化，綜合上述實驗結果，大黃酚誘使 Hep3B 細胞與 A549 細胞死亡是以壞死性的細胞死亡方式進行。在細胞週期的檢測結果顯示，發現大黃酚促使細胞傾向於 S 期的比例增長，檢測細胞週期調控蛋白的表現；隨著加藥的時間增加，p21、 p27 及 p53 蛋白質表現量上升，而 cyclin D，CDK2、thymidine synthase 等蛋白表現下降，可能由於 DNA 損傷後被磷酸化，使的在細胞週期過程中從 S 期到 G2 期的推移蛋白 cyclin A/CDK2 complex 受到抑制。在移動和穿透性試驗的結果顯示，大黃酚能抑制兩株細胞在在轉移相關的表現，且會抑制轉移相關調控蛋白 PI3K、ERK、MMPs 及 VEGF、 EPO、NF-κB 的表現。 1.

(13) 綜合以上結果，大黃酚對於Hep3B細胞及A549細胞的增殖及轉移的相關表現確實有顯著的抑制作用，值得進一步研究發展成為抗癌藥物。. 2.

(14) 第一章前言第一節研究背景根據衛生署統計，從民國 71 年起，癌症已成為國人十大死因之首，其中肺癌與肝癌更在近年來已成為癌症死亡率的前兩名 1。由於現今社會人口的年齡結構逐漸提高，因老化所伴隨而來的疾病也日益增加，儘管醫療儀器日益先進以及醫療技術日漸發達，人類仍無法擺脫癌症的威脅，反而日益嚴重 2-5。另外，癌細胞會對目前臨床的化學療法或是放射療法產生抗藥性以及耐受性，使得原本已難以治療的癌症更增加醫療人員的困擾 6-9。因此，除了不斷研發新的製劑以及診斷技術外，針對腫瘤的抗藥性及轉移能力而採取的抗癌策略成了未來研究的新主流 10-13。目前世界各國及台灣對中草藥等天然藥物或藥膳食品日漸重視，若能採取較科學化的步驟，研發其中的有效成分以及作用機轉，尤其是在癌症預防藥物的開發，取其副作用較小的優點，既可有助於癌症的預防及治療，又可提升病人的生活品質 14-17。. 第二節研究目的關於癌症的因應之道，唯有「早期發現早期治療」是唯一的治療法則，當惡性腫瘤仍位於原發病的病灶區而尚未突破外在包覆的基底膜之前，此時是最易於治療的階段，主要以手術切除為主，再視情況輔以放射線療法或化學療法，如此，將有很高的治癒率 18,19。不幸的是當病人因出現腫瘤所造成的症狀而就醫時，往往病程已處於中、末期，此時的腫瘤除了對於原病灶區的組織或器官形成混雜的共生結構，更甚者，因為癌細胞具有微血管增生的特性以資對外交通，進而轉移到許多遠方的組織與器官，在治療上形成很棘手的狀況. 20-22. 。因此，為能達到早期治. 療的目標，則必須要有良好的診斷工具，若能針對癌細胞的各種病理過程的分子機轉進行深入研究，將有助於開發有效的臨床篩檢工具，相信對於治療方面也能不斷找到新方向以因應癌細胞的抗藥性 23-25。本論文研究目的，以蒽醌類的大黃酚（chrysophanol；1, 1.

(15) 8-dihydroxy-3-methyl-9, 10-anthracenedion）進行體外癌細胞研究，探討對人類肝癌細胞株 Hep3B 及人類肺癌細胞株 A549 是否具有生長抑制及轉移抑制的作用，並探討其分子機轉，以期在診斷及治療方面能有良好的輔助。. 2.

(16) 第二章緒論第一節大黃酚（Chrysophanol）一. 大黃酚的化學性質 1. 藥品名：大黃酚 2. 化學名：1,8-dihydroxy-3-methyl-9,10-anthracenedion； 1,8-dihydroxy-3-methyl-anthraquinon；3-methylchrysazin 26,27. 3. 異名：chrysophanic acid 28 4. 分子式：C15H10O4 5. 分子量：254.23 6. 化學結構式 29：. 圖 2-1 大黃酚的化學結構 7. 植物來源： a. 掌葉大黃（Rheum palmatum L.）的根與莖 30。 b. 唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.）的根與莖 31。 c. 藥用大黃（Rheum offcinale Baill.）的根與莖。 d. 蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.）的乾燥根莖和根。 e. 蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb）的乾燥塊根。 f. 豆科植物決明子（Cassiae obtusifolia L.）的乾燥成熟種子。. 3.

(17) 二. 大黃酚的性質與研究進展： 1. 經皮吸收性：大黃酚在酸性介質中的透皮效果最佳，且 Azone 對其透皮吸收有顯著增強作用 32。 2. 抗衰老：大黃酚對 AlCl3 致急性衰老小鼠記憶障礙有保護作用；大黃酚可顯著抑制大鼠肝、腦 LPO 的生成，減少組織 MDA 含量，在體內、外均可顯著抑制小鼠腦 AChE 的活性，且具有劑量相關性 33。 3. 對心血管系統的作用：可降血脂、治療動脈粥狀硬化 34。 4. 對於微生物的作用：抗菌、抗微生物、抗幽門螺旋桿菌及抗原蟲 35-37. 。. 5. 止血作用：大黃酚具有明顯縮短小鼠出血時間 1,38,39。三. 大黃酚大黃酚主要是從傳統中藥植物大黃萃取而來，大黃最早記載於《神農本草經》提到：…主下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食…。臨床應用極廣，主要功效包括瀉下、攻積滯、利膽、退黃、清熱解毒、瀉火涼血、止血活血及利水消腫等。大黃的成分主要為蒽醌類（anthraquinone）衍生物，總量大約 3～5 ﹪，大部分為結合態，是造成瀉下的有效成分 40。結合態的成分可分成兩類，分別為蒽醌苷及雙蒽醌苷。雙蒽醌苷中有六種番瀉苷其中以番瀉苷 A 的瀉下作用最強，能使大腸段的張力增加、蠕動加快，但是並不妨礙小腸的吸收。游離型的蒽醌包括大黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等，致瀉的作用較弱，大黃酚能縮短凝血時間，改善血管脆性，降低血管通透性，能使纖維蛋白原增加血管收縮活動增加及促進骨髓製造血小板，因此大黃的止血作用主要成分是大黃酚 38,39。根據研究，大黃酚對於一些癌細胞具有抑制生長的作用 41，早期的文獻報導指出，經由 DNA 電泳及 MTT 實驗顯示大黃酚對於血癌細胞 HL-60 具有細胞毒殺作用 42；大黃酚對於大腸癌細胞株 SW620 的 Cdc25B 磷酸化具有抑制作用 43，而對於人類肺癌細胞株 AGZY 83-a 及肝癌細胞株 SMMC-7721 的生長也有抑制作用 44。. 4.

(18) 第二節肝癌與肺癌一. 肝癌肝癌是肝細胞異常變化的一種疾病，因為分裂失控而形成癌化的腫瘤。這種癌症稱為原發性肝癌 45,46。原發性肝癌又稱為惡性肝腫瘤或肝細胞癌。另外，很多年幼小孩可能會產生另一種型態的肝癌被稱為肝臟胚細胞瘤 47,48。肝癌的成因肝癌的形成與感染 B 型及 C 型肝炎有關 49,50。臨床估計 10 ~ 20﹪感染 B 型肝炎的人可能會罹患肝癌。在台灣有 80 ~ 90﹪肝癌患者曾感染過 B 型肝炎。而 C 型肝炎和肝癌之間的確切關係仍在研究當中。研究發現患有某些肝疾病的人們有較高的機率罹患原發性肝癌。例如，5 ~ 10﹪肝硬化（一種進行性導致肝臟損傷的疾病）的病人最後會罹患肝癌。一些研究也顯示生活型態，如長期酗酒及營養失調及肝癌家族史等皆會導致肝硬化和肝癌 51。大部分的癌症都有各自獨特的致癌因素，像是黃麴毒素容易導致肝癌，石綿及煙塵易導致肺癌 52。黃麴毒素易存在於發黴的食物中. 53. ，例. 如花生、玉蜀黍、榖類和種子，尤其在潮濕地區中或氣候下，食物保存不當而容易發黴，長期食用則易導致肝癌發生 54。肝癌的症狀早期原發性肝癌因為初期的症狀不明顯，所以是很難察覺。如同其他癌症一般，肝癌也會產生一些常見的身體不適的症狀。肝癌會容易伴隨食慾下降、體重減輕、發燒、疲倦和虛弱的現象，容易令病人誤以為只是一般的感冒症狀 55。當癌細胞不斷分裂複製，腫瘤逐漸增大，病人的右上腹部可能會產生疼痛的現象而且可能會牽延到肩背部。依病人不同體型及腫瘤大小，有些人可能會摸到上腹部有腫塊。肝癌也會導致腹部腫脹且有飽脹感。有些患者可能會有噁心或黃疸的現象 56。肝癌的分期目前臺灣對肝癌分期的標準尚未有共識，大多根據美國癌症委員會（AJCC）將肝癌分為六期 57，主要是依肝癌發生部位、腫瘤數量、大小、 5.

(19) 侵犯淋巴結及轉移作為分期之依據 58-60：第一期： 2 cm 以下之單一腫瘤，沒有侵犯血管，沒有轉移到淋巴結、其他組織或器官。第二期：已侵犯血管血小於 2 cm 以下的單一腫瘤；或沒有侵犯血管且大於 2 cm 以上的單一腫瘤；或所有腫瘤皆小於 2 cm 以下，並局限於單肝葉之多個腫瘤。以上腫瘤均未轉移到淋巴結、其他組織或器官。第三期 A：已侵犯血管血大於 2 cm 以上的單一腫瘤，或小於 2 cm 以下局限於單肝葉之多發性腫瘤；或局限於單肝葉，其中有任一腫瘤大於 2 cm 以上，不論有無侵犯血管之多個腫瘤。以上腫瘤均未轉移到淋巴結、其他組織或器官。第三期 B：無侵犯淋巴血管之單一腫瘤，或局限於單肝葉，不論大、小或有無侵犯血管之多個腫瘤。以上腫瘤已經有轉移到局部之淋巴結，但尚未轉移到其他組織或器官。第四期 A：已有多個腫瘤發生，且未局限於單個肝葉；腫瘤包含了門靜脈及肝靜脈的主要分枝；腫瘤侵入了如膽囊等相鄰器官；腫瘤造成腹膜臟層穿孔。以上腫瘤不論有、否轉移到局部之淋巴結，但未轉移到遠端其他組織或器官。第四期 B：不論單只有一個或多個腫瘤，不論腫瘤大、小，不論腫瘤是否局限於單個肝葉，不論腫瘤是否有侵犯到血管或相鄰器官，只要有轉移到遠端其他組織或器官，通常轉移至骨骼或肺臟。肝癌的診斷除了詢問病史、詳細的理學檢查外，血液學檢驗可以用來測試肝臟的功能以及檢查腫瘤標記，胎兒蛋白在肝癌患者通常會異常的升高。約有 50 ~ 70﹪的肝癌患者其胎兒蛋白（α-fetoprotein, AFP）指數會升高 6.

(20) 61,62. 。但是其他癌症如生殖母細胞瘤、胰臟癌或胃癌患者，胎兒球蛋白. 指數也可能上升。胸部及腹部 X 光檢查，電腦斷層和核磁共攝影也可用來做診斷工具 63,64。而血管攝影可以幫助醫師判斷是原發性肝癌或身體其他部位擴散來的轉移性癌症 65。若要確立肝癌的診斷，最可靠的是接受切片檢查。經由 X 光的指引使用細針進入腹腔內，在肝臟取得少量之組織在顯微鏡底下觀察是否有癌細胞的存在，此法稱為細針切片。也可以使用腹腔鏡來觀察肝臟，在腹腔鏡檢查的過程中醫師會取下一小塊的組織，利用顯微鏡觀察是否有癌細胞的存在 65,66。肝癌的治療除非在腫瘤很小時就被發現，否則肝癌很難被控制。然而，治療可減輕症狀並改善患者的生活品質。依疾病的分期、肝臟功能、患者的年齡及身體一般狀況不同，臨床的常規的治療方式包括手術、化學治療、放射線治療、生物製劑療法或合併使用 67。 1. 手術治療手術治療目的在切除腫瘤部份或置換肝臟，冷凍切除是一種經由冷凍殺死癌細胞的手術方法 19。 2. 肝動脈血管栓塞術（Transcatheter Arterial Embolization, TAE）正常肝臟有 70-75﹪的血液是由門靜脈所供應，只有 20-30﹪是來自肝動脈，而癌細胞之生長所需血液 90-95﹪來自肝動脈，若能將肝動脈閉塞，則肝癌細胞會因缺少血液之供應而壞死 68。肝動脈血管栓塞術是利用導管進入肝動脈靠近肝癌的地方注入含碘的油性栓塞物質（Lipiodol）及抗癌藥物之混合液使肝動脈閉塞。一般而言，肝動脈栓塞術對於大型肝癌、肝功能代償良好的患者，但它可能造成非肝癌部份的肝細胞壞死，所以對肝功能已失代償的肝癌患者，做完肝動脈栓塞術後可能會引發進一步肝衰竭而致死 69。 3. 經皮酒精注射法（Percutaneous Ethanol Injection）其原理是利用純酒精可以使細胞脫水、以及蛋白質凝固進而造成血管栓塞、阻塞而達到腫瘤壞死的效果。患者是否適合進行經皮酒精注射治療，其條件包括：所有腫瘤直徑不超過 3 公分，腫瘤數目少於 3 個， 7.

(21) 無腹水無出血傾向者。經皮穿肝高濃度酒精注射療法是經由局部麻醉後，以細長的針準確的插入腫瘤內，將 99.5﹪的高濃度酒精緩緩打入肝癌病灶部位。整個療程須多次進行，一般每週約 2-3 次。大部份經皮酒精注射治療之後的患者會有局部疼痛、發冷、顫抖、發燒之現象，經過服用少量止痛劑後，就可緩解 70。放射線治療原理是利用高能量射線殺死癌細胞或使腫瘤縮小。放射線治療分體內及體外治療。使用機器在體外進行照射即體外放療。直接置放一個裝有放射線物質的薄塑膠管子於腫瘤部位，即體內放射線治療。放射線治療時可併用一些藥物來增加癌細胞對放射的敏感度 71。化學治療肝癌的化學治療通常是插入細針到體內的靜脈或動脈。藥物會藉由血液循環進入全身以殺死肝臟外的癌細胞，故屬於全身性的治療。另外也有局部性的化學治療，將連續藥物注射的幫浦置放在體內，直接打入到達腫瘤處之血管。一般在手術移除腫瘤後，患者多半會在術後接受化學治療來殺死可能殘存的癌細胞。所以術後的化學治療稱為輔助性化學治療 19,72。高溫療法因為癌細胞比正常細胞對熱更敏感，利用一種特殊的機器來加熱身體某一部份一段時間以殺死癌細胞，藉此使癌細胞會死亡、腫瘤縮小稱為高溫療法，目前仍在臨床試驗階段 73。生物製劑療法又稱「生物反應調節劑療法」或「免疫治療生物製劑療法」，目前仍在臨床試驗階段，是利用一種讓身體自行對抗癌症的方法。某些物質由身體或在實驗室製造，被用來加強、指揮或恢復身體自然防禦機制以對抗疾病 61。二. 肺癌由於肝炎防治的成功大大降低了肝癌的威脅，加上空氣污染日益嚴重，因此肺癌的死亡率已淩駕肝癌，成為國人癌症的頭號殺手，而在跨 8.

(22) 入新世紀之後，預期兩者的差距還將逐漸拉大 1。肺癌的發生大多是不良的基因加上不佳的生活習慣和環境造成的。容易罹患肺癌的不良生活習慣或環境包括：吸菸及二手菸（百分之七十的男性與百分之三十的女性肺癌歸因於菸害）、空氣污染（近半的女性腺癌歸因於廚房油煙）、飲食習慣（高脂、低抗氧化物食物）、原有肺部疾病（譬如由肺結核的陳舊瘢痕長出瘢痕癌）、暴露於石棉粉屑或富含氡等輻射源的環境等。而不良基因是指容易致癌的不良體質或遺傳因素導致癌細胞失控、對於致癌物的清除能力較差、基因容易受損或基因受損後不易修復以及免疫功能有缺陷等 52,74,75。肺癌的種類依照生長的特性、患者的臨床表現，肺癌可區分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩大類型 76。在台灣的小細胞肺癌患者約佔肺癌患者的 12 ％，非小細胞肺癌患者則佔 88％。 1.. 小細胞肺癌（small cell lung cancer）：其發生與吸菸有關，這. 種肺癌生長快速，短時間就可能出現轉移，診斷時，約有一半的比例癌細胞已經擴散，常見的轉移部位為縱膈腔的淋巴結、肝臟、腦部、骨頭、骨髓與腎上腺。因此，手術通常並非適當的治療。不過，小細胞肺癌對化學治療及放射線治療比較敏感，因此，治療以全身性化學治療為主，對尚未發生轉移的病人治療期中再輔以放射線的局部治療，有八成以上的患者在治療後腫瘤明顯縮小一半以上。也有些極早期的病灶，採行手術切除腫瘤並加以化驗後，才確定為小細胞肺癌，因而在術後也應加以化學治療，以防止有潛藏的癌細胞轉移。大多數治療後腫瘤縮小一半以上的患者兩年內可能再復發，復發後易對先前使用過的化療藥有抗藥性且放射線治療效果也不佳 77。 2. 非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）：非小細胞肺癌主要包括腺癌、鱗狀細胞癌及大細胞癌三種類型，以腺癌最常見（包括肺泡細胞癌），特別是女性和不吸菸者和肺臟的舊瘢痕有密切關連（瘢痕癌常為腺癌），腺癌常發生在肺臟的週邊，容易在早期就波及肋膜，出現惡性積液，為惡性肋膜腔積液最常見的原因；鱗狀細胞癌常發生在較大的氣管而引起咳嗽、咳血等症狀，也易因阻塞呼吸道而出現喘鳴或阻 9.

(23) 塞性肺炎；大細胞癌比較少見，可能出現在肺臟任何部位，細胞分化度較差。非小細胞肺癌的生長比較緩慢，轉移也較遲緩，但對化療及放射線治療通常較不敏感，因此，理應及早開刀治療來尋求根治。但是此類的患者中，只有四分之一的患者能夠早期發現，可以完全切除的也只有 20 ％。而有淋巴結轉移，特別是縱膈淋巴結轉移的患者，術後出現轉移或復發的機會比較高。較晚期尚未發現轉移的局部肺癌，常需要多形式的混合治療，以提高患者的治癒率與存活率，特別是對於局部晚期原來不適合開刀的病例，約有三分之二的病人因術前化療變成可以接受手術，其中一半病例腫瘤可完全切除。即便不能開刀切除，在化學治療之後加上放射線治療或同時放、化療，也會有比較好的治療效果，這種先化療再手術的治療觀念也可應用到早期的非小細胞肺癌病例，因為早期的病例手術切除後的復發率，尤其是轉移擴散的機會，仍然相當的高，因此也應當視為全身性的疾病加以治療 78。對於早期的非小細胞肺癌患者若身體狀況不適合開刀，接受放射線治療後，也有少部分可以獲得根治。. 10.

(24) 第三節細胞週期近年來，隨著細胞和分子生物學的發展，人們逐步認識到細胞週期不僅與細胞增殖直接相關，而且也與細胞分化和凋亡有關，可見細胞週期調節失控是細胞癌化的重要原因 79。細胞週期是指各次細胞分裂之間的間隙，包括 G1、S、G2、M 四期。細胞週期調控是在各期的控制點（check points）上進行的 80。細胞週期中存在兩個重要的控制點：一個位於 G1 / S 交界處，在哺乳類動物細胞中稱為限制點（restriction point）80，當 G1 期內的正調節因數累積達到適當的程度而可以越過 R 點，以後就不須依賴細胞外促生長因數而順序完成整個細胞週期；另一個位於 G2 / M 交界處，它在染色體分開和細胞分裂前保證染色體均分的精確性 81。目前人們發現的細胞週期調控因數很多，可歸納三大類：（1）細胞週期素(cyclins)、（2）細胞週期素依賴性激酶（cyclin dependent kinases, CDKs）、（3） CDK 抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitor proteins, CKIs）。CDKs 是細胞週期調控的重要環節，其通過使下游蛋白（pRb 及其相關蛋白 p107、p130）的磷酸化來完成調節作用的 82；cyclins 是 CDKs 的正調節因數，能啟動 CDK 活性；CKIs 是負調節因數，可抑制 CDK 活性。現從 CDKs 及下游調節蛋白、cyclins 和 CKIs 三方面闡述細胞週期調控因數在細胞週期調節中的作用 83。一、CDKs 及其下游蛋白目前已發現的 CDK 至少有九種 84，分別命名為 CDC2 （CDK1）、 CDK2～CDK9，它們在基因序列上的同源性高，超過 40﹪。活化的 CDK 包含催化亞單位（CDK）和一個正調亞單位（cyclin），前者還需一個保守的 Thr 殘基上的磷酸化和 Tyr 殘基上的去磷酸化。. 11.

(25) CDK 被啟動後，可使其下游蛋白發生磷酸化。未磷酸化的 pRb 能夠結合轉錄因數 E2F，並抑制 E2F 啟動 S 期相關基因的轉錄。磷酸化的 pRb 或 pRb 能導致 E2F 的游離。游離的 E2F 與 DP-1 形成異源二聚體，能夠結合到 DNA 的特定位點，啟動 S 期相關基因轉錄，使週期越過 R 點，細胞即從 G1 期進入 S 期 85。二、Cyclins 目前已發現的 cyclins 有 12 種，分別命名為 cyclin A～H 84。根據細胞週期的時相，分為 G1、S 和 M 期以及作用尚未明確的 cyclins。cyclins 的過度表達可以啟動 CDK 活性，造成細胞週期調節失控，導致腫瘤的形成，因此 cyclins 也被稱為癌蛋白。 G1 期的 cyclins 包括 cyclin C、D、E 等三型，其中後兩型是主要的 cyclins。cyclin D 至少有 D1、D2、D3 等三個亞型，三型 cyclin D 的胺基酸序列同源性達 53.1﹪～ 63.5﹪，它們的 c 末端有一個富含哺氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的殘基序列，稱之為 PEST 序列，與蛋白質的降解有關；它們的 N 末端有一個與某些轉化蛋白如 SV40 的 T 抗原、腺病毒 E1A 蛋白、乳頭瘤病毒 E7 蛋白共同序列 Leu-X-Cys-X-Glu，此序列一樣可與 pRb 及 pRb 相關蛋白結合，隨後在 CDK4 / CDK6 的作用下，使 pRb 磷酸化，從而使細胞從 G1 期進入 S 期。一些生長因子（growth factors, GFs）可誘導它們的表達，一旦去除 GFs，cyclin D1 的水準會迅速下降，因此，稱它為生長因子感受器（growth factor sensors）86。在 G1 期，給正常的成纖維細胞顯微注射抗 cyclin D1 抗體，能夠阻止細胞進入 S 期，但在接近 G1 / S 交界處時則注射無效，這一結果表明 cyclin D1 在 G1 的中晚期發揮著重要作用。cyclin E 在 G1 期的表達晚於 cyclin D1，在 G1 / S 交界處達到高峰，進入 S 期後逐漸下降，給細胞顯微注射抗 cyclin E 抗體，可阻止細胞進入 S 期，因此被認為是調節 G1 / S 期轉換的必需蛋白 87。細胞進入 S 期後，cyclin E 降解，和它結合的 CDK2 被釋放出來和 cyclin A 結合。 S 期 cyclins 包括 cyclin A。它是 cyclins 中最早被發現的，在 G1 晚 12.

(26) 期於 cyclin E 之後表達，但直到 S 期與 CDK2 結合後才被啟動。給細胞顯微注射抗 cyclin A 抗體或反義 cyclin A 能抑制細胞 DNA 的合成，表明 cyclin A 在 S 期有重要作用 88。另外，它在 G2 期與 M 期和 CDC2 （CDK1）結合，可能與有絲分裂有關，因此，cyclin A 也被稱為 M 期 cyclins。三、CKIs 1992 年，Xiong 等在提煉純 cyclin-CDK 複合物時，得到了另外一些蛋白質，後來證明其中某些蛋白是該複合物的抑制因子即 CKIs 89。CKIs 在細胞週期中具有負性調節作用及多數在人類腫瘤中突變失活的事實，提示其可能是抑癌基因。根據它們序列同源性，可分為兩個族：第一族包括 p16、p15、p18 和 p19，它們均包含四次錨蛋白（ankyrin）重複結構和特異的調控 cyclin D-CDK4 或 cyclin D-CDK6 活性；第二族包括 p21，p27 和 p57，它們抑制多種 cyclin-CDK 活性. 90. 。. p21 基因定位於染色體 6p21.2，又稱為 cip1（CDK-interacting protein 1），waf1（wild-typep 53-activated fragment 1）。哺乳動物細胞中，p21 的功能至少有兩方面：一是 CDK 的抑制因子，另一個是能結合和抑制增殖細胞核抗原（PCNA），從而抑制 DNA 的複製。p21 的 N 端和 C 端分別擔負起這兩方面的作用 91。p21 能抑制多種 cyclin-CDK 活性，推測其突變可能是腫瘤形成的主要原因之一。然而目前除了在膀胱癌中發現一個終止密碼子的點突變外，尚未見到關於其他腫瘤細胞中 p21 基因突變的報導。p21 基因在轉錄水準上主要受 p53 調節和啟動，而 p53 基因突變在人類腫瘤中卻是常見的，故現認為 p21 基因主要失活機制與 p53 失活有關 92。. 13.

(27) 第四節細胞轉移 “轉移”一詞自1829 年由法國Jo sesh Claude Recamcer 提出，之後人們對腫瘤轉移機理的研究獲得很多有價值的新資訊93。逐漸瞭解癌細胞的轉移影響治療及癒後，並對於癌症的復發有重要的影響。惡性腫瘤在診斷時出現局部淋巴結轉移的比率1 / 3 ~ 1 / 4，而腫瘤致死亡的主要原因就是腫瘤細胞的轉移94。癌細胞浸潤和轉移過程非常複雜，大致可分為以下幾個過程： 1. 腫瘤血管的形成。 2. 癌細胞從原發部位脫落。 3. 癌細胞與細胞外基質、基底膜發生黏附並降解。 4. 脫落的癌細胞穿越血管壁進入循環並到達遠處部位。 5. 在繼發部位繼續增殖形成轉移病灶。腫瘤侵襲與轉移步驟最早是由 Liotta 所提出的粘附、降解和移動三步驟假說 95，但是隨著近年來對腫瘤為血管研究的深入，發現腫瘤的轉移與微血管的形成密切相關。一些文獻顯示，腫瘤惟有具備血管形成表現型之後才能轉變成惡性和具備轉移的能力，說明微血管的形成是腫瘤侵襲和轉移的關鍵 96。腫瘤血管形成的過程類似於正常血管生成的生理機轉，當腫瘤細胞分泌血管生成因子之後，可直接刺激附近的內皮細胞改變形狀，並遷移到腫瘤附近，開始分化形成血管並伴隨著基質降解酶以破壞基底膜，遷移後的內皮細胞不斷的增殖分化，在其前緣的部份持續增殖分化，而後緣的部份逐漸形成管腔結構，最後形成新生血管。許多研究顯示，促進血管形成的因數有很多，例如vascular endothelial growth factor（VEGF）、basic fibroblast growth factor（bFGF）、 transforming growth factor（TGF）、interleukin-8（IL-8）、matrix metalloproteinases（MMPs）及血小板生成刺激因子。其中，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是最有普遍意義的刺激因子，VEGF是內皮細胞專一的促有絲分裂因數，主要作用於內皮細胞上的flk、flt1、flt4等3個受體97，一方面可促進微血管內皮細胞增殖遷移，另一方面可促進微血管通透性增加98。有實驗顯示，比較單位體積 14.

(28) 腫瘤血管的表面積，VEGF表現的腫瘤是不表現者的六倍，而VEGF表達的減少顯著降低腫瘤體積血管密度和通透性進而造成轉移能力降低99。腫瘤發生浸潤轉移的過程主要是指癌細胞的粘附降解及細胞移行進入微血管中的過程，此過程有共同的分子機制它們非常協調一致地組織起來以共同發揮作用100。細胞粘附（cell adhesion）在惡性腫瘤轉移過程中具有重要作用，腫瘤細胞間的附著減弱使腫瘤細胞脫離與週遭細胞的附著，此為腫瘤浸潤即轉移的初步。接著，腫瘤細胞粘附於基質和血管內皮細胞並進入循環系統造成轉移101。在參與破壞細胞外基質的酵素中，基質金屬蛋白酶是重要的酵素，目前已知有 20 多中 MMPs，主要分類有（1）間質膠原酶類（2）明膠酶類（3）基質溶素類（4）膜類。其中明膠酶類中的 MMP-2 和 MMP-9 是研究較多的兩種。目前大量研究證實細胞外基質 ECM 的降解在腫瘤連鎖步驟中是關鍵步驟，而 MMPs 降解 ECM 的機制是因為 MMPs 家族是一個蛋白水解酶家族，能降解各類的膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等這些基底膜骨架。另外，MMPs 也能提高內皮細胞活動性及調節黏附作用 102。 PI3K 對於癌細胞的影響是多方面的，它也是轉移的上游調控蛋白及接受整合素和 FAK 上游信號的媒介之一，調節細胞的黏附與遷移。PI3K 若被專屬抑制劑渥曼青素抑制其活性，則會阻斷癌細胞的黏附，因此細胞黏附中均有 PI3K 的參與，由此認為，PI3K 在整合素介導的黏附反應中扮演了重要的角色，也證明 PI3K 在腫瘤的轉移中有重要的作用。比較直腸正常組織及其癌組織中 PI3K 蛋白表達，研究結果表明，PI3K 在癌組織中的表達明顯高於正常組織，並且隨著 DUKES 分期的進展及淋巴結轉移，PI3K 表達量逐漸升高，說明隨著腫瘤惡性度的增加 PI3K 的表達量逐漸升高，PI3K 被活化。有研究證實增加 PI3K 活性，可使高分化的結直腸癌向低分化型轉化 103。 NF-κB是一類廣泛存在於體內多種細胞的核轉錄因子，參與多種疾病病理生理過程。最早是由Sen和Baltimore在1986年首次發現的為調節小鼠B淋巴細胞中κ輕鏈表達的轉錄因子104，NF-κB在抗細胞凋亡、細胞增生、細胞轉移、血管生成的機轉上也扮演重要的角色，通常以同源或 15.

(29) 異源二聚體的形式存在，最常見的形式為P50 / P65組成的二聚體。細胞在非刺激狀態下，NF-κB與它的抑制物Iκ B結合而呈位活化的形式存在於胞質，當細胞受到損傷刺激後，由I-kappa B kinase（IKK）來降解I-κ B 而使NF-κB可以進入細胞核。從許多研究成果中發現Protein kinase C （PKC）、Akt可促使I-kappa B kinase（IKK）來分解I kappa B，致使NF-κB 進入細胞核進而使NF-κB可以調節細胞癌化。近年研究發現，NF-κB 與癌症的發生、發展和轉移有關，其中重要機制就是NF-κB 可能通過調節 COX-2 的表達在癌細胞增殖過程中起重要作用38,105。 COX-2 是一種誘導性酵素，在正常生理狀態下多數組織檢測不到，只有在細胞因子、腫瘤促進劑、癌基因等刺激下才能在細胞內迅速產生。Su 106 等的研究表明，COX-2 可能通過 EP1 和 HER-2 / Neu 受體途徑上調控血管內皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）的表達，進而促進肺腺癌的淋巴管生成和淋巴結轉移。其中，血管內皮生長因數 C（vasular endothelial growth factor C, VEGF-C）是血管內皮生長因子家族中專一作用于淋巴內皮的成員。. 16.

(30) 第五節細胞壞死與細胞凋亡的比較一. 細胞凋亡與細胞壞死在形態上的差異：表 2-1：細胞凋亡與細胞壞死在形態上的差異 107 Apoptosis. Necrosis. 首先細胞皺縮. 首先細胞膨脹. 染色質濃縮成類似新月形碎. 染色體濃縮成小叢，外表呈不規則. 片，並貼附在細胞核內面. 狀，最後消失. 胞器仍完整. 胞器不完整，如粒線體不正常腫脹. 細胞膜皺縮成不規則突起狀，細胞膜破裂形成 Necrotic debris 最後形成凋亡小體，其外仍有完整細胞膜被鄰近巨噬細胞清除. 被單核吞噬系統清除. 無發炎反應. 有發炎反應. 為生理現象. 為病理現象. 17.

(31) www.bioon.com/biology/cellular/40103.shtml 圖 2-2 細胞凋亡與細胞壞死的形態區別. 二.. 細胞壞死細胞凋亡在分子機轉上的差異除了形態上的差異，細胞壞死與細胞凋亡在分子機轉上也存在具體. 的差異。在細胞凋亡方面，caspase 系列包括屬於外在路徑的 caspase 8、 18.

(32) 內在路徑的 caspase 9 及共同路徑的 caspase 3 皆呈現活化的現象，進而使 PARP 分裂成不活化態 108。Apaf-1 由粒線體所釋放，若 Apaf-1 的表現量增加，其會與 caspase 9 及 cytochrome c 結合形成 apoptosome，導致 caspase 3 活化 109，並活化一連串的下游反應，最終導致細胞凋亡。另外，凋亡誘導因子（AIF）與核酸內切酶（Endo-G）也是從粒線體釋放，直接作用於細胞核，引起 DNA 片斷化，進而引起細胞凋亡，這兩個蛋白的作用過程，不受 caspase 系列影響而獨立於 caspase 之外，在細胞凋亡過程中，由於胞器完整，細胞膜也完整，故蛋白的生合成是持續進行的 110. 。在細胞壞死的早期階段，因為胞器及細胞膜已受到損害，因此一些. 蛋白的生合成往往呈低落狀態，故在 caspase 系列的蛋白及 Apaf-1、AIF 及 Endo-G 的表現量皆降低；而因應 DNA 損害的修復蛋白 PARP 除了生合成會相對增加，也因為 caspase 的表現量沒有增加，PARP 的裂解也就沒有增加，故活化態的 PARP 就沒有降低，在 PARP 修復 DNA 的過程，需要消耗 ATP，因此 PARP 的表現量增加且伴隨著細胞內 ATP 濃度下降是細胞壞死的主要特徵 111。. 19.

(33) 第三章研究設計與研究架構第一節研究設計探討大黃酚對於人類肝癌細胞 Hep3B 及肺癌細胞 A549 的影響：（1）是否可以抑制人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 的生長；（2）影響細胞週期及細胞凋亡或細胞壞死的進行，以找出抑制細胞生長或促使細胞壞死的調控因子；（3）找出影響細胞移動及穿透的調控因子，透過這些因子的調控，證明大黃酚抑制人類肝癌細胞株 Hep3B 及肺癌細胞株 A549 的機轉。. 第二節研究架構. 圖 3-1 實驗架構. 20.

(34) 第四章材料與方法第一節實驗材料一、細胞來源本論文的實驗細胞株有兩株，分別為人類肝癌細胞株 Hep3B 及人類肺癌細胞株 A549，皆購自新竹食品工業發展研究所菌種中心。 A. Hep3B 表 4-1：Hep3B 細胞株相關資料 Cell No.. 60434. Cell type. Human hepatocellular carcinoma. Species. Homo sapiens（human）. Strain / Ethnicity. Black. Age / Stage. 8 years. Gender. Male. Tissue. Liver；hepatocellular carcinoma. Growth property. Adherent. Morphology. Epithelial. Incubation condition. 37 ℃；5﹪CO2. Culture medium. 90﹪DMEM（debulco minimum essential medium）＋10﹪fetal bovine serum＋5 mL L-glutamine＋5 mL P/S. Freeze medium. 93﹪culture medium＋7﹪DMSO. 21.

(35) B. A549 表 4-2：A549 細胞株相關資料 Cell No.. 60074. Cell type. Human lung carcinoma. Species. Homo sapiens（human）. Strain / Ethnicity. Caucasian. Age / Stage. 58 years. Gender. Male. Tissue. Lung carcinoma. Growth property. Adherent. Morphology. Epithelial. Incubation condition 37 ℃；5﹪CO2 Culture medium. 90﹪Ham's F-12K medium with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g / L -sodium bicarbonate + 10﹪fetal bovine serum. Freeze medium. 93﹪culture medium＋7﹪DMSO. 二、實驗藥物大黃酚：購自 Sigma, MO, USA 公司三、藥品試劑 1. Agarose Ⅰ：購自 Amresco 2. Acrylamide / Bis 40﹪solution（ACRYL / BISTM 29:1）：購自 Amresco 3. Ammonium persulfate（APS）：購自 Amersco 4. ATP Determination Kit：購自 Blossom Biotechnologies,Inc. 5. BioMax Flim：購自 Kodak 6. Bovine serum albumin（BSA）：購自 Merck 7. Dimethyl sulfoxide（DMSO）：購自 Sigma Chemical Co. 22.

(36) 8. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DioC6）：購自 Molecular Probes 9. Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4）：購自 Merck 10. DMEM medium：購自 Gibco 11. ECL kit（Enhanced chemiluminescent kit）：購自 Amersham 12. Ethanol：購自 TEDIA 13. Fetal bovine serum（胎牛血清；FBS）：購自 Gibco 14. Formaldehyde：購自 Merck 15. Glycine：購自 Amresco 16. Ham's F-12K medium：購自 Gibco 17. L-Glutamine（麩胺酸；LG）：購自 Gibco 18. Methanol：購自 TEDIA 19. Penicillum Streptomycin（PS）：購自 Gibco 20. PhiPhiLux®-G1D1 kit：購自 OncoImmunin（Gaithersburg；MD； USA） 21. Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4）：購自 Merck 22. Potassium chloride（KCl）：購自 Merck 23. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad 24. Protein marker：購自 Femantas 25. Propidium iodide（PI）：購自 Sigma Chemical Co. 26. RNase A（Ribonuclease A）：購自 Ameresco 27. 10X SDS buffer（Sodium dodecyl sulfate）：購自 Amresco 28. Sodium chloride（NaCl）：購自 Merck Trypsin-EDTA：購自 Amersco 29. Trypan blue：購自 Sigma Chemical Co. 30. Triton X-100：購自 Sigma chemical Co. 31. TEMED（N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine）：購自 Amresco 32. Tris（Tris（hydroxymethyl）-aminomethane）：購自 Amresco 33. Tween 20：購自 Amresco 34. 顯影劑：購自 Kodak 23.

(37) 35. 定影劑：購自 Kodak 36. 核酸純化試劑組（DNA purification kit）：購自 Gene Mark 37. 蛋白質萃取試劑（protein extraction solution）（PRO-PREP）：購自 iNtRON Biotechnology, INC. 38. 5X TBE buffer：購自 Amresco 39. Primary antibody （1°抗體）： (a). anti-actin：購自 Oncogen (b). anti-casoase 3：購自 Upstate (c). anti-caspase 8：購自 Upstate (d). anti-caspase 9：購自 Upstate (e). anti-cytochrome c：購自 Oncogen (f). anti-CDK2：購自 Upstate (g). anti-phosporylation ERK：購自 Upstate (h). anti-JNK：購自 Upstate (i). anti-Phosporylation JNK：購自 Upstate (j). anti- NF kappa B Rel—a(p65)：購自 Upstate (k). anti-p38：購自 Upstate (l). anti-p53：購自 Oncongen (m).anti-PARP：購自 Upstate (n). anti-MMP-1：購自 Oncongen (o). anti-MMP-2：購自 Sigma Chemical Co. (p). anti-MMP-7：購自 Oncongen (q). anti-MMP-9：購自 Sigma Chemical Co. 40. Secondary antibody（2°抗體）： a. anti-mouse IgG（HRP）horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon b. anti-rabbit IgG（HRP）horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon. 24.

(38) 四、儀器設備 1. 細胞培養皿：購自 FALCON 2. 細胞培養盤：購自 FALCON 3. 細胞培養箱：購自 Nuaire 4. 細胞計數器（haemocytometer）：購自 Boeco 5. 倒立式位像差顯微鏡（phase-contrast microscope）：購自 Olympus 6. 微量天平 (TE-200; MILLTER) 7. 去離子水製造機：購自 Minipore 8. 電源供應器：購自 Amersham 9. 酸鹼值測定計（C831）：購自 Consort 10. DNA 電泳槽：購自 Mupid-2 11. Mini-3D Shaker：購自 Boeco 12. PVDF membrane：購自 Minipore 13. SDS-PAGE 電泳槽套組：購自 Bio-Rad 14. Transfer Cell Blot 套組：購自 Bio-Rad 15. 加熱板：購自 Lab-Line 16. 流式細胞計數儀（flow cytometry）：購自 Becton Dickinson 17. 高速離心機：購自 HERMLE 18. 分光光度計：購自 Beckman 19. 光學顯微鏡（Nikon LABOPHOT-2）：購自 Nikon 20. 酵素免疫分析儀（Anthos 2020）：購自 Anthos Labtec, Australia. 25.

(39) 第二節實驗方法一、細胞解凍細胞解凍的過程須掌握快速的原則，否則重新結晶的冰晶與濃度過高的 DMSO 將會造成細胞傷害。DMSO 具有介面活性劑的性質，對於細胞膜具有傷害性，但是 DMSO 的濃度小於 1﹪的情況下是安全的，為了避免在凍細胞的過程中，因水分形成的冰晶傷害細胞，往往將 DMSO 的濃度調高到 7﹪以作為抗凍的措施。所以當快速解凍後也必須快速的加入培養基以稀釋 DMSO 到 1﹪以下。在細胞解凍前，預先取 9 mL 的新鮮培養基（DMEM 或 F12K）至離心管中備用，再從液態氮桶中取出裝有 Hep3B 或 A549 的冷凍管。將冷凍管置於水浴槽內於 37 ℃下迅速回溫，在未完全解凍尚有些許小冰塊的狀態下，在無菌操作檯中，將細胞吸取到裝有培養基的離心管中，稍微搖勻之後再進行離心。轉速為 1500 rpm，需時 5 分鐘。離心後丟棄上清液，稍微拍散離心後的細胞團塊，再加入新鮮培養基 10 mL 並混合均勻形成細胞懸浮液，將細胞懸浮液注入培養瓶（flask）中培養，隔天觀察細胞貼附的狀況並更換新鮮的培養基，大約培養一星期後，在細胞恢復正常活性後才開始做實驗。. 26.

(40) 二、人類肝癌細胞株 Hep3B 與肺癌細胞株 A549 的培養（1）培養基的製備人類肝癌細胞株 Hep3B 以 DMEM 500 mL，內含 10﹪胎牛血清、2 mM 的 Penicillin / Streptomycin 及 2 mM 的 L-glutamine。人類肺癌細胞株 A549 以 F-12K 500 mL，內含 10﹪胎牛血清、2 mM 的 Penicillin / Streptomycin 及 2 mM 的 L-glutamine。（2）細胞的培養人類肝癌細胞株 Hep3B 與肺癌細胞株 A549 的培養條件皆是培養在 37 ℃、5﹪CO2 的 incubator 中培養，約每隔 1~2 天更換一次培養基，直到瓶中細胞長到八分滿為止，再視需要以進行分盤或繼代。（3）細胞繼代與細胞分盤當細胞成長到八分滿即可將細胞取下進行分盤或繼代培養，以免細胞過度擁擠導致細胞狀態不佳，甚至造成細胞形態改變。方法：當細胞長到八分滿，在無菌操作檯內將培養液取出棄於廢棄桶內，用 PBS 細胞 1 ~ 2 次，接著加入 0.1﹪trypsin 約 2 ~ 3 mL，細胞脫落後，用新鮮培養基中和 trypsin，將所有的細胞懸浮液取出，裝入離心管中，以 1500 rpm 離心五分鐘，離心後倒掉上清液，輕拍管底部以分散細胞團塊，加入 10 mL 新鮮培養基，用電動吸量管反覆吸吐以充分混合細胞液，分取 20μL 細胞懸浮液到 eppendorf 內以進行細胞計數。計算完細胞數目後，依實驗所需求的細胞數目，從細胞懸浮液中取出足夠的細胞量進行分盤，以供實驗操作進行。 5. 若只是要繼代培養，則取 10 × 10 個細胞或只取十分之一的細胞懸浮液回種於培養瓶中即可。. 27.

(41) 三、細胞計數與細胞死活的辨別以血球計數盤（hemocytometer）計算細胞的數目，血球計數盤一般有溝槽所區分成兩個區塊，每個區塊中有細刻九宮格圖案，九宮格的邊長為 3 mm，深度為 0.1 mm，九宮格的四個角落的正方形再加上中間的正方形共五格，是用來計算細胞的區域。若蓋上蓋玻片後，整個九宮格 2. -4. 的體積為 9 mm x 0.1 mm＝9 x 10 mL。其中的每一格體積為 1.0 x 10. -4. mL。數細胞時，在顯微鏡下以既數器計算四個角落及中間的方格等五格內的活細胞數目，總數除以五（每格的平均細胞數），再乘以五（稀釋 4. 倍數），再乘以 10 ，即為每 mL 中的活細胞數。取 20μL 的細胞懸液與 80μL 0.4﹪的 trypan blue 均勻混合，形成五倍的稀釋液，再取 20μL 的稀釋液注入於細胞計數盤上蓋玻片的邊緣，當藍色的液體完全蓋過溝槽所圍繞的區域後，在倒立式位相差顯微鏡下計數五個大方格的細胞總數，依照上述的乘除方式即為每 mL 細胞懸液的細胞數，對於位在每格週邊線上的細胞，則取每一方格同一側的格線為計數範圍。若以 trypan blue 作為細胞染料，染料會滲入死細胞中而呈藍色，活細胞因為細胞膜完整，染料無法進入細胞中而不會呈藍色，可依此判斷細胞的死活。四、大黃酚與 PBS 的配製（1）大黃酚的配製大黃酚以 DMSO 為溶劑，大黃酚的分子量為 254.23，秤取 25.42 mg 的大黃酚溶於 10 mL 的 DMSO 中可配置成濃度為 10 mM 的大黃酚溶液，以此濃度的大黃酚溶液為 stock 以備用，待實驗所需的濃度與用量再予以稀釋，儲存時須避光於 -20 ℃的冰箱。（2） PBS 的配製製備 10 倍的 PBS，秤取 NaCl 160 g；KCl 4 g；Na2HPO4 23 g； KH2PO4 4 g ，加 D.D.Water（double deionized water）至 2 公升，利用攪拌子攪 28.

(42) 拌使完全溶解，以 0.2μm 的濾膜過濾，使用時在加以稀釋成 1 倍的濃度。表 4-3：10 倍濃度磷酸鹽緩衝溶液（10X phosphate buffer saline, PBS）組成. 重量（g）. NaCl. 160. KCl. 4. Na2HPO4. 28.8. KH2PO4. 4.8. Add D.D.Water 2000 mL 五、檢測大黃酚對人類肝癌細胞株 Hep3B 與肺癌細胞株 A549 成長的影響 A. 利用倒立式位相差顯微鏡觀察細胞形態的變化 5. 將繼代後的細胞分盤到 6 well 的培養盤，每 well 以 2 × 10 cells / 3 mL 的密度培養，放入培養箱中培養 24 小時後，依濃度差的方式加藥，分別在 24 h、48 h、72 h 時間後在倒立式位相差顯微鏡下以 200 倍的倍率觀察並照相。 B. 利用流式細胞儀檢測細胞存活率本實驗利用流式細胞儀測定癌細胞經藥物處理後是否被藥物所毒殺或抑制增生。（1）細胞存活率的測定原理流式細胞儀的分析原理是利用染劑在不同的狀態下會產生不同波長或不同強度的螢光，依照流式細胞儀偵測不同波長或強度螢光的量可區分、定量不同狀態的細胞，所以結合流式細胞儀與不同的染劑，可快速、精確的分析與定量細胞的各種性質。本實驗的方式是利用 Propidium Iodide （PI）作為染劑，由於 PI 是. 29.

(43) 一種核酸染劑，容易結合在 DNA 中的 A ＝ T 鍵與 C ≡ G 鍵上，在雷射光的激發下會散射出紅色的螢光，經流式細胞儀內的偵測器接收後進行分析。若細胞處在健康無破壞的狀態下，PI 染劑無法進入細胞內，也就無法進入細胞核中與 DNA 結合。反之，因細胞膜破損而可以進入核中與 DNA 結合的 PI，會放出較強的紅色螢光 112,113。. (Death cells). (Live cells). 圖 4-2-A 流式細胞儀 Propidium Iodide 染色之細胞存活率分析圖。（2）Propidium Iodide 染劑的配製先配製濃度為 20 mg PI / 100 mL PBS 的 PI stock 做為保存，當實驗需要時，則以 PBS 稀釋 50 倍，一般的方式是取 1 mL 的 PI stock 加入 49 mL 的 PBS 中作為稀釋。（3）存活率實驗步驟 1. 分盤 5. 將繼代下來的細胞種植到 6 well 的培養盤，每 well 以 2 × 10 cells / 30.

(44) 3 mL 的密度培養，放入培養箱中培養 24 小時，待細胞貼壁後再加藥。 2. 藥物處理細胞在培養箱中培養 24 小時後，先觀察細胞貼壁狀況、細胞的形態是否正常及細胞疏密狀況，以決定是否適合進行實驗。本實驗依濃度差的方式加藥，藥物處理完後分別持續培養 24、48、72 小時。 3. 收取細胞在藥物處理後，依不同的時間點收取細胞。首先將 well 中的培養液吸取到離心管中，用 PBS 清洗每 well 細胞，用 0.1﹪trypsin 處理貼壁的細胞使細胞脫落成懸浮狀態。加入 PBS 以中和 trypsin 的作用，再吸取到離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉離心後的上清液，再用 PBS 清洗細胞後離心第二次，去掉上清液。 4. 加入染劑加入 PI 染劑 500μL（可依照細胞數目作調整），均勻混合後，轉移到 FACS 管中，以流式細胞儀進行細胞分析，並紀錄細胞存活百分比（percentage of viability）。. 31.

(45) 六、檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 細胞週期的影響 A .利用流式細胞儀分析人類肝癌細胞株 Hep3B 與肺癌細胞株 A549 的細胞週期：本實驗分別進行濃度差及時間差兩種實驗，濃度差實驗的分盤、加藥及收細胞的方式如同前述細胞存活率實驗的步驟。時間差的藥物處理，只使用 IC50 的濃度為加藥濃度，依不同的時間點（6、12、24、48、 72 hr）分別收取細胞。 1. 細胞固定細胞在第二次離心後，倒掉上清液，稍微刮散細胞團塊，以 4 ℃、 70﹪的酒精進行細胞固定（vortex 低速震盪，酒精一滴一滴沿著管壁緩慢流入），每一管約加入 2 mL 的酒精。完成後，將固定的細胞置於–20 ℃ 的冰箱中使細胞均勻固定完全，一周內進行分析。 2. 加入染劑細胞置於–20 ℃的冰箱中的固定至少 overnight，隔天將細胞從冰箱取出離心（1500 rpm、5 分鐘），去除上清液，加入 2 mL 的 PBS 清洗一次後，再離心一次，倒掉上清液，刮散細胞團塊，最後在每個離心管中加入 500μL 的 PI 染劑（可依照細胞數目作調整），均勻混合後，形成細胞懸液，將細胞懸液轉移到 FACS 專用管中，避光 30 分鐘，之後以流式細胞儀分析，每秒鐘細胞數不超過 200 顆細胞，每個 FACS 管收集 10000 顆細胞，以 Modfit LT® 軟體進行分析 113,114。 B .利用西方墨點法（Western blotting）檢測參與 Hep3B 與 A549 細胞週期的調控蛋白活性：（1）細胞蛋白萃取 6. 2. 將細胞以 2 × 10 / dish 的細胞量種植於 10 cm 的 dish 中，每 dish 的培養基量為 10 mL，細胞貼附後，加入 5 mM 濃度大黃酚 100μL 到每一個 dish 中，依不同的藥物作用時間（0、6、12、24、48、72 小時），依序收取細胞。首先將 well 中的培養液吸取到離心管中，用 PBS 清洗每 well 細胞，用 0.1﹪trypsin 處理貼壁的細胞使細胞脫落成懸浮狀態。 32.

(46) 加入 PBS 以中和 trypsin 的作用，再吸取到離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉離心後的上清液，再用 PBS 清洗細胞後離心第二次，去掉上清液後，小心將剩餘的水分吸乾，依細胞量多寡加入 lysing buffer，一 6. 般約每 5× 10 的細胞需加入 400μL 的 lysing buffer，將細胞混合均勻後，置於-20 ℃冰箱 overnight，隔天以 14000 rpm 離心 5 分鐘，取其內含有細胞蛋白上清液，再進行蛋白質定量。（2）蛋白質濃度測定 1. 蛋白質標準品檢量線製作以 bradford 定量法，使用胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin； BSA）為蛋白質標準品配置不同濃度的蛋白質標準品後（表 4-4），利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D. 595 nm 的條件下測量蛋白質標準品吸光值做檢量線（standard curve）分析，求出趨勢線方程式及 r2 value。步驟：先取bradford染劑2 mL加8 mL二次水形成5倍稀釋，混合均勻後備用，取15μL配製好蛋白質標準品（BSA）加735μL 的b bradford 染劑共750μL混合均勻，以每well加入200μL的量，加入96 well plate 中，靜置5 min後測量吸光值，測得標準品之吸光平均值，以O.D. value （Y）對蛋白濃度μg / mL（X），求出趨勢線方程式：Y = a X + b，R2 value 要趨近於0.99。表 4-4 ：蛋白質標準品之配製蛋白質濃度(μg / mL） 100 mg / mL BSA（mL） D.D.Water（mL） 100. 500. 0. 80. 400. 100. 60. 300. 200. 40. 200. 300. 20. 100. 400. 0. 0. 500. 33.

(47) 2. 樣品蛋白質定量取 15μL 樣品蛋白質與 5 倍稀釋的 Bradford 染劑 735μL 混合，反應 5 分鐘後，連同蛋白質標準品一起測定吸光值，所得之吸光值平均，帶入 Y 值（Y = a X + b），求出該 sample 的蛋白質濃度（μg / mL）。（3）SDS-PAGE 電泳分析 1. 試劑材料（表 4-5 至表 4-8）表 4-5：SDS-PAGE 下層膠（separation gel）之配製及組成. 組成. 10﹪separation gel 12﹪separation gel （四片量）. (四片量). 40﹪acrylamide/Bis（29:1）. 5 mL. 6 mL. running buffer. 5 mL. 5 mL. 10﹪SDS. 0.2 mL. 0.2 mL. 10﹪APS. 0.2 mL. 0.2 mL. TEMED. 20μL. 12μL. 表 4-6：SDS-PAGE 上層膠（stacking gel）之配製及組成組成. stacking gel（四片量）. D.D.Water. 4.06 mL. 40﹪acrylamide / Bis（29：1）. 1.02 mL. stacking buffer. 1.66 mL. 10﹪SDS. 66μL. 10﹪APS. 33.4μL. TEMED. 12μL. 34.

(48) 表 4-7：電泳緩衝液（running buffer；1.5 M Tris-HCl, pH 8.8）之組成組成. 重量. Tris. 36.3 g. D.D.Water. 150 mL. HCl. 調整至 pH 值為 8.8. 加 D.D.Water 到總體積為 200 mL. 表 4-8：stacking buffer（0.5 M Tris-HCl, pH 6.8）之組成組成. 重量. Tris. 3g. D.D.Water. 40 mL. HCl. 調整至 pH 值為 6.8. 加 D.D.Water 到總體積為 50 mL 2. 電泳膠片製作將配製好的下層膠（表 4-5）注入鑄膠台中，再以 isopropanol 去除氣泡並壓平下膠，靜置一段時間，可觀察管子當中的剩餘下層膠是否凝固，約需 40 分鐘使下層膠凝固後，將 isopropanol 倒掉，注入上層膠（表 4-6）並插上 comb，並避免 comb 的下緣有氣泡產生，待上層膠凝固約需 15 分鐘。 3. 電泳將製好的膠體放置於電泳槽中，加入電泳緩衝液（running buffer；表 4-7），預先將將萃取出的蛋白質與 5X protein loading dye 混合並以 95 ℃加熱 10 分鐘後，在冰上冷卻後低速離心，依序將標示標準分子量的 multimaker 5μL 及各 sample 18μL 注入膠體的孔槽中，通以電壓 90 伏 35.

(49) 特（volts），待樣品通過 stacking gel 後，電壓調高為 110 volts，繼續進行電泳，當 SDS-PAGE 染劑跑到 SDS-PAGE 膠片底部後或視需要，即可停止電泳。 4. 轉漬步驟先將PVDF membrane事先裁剪好，以methanol濕潤10秒後，再浸入轉漬緩衝液中（transfer buffer；表4-9），接著將事先裁好的3M濾紙先浸泡在transfer buffer中備用，將轉漬夾打開後，黑色面為底部並朝上，將預先以transfer buffer潤濕的海綿墊片鋪在黑夾上，再將3M濾紙鋪上，接下來裁剪下層膠中所要轉漬的區域後，將SDS-PAGE gel小心的鋪於3M 濾紙上，可在濾紙上加入多量的transfer buffer，鋪上SDS-PAGE gel時勿陷入任何氣泡，依序放上PVDF membrane（同樣避免氣泡產生），及3M 濾紙，最後放上一片海綿墊片，再把整個轉漬夾裝好，形成類似三明治夾層狀之構造（圖4-2-2）。置入已裝有transfer buffer的電泳槽中將黑夾朝負極，紅夾朝正極，電泳槽外圍放置足夠冰塊，使整各系統維持低溫狀態，以免在轉漬的過程中，因溫度過高而熔化SDS-PAGE gel。以400 mA、90分鐘的條件下進行蛋白質轉漬。轉漬完成後取出轉漬膜裁去多餘部分，轉漬膜以0.05﹪的tween-20 / 1X PBS清洗3次，每次至少5分鐘。緊接將轉漬膜以2﹪的FBS（溶於0.05﹪tween 20 / 1X PBS中）進行 blocking的步驟，以室溫1小時為條件進行。blocking之後以0.05﹪的tween 20 / 1X PBS清洗轉漬膜3次，每次至少5分鐘。倒掉清洗液，加入8 mL的一級抗體（溶於新鮮配製的blocking solution中，稀釋倍數依不同抗體有所不同），在4 ℃下進行搖盪。隔天一級抗體回收，再以0.05﹪的tween 20 / 1X PBS 清洗轉漬膜3次，每次至少5分鐘。加入8 mL稀釋10000倍的goat anti-IgG（HRP）horseradish peroxidase conjugated antibody 二級抗體（溶於含2﹪FBS的0.05﹪tween 20 / 1 X PBS中），於室溫下搖盪1小時，最後取出轉漬膜，以0.05﹪的tween 20 / 1 X PBS清洗3次。. 36.

(50) 表4-9：轉印緩衝液（transfer buffer）之組成組成. 重量. Tris. 4.5 g. glycin. 21.6 mL. methanol. 300 mL. 加 D.D.Water 到總體積 1500 mL. 紅、正極（＋）. 黑、負極（－）. 圖 4-2-B 西方墨點法-轉漬夾的內部組成. 5. 暗房壓片步驟將轉漬膜浸泡於ECL混合液中（每瓶各取2 mL等比例混合）1分鐘反應。轉漬膜並正面朝上放置於壓片卡匣（cassette）內的兩張透明投影片中間，以hyperfilm軟片置於上層投影片上，對齊轉漬膜進行壓片，感光時間依轉漬膜上螢光亮度決定時間長短，約15秒至30分鐘不等。感光完後放入顯影劑進行顯影步驟（時間依實際觀察決定），再以清水沖洗後浸泡在定影劑中，過30秒後再浸泡清水沖洗。. 37.

(51) 表 4-10：PBS-tween 20 之組成組成. 重量. Tween 20. 500μL. PBS. 1000 mL. 38.

(52) 七、檢測大黃酚對人類肝癌細胞 Hep3B 與肺癌細胞 A549 產生細胞壞死的影響 A. 利用 DAPI 染色觀察細胞核內 DNA 破壞情況 1. 原理 DAPI 是一種專一性的核酸螢光染劑，會 binding 在 DNA 雙股螺旋之小溝（minor groove）上，當 DNA 受損時會有 DNA 斷裂的情形發生，若細胞核受損越嚴重，DNA 斷裂得越多，則可接上越多的 DAPI 分子，並且 DAPI 與 DNA 接上與否，所散射的螢光強度有很大的差異，透過顯微鏡，可觀察到接上 DAPA 分子的 DNA，其螢光亮度比較強 115。. DAPI 染劑. 圖 4-2-C. DAPI 染劑鍵結在 DNA 雙股螺旋小溝上 116. 2. 實驗步驟將細胞分盤，種於 6 well plate 當中，每 well 種 2 × 105 個細胞（培養基每 well 需 2 mL），隔日細胞貼附後，加入不同濃度的大黃酚，培養 48 小時。 48 小時後進行收細胞，吸取上層液丟棄，加入 PBS 洗 3 次，加入 3 ﹪的 formaldehyde / PBS 固定 10~15 分鐘，再加入 PBS 洗 3 次後，加入 0.1﹪Triton X-100 / PBS（1 mL）15 分鐘，再用 PBS 洗 3 次，接下來在 39.