原子力顯微術應用：鐵蛋白結構變異分析

全文

(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授. 王忠茂. 博士. 原子力顯微術應用：鐵蛋白結構變異分析. 研究生. 張家偉. 中華民國一百零二年六月.

(2) 目錄圖目錄......................................................................................................... I 表目錄..................................................................................................... VII 中文摘要 .....................................................................................................i 英文摘要 ................................................................................................... ii 第一章緒論 .............................................................................................. 1 第二章實驗 .............................................................................................. 7 2.1 化學藥品 ..........................................................................................7 2.2 實驗設備 ..........................................................................................9 2.3 修飾電極的製備 ............................................................................10 2.4 原子力顯微鏡的操作步驟 ............................................................12 第三章實驗結果與討論 ........................................................................15 3.1 鐵蛋白之力曲線(Force curve)分析 ..............................................15 3.2 其他蛋白質的 Force Curve 分析 ..................................................24 3.3 蛋白質變性結構分析 ....................................................................33 3.4 磁效應原子力顯微鏡影像分析 ....................................................42 第四章結論 ............................................................................................44 第五章參考文獻 ....................................................................................45 第六章附錄 ............................................................................................47.

(3) 圖目錄圖 1-1 FT 的結構構型，其中心核的組成為[FeO(OH)]8[FeO(H2PO4)]。 .....................................................................................................................2 圖 1-2 常見 SPM 之分類與功能。 ..........................................................3 圖 1-3 兩原子間位能與相對距離的關係圖。 ........................................4 圖 1-4 磁性模組原子力顯微術掃描示意圖。 ........................................5 圖 1-5 力曲線圖(左)與探針與樣本位置關係圖。 .................................6 圖 3-1 (a)空白 ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT 與(d) ITO|TC|apoFT 之 C-AFM 影像圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ...................................................................16 圖 3-2 以 Pt-coated AFM 導電探針對(a) ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT 與(d) ITO|TC|apoFT 所測得之 I-V 曲線，掃瞄速度：0.67 Hz。 ..........................................................................................................17 圖 3-3 以 Pt-coated AFM 導電探針對(a) ITO；(b) ITO|TC；(c) ITO|TC|FT；(d) ITO|apoFT 所測得之 force 曲線，掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................20 圖 3-4 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。..........................................22 圖 3-5 (a) ITO|TC、(b) ITO|TC|FT 與(c) ITO|TC|apoFT 之吸引力與施加 I.

(4) 偏壓間的關係。 ......................................................................................23 圖 3-6 ITO|TC|DNA 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ...........................................................................25 圖 3-7 ITO|TC|GOx 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ...........................................................................26 圖 3-8 ITO|TC|BSA 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ...........................................................................27 圖 3-9 ITO|Fe3O4 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ....................................................................................28 圖 3-10 ITO|TC|FT 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。 ......29 圖 3-11 ITO|TC|apoFT 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。 29 圖 3-12 ITO|TC|DNA 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。 ..30 圖 3-13 ITO|TC|GOx 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。...30 圖 3-14 ITO|TC|BSA 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。...31 圖 3-15 ITO|TC|Fe3O4 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。 .31. II.

(5) 圖 3-16 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ..............................34 圖 3-17 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 2 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ..............................35 圖 3-18 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ..............................36 圖 3-19 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ..............................37 圖 3-20 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 ..............................38 圖 3-21 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後之 C-AFM 影像圖 (上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 .....................39 圖 3-22 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後之 C-AFM 影像圖. III.

(6) (上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。 .....................40 圖 3-23 FT 與 apoFT 所量得的引力對浸置 NaOH 的的時間的關係圖。 ...................................................................................................................41 圖 3-24 (a)空白 ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT、(d) ITO|TC|apoFT 與(e) ITO|Fe3O4 之未施加偏壓(左)與施加偏壓(樣本接地)：2 V 的 MFM 影像圖。掃瞄速度：1 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，lift height：6 nm。 .........................................................................................................43 圖 6-1 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................47 圖 6-2 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。..........................................48 圖 6-3 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|DNA 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。..........................................49 圖 6-4 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|GOx 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；. IV.

(7) (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。..........................................50 圖 6-5 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|BSA 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。..........................................51 圖 6-6 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|Fe3O4 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。...............................................52 圖 6-7 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................53 圖 6-8 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 2 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................54 圖 6-9 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................55 圖 6-10 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 12. V.

(8) 小時後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................56 圖 6-11 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................57 圖 6-12 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................58 圖 6-13 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 ...................................................................................................................59. VI.

(9) 表目錄表 3-1 吸引力對偏壓平方作圖分析其斜率數值。 ..............................32. VII.

(10) 摘要本論文利用磁性模組原子力顯微術(Magnetic Force Microscopy 簡稱 MFM)、導電模組原子力顯微術(Conductive Atomic Force Microscopy 簡稱 C-AFM)以及力曲線(Force Curve)分析法辨識鐵蛋白與缺鐵鐵蛋白的結構差異。結果顯示，在施予偏壓下，鐵蛋白與探針間的引力比缺鐵鐵蛋白高，顯示二者結構可能因鐵核存在而有所差異。對此，我們也以磁鐵微粒與其他蛋白質進行比較。此外，有鑒於蛋白質經氫氧化鈉處理後會逐漸變性，我們也以之對鐵蛋白與缺鐵蛋白進行分析，發現二者均會因氫氧化鈉處理致使其與探針間的引力逐漸下降，二者間差異逐漸趨於一致。. 原子力顯微術，力曲線分析法，鐵蛋白. i.

(11) Abstract In this thesis, we conducted research on the difference between the structure of ferritin and apoferritin using magnetic force microscopy (MFM), conductive atomic force microscopy (C-AFM) and force curve analysis. Experimental results showed that the attraction force between ferritin and probe is high than that between apoferritin and probe, suggesting that the magnetic iron core embedded in ferritin might play a key role. For this hypothesis, we analyzed magnetic Fe3O4 nanoparticles and other proteins for comparison. In view of the fact that denaturing often occur as proteins are treated with sodium hydroxide, we implemented experiments in this way to differentiate ferritin and apoferritin. According to the decreasing attraction force towards the probe revealed during the treatment with NaOH, both protein molecules denatured gradually, but the difference was fading gradually as well.. Atomic Force Microscopy, Force Curve, Ferritin. ii.

(12) 第一章緒論本實驗室過去曾以導電模組原子力顯微術(Conductive Atomic Force Microscopy 簡稱 C-AFM) [1] 對鐵蛋白(Ferritin，簡稱 FT) [2]與缺鐵鐵蛋白(Apoferritin，簡稱 apoFT)的影像與結構進行分析，也以磁性模組原子力顯微術(Magnetic force microscopy 簡稱 MFM) [3]證明鐵蛋白中的鐵核存在與否會對成像造成影響。在此，本論文利用力曲線分析法(Force Curve)加以驗證鐵蛋白與缺鐵鐵蛋白的結構差異。鐵蛋白是生物體內常見的一種儲鐵蛋白，如圖 1-1[4]所示，分子量約為 20 kD，由四片蛋白質所組成一中空結構，內部可容納約 4500 鐵離子，內徑約為 8 nm、外徑約為 12 nm，存於人體多種細胞中，以肝臟及網狀內皮細胞內的濃度最高。FT 的主要功能是將細胞中過多游離態的鐵質儲備起來以備所需，因此，鐵蛋白是生物組織中主要儲存鐵質的蛋白質，故為維持鐵質平衡[5]不可或缺的要素。一般而言，組織中的儲鐵蛋白會和血清中的儲鐵蛋白達成平衡，因此血清中的儲鐵蛋白為身體內儲鐵量的指標，對人體而言，一毫升血清中約含有 1 ng 的儲鐵蛋白[6]，所以血清中鐵蛋白的含量可以直接反映出生物體內的總儲存量，故可藉以診斷疾病。. 1.

(13) 圖 1-1 FT 的結構構型，其中心核的組成為[FeO(OH)]8[FeO(H2PO4)]。. 2.

(14) 自從 Binning 與 Rohrer 在 1980 年初發明掃描式穿隧顯微術 (Scanning Tunneling Microscopy, STM)後[7-8]，人類便可以直接觀測到表面原子影像，掃描式探針顯微鏡(Scanning Probe Microscopy, SPM) [9-10]. 的技術發展也從此突飛猛進，為人類開闢一扇新的視野。由於. STM 主要藉由測量穿隧電流成像，所以樣本須是導體。為了免除此一限制，Binnig、Quate 和 Gerber 於 1985 年發明原子力顯微鏡[11]，藉由探針針尖與樣本間作用力所引起的懸臂形變獲得樣本表面形貌。目前以 AFM 為基礎發展出來相關技術與功能日新月異，如圖 1-2 所示：. 圖 1-2 常見 SPM 之分類與功能。. 3.

(15) AFM 之能成像主要是探針掃描表面時，可因機械接觸力、凡得瓦爾力、毛細現象、靜電力，磁力而使探針產生偏移。若將探針尖端與待測物比喻為兩個原子，兩者間的作用力便會隨距離變化而變化，如圖 1-3 [12]所示。當原子與原子極為接近時，兩原子電子雲間的斥力將大於原子核與電子雲間的吸引力，原子間的淨力便為斥力，反之，若原子間的距離稍微疏遠時，電子雲間的作用力將逐漸小於原子核與電子雲間的吸引力，系統的淨力將成為引力。以能量觀點而言，這種原子間的能量與距離的函數可以 Lennard-Jones potential [13]公式說明之，即 Epair(r) = 4ε[(σ/r)12-(σ/r)6]. 式 1-1. 其中σ為原子半徑，r 為兩原子間距離，ε為介電常數。. 圖 1-3 兩原子間位能與相對距離的關係圖。 4.

(16) 根據操作模式，原子力顯微鏡多以接觸式(contact mode)、非接觸式(non-contact mode)與輕敲式(tapping mode)等三種模式進行影像分析。事實上，導電模組也是另一可行方式。若在樣本影像掃瞄時對探針或樣本施加電壓，則可依據導電度高低獲得樣本表面形貌。此上述方式之外，磁性模組原子力顯微術也可藉以進行影像分析。當磁性探針感受到樣本所具有的磁場時，二者間的引力或斥力可使懸臂振盪振幅產生變化，因此可藉由所衍生的相位差或頻率變化進行成像，如圖 1-4[14]所示。. 圖 1-4 磁性模組原子力顯微術掃描示意圖。. 5.

(17) 相對於前述成像法，AFM 顯微術下的力曲線分析法則可藉由接觸式模式，探討探針與樣本間的引力差異，其操作方式如圖 1-5[15]所示，其中掃描器僅做 z 軸上下運動。當探針與樣本距離接近至某一程度時，樣本上之水層薄膜會因毛細現象產生一吸引力，使懸臂下彎，所記錄到的懸臂偏移曲線呈下降狀。當探針與樣本接觸後，掃描器繼續下降，懸臂的斥力逐漸增大，此時懸臂偏移曲線呈上升狀。當掃描器開始上升時，懸臂的受力隨之下降。若掃描器繼續上升，至彈性恢復力大於吸附力，懸臂會彈離樣本表面，回復至原先狀態[16-17]。據此，便可藉以分析樣本與探針間的交互作用大小。本論文便是依據這些方法，對 FT 與 apoFT 進行結構差異分析。. 圖 1-5 力曲線圖(左)與探針與樣本位置關係圖。. 6.

(18) 第二章實驗 2.1 化學藥品藥品名稱. 廠牌. 1. Thionine chloride. TCI. 2. Ferritin. Sigma. 3. Apoferritin. Sigma. 4. Bovine serum albumin. Sigma. 5. Glucose oxidase. Sigma. 6. Deoxyribonucleic acid from salmon testes. Sigma. 7. Sodium nitrite. Showa. 8. Potassium chloride. Showa. 9. Potassium hexachloroplatinate. Showa. 10. Sodium hydroxide. Showa. 11. Ethyl acetate. Tedia. 12. Sulfuric acid. Echo. 13. 氮氣. 豐明氣體. 14. 環氧樹脂. Huntington. 15. 奈米磁粉 (四氧化三鐵). 頂尖奈米科技. 7.

(19) 16. 銀膠. Delta technologies. 17. 銅膠. 3M. 18. 高純水. Milli-Q. 8.

(20) 2.2 實驗設備儀器名稱. 廠牌規格. 1. 工作電極. ITO 導電玻璃(Delta Tech). 2. 參考電極. SCE. 3. 輔助電極. Pt 電極. 4. 恆電位儀. CHI400 或 CHI614A (CH instrument). 5. 超音波震盪器. Fisher scientific FS5. 6. 電子天平. Precisa 125A. 7. 微量吸量管. Nichiryo model 5000DG. 8. 原子力顯微鏡. Multimode AFM (NanoScope IIIA， Digital instruments and Veeco Metrology，Inc.，Santa Barbara，CA). 9. 非接觸式磁性掃描顯微鏡. Budgetsensors Multi75M-G. 探針 10. 非接觸式掃描顯微鏡探針 Budgetsensors TAP300Al 11. 接觸式掃描顯微鏡探針. Nanosensors PPP-XYCONTR. 9.

(21) 2.3 修飾電極的製備 A. ITO 電極製備： 1. 以鑽石刀將 ITO 導電玻璃切成約 0.5 × 1.0 cm2 的面積大小。 2. 以銀膠連接 ITO 導電玻璃與單芯線。待銀膠固化後再以環氧樹脂將銀膠與單芯線裸露處完全密封，並加溫(160 ℃)使環氧樹脂硬化。 3. 依序將電極置於 0.1 M H2SO4、0.1 M NH4OH、95% C2H5OH 與高純水中，以超音波震盪器震盪 5 分鐘。完畢後，烘乾備用。 B. 類核黃素修飾於 ITO 電極之製備： 1. 取 0.52 g Thionine chloride 和 0.17 g Sodium nitrite，將之溶於 0.1 M 的鹽酸水溶液中。 2. 以循環伏安法來修飾電極，電壓範圍由 0 V 至-0.6 V(相對於 SCE)，掃描 10 圈，掃瞄速度 0.02 V/s。 3. 完成修飾之後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃描至 CV 圖譜穩定不變。完畢後，置於室溫下以氮氣吹乾備用。. C. 蛋白質固定於類核黃素修飾電極之製備： 1. ITO|TC|FT 修飾電極：將步驟 B 所製得的電極浸泡於 53 mg/mL. 10.

(22) 的 Ferritin 溶液中一小時，之後，取出以高純水沖洗電極，接著在室溫下以氮氣吹乾。 2. ITO|TC|apoFT 修飾電極：將步驟 B 所製得的電極浸泡於 46 mg/mL 的 Apoferritin 溶液中一小時，之後，取出以高純水沖洗電極，接著在室溫下以氮氣吹乾。 3. ITO|TC|DNA 修飾電極：將步驟 B 所製得的電極浸泡於 3 mg/mL 的 Salmon tests DNA 溶液中一小時，之後，取出以高純水沖洗電極，接著在室溫下以氮氣吹乾。 4. ITO|TC|GOx 修飾電極：將步驟 B 所製得的電極浸泡於 30 mg/mL 的 Glucose oxidase 溶液中一小時，之後，取出以高純水沖洗電極，接著在室溫下以氮氣吹乾。 5. ITO|TC|BSA 修飾電極：將步驟 B 所製得的電極浸泡於 10 mg/mL 的 Bovine serum albumin 溶液中一小時，之後，取出以高純水沖洗電極，接著在室溫下以氮氣吹乾。. D. 奈米磁粉固定於 ITO 電極之製備： 1. 將 50 mg 的四氧化三鐵加入 10 mL 水中，以超音波震盪器震盪後，取出 20 μL，滴於 ITO 基材上，乾燥後備用。. 11.

(23) 2.4 原子力顯微鏡的操作步驟 A. Conductive mode (可得 C-AFM 影像，I-V curve 及 Force curve) 1. 依序打開機台、高倍率顯微鏡燈源、電腦、控制螢幕、顯示螢幕與 Nanoscope controller。 2. 將樣本以銅膠固定於鐵片上，並將 ITO 與鐵片之間用銀膠導通，之後放置於機台上。將導電探針夾在探針座上旋緊。 3. 調整旋鈕，使雷射的 SUM 值達到最大值。 4. 將導電探針座以軟細線接上訊號放大器。 5. 選擇機台上的 TM AFM 模式，調整 VERT 數值約-1.0 左右(否則無法下針)。再將模式開到 AFM＆LFM 模式，調整 HORZ 數值約±0 左右，來回檢查數次，確保數值的正確性，也必須使 SUM 逼近最大值。之後，再將機台上的模式調回 AFM＆LFM 模式。 6. 將控制螢幕中 Other controls 的 Microscope mode 調為 C-AFM。 7. 在進行電腦微調下針前，先進行手動下針。機台上有 Up (上針) 和 Down (下針)，透過高倍率顯微鏡和顯示螢幕讓探針先大幅度的接近表面之後，再至控制螢幕點選下針圖示，螢幕上會出現 Approaching surface 警告，待儀器發出“逼”一聲，即表示下針完成，圖像開始於顯示螢幕進行。. 12.

(24) 8. 將 Channel 2 中 Data type 改為 CFM-current 即可收取 C-AFM 的影像。 9. 點取顯示螢幕上的 Offset 選取所欲量測 I-V curve 之位置。 Execute 變更位置後再點選. ，將 Ramp channel 改為 DC. sample bias，可控制 Ramp begin 及 Ramp end 改變施加電壓範圍、Scan rate 控制掃描速率。 10. 將 Ramp channel 改為 Z，調整 Ramp size、Z scan start 及 Data scale 以得到最佳 force curve。 11. 點選顯示螢幕的相機圖示，顯示螢幕下方的 Capture 顯示為 On 開始儲存影像，顯示為 Done 完成存取。. B. Tapping mode – Lift mode (可得 Morphology、Phase shift、Amplitude 影像) 1. 依序打開機台、高倍率顯微鏡燈源、電腦、控制螢幕、顯示螢幕與 Nanoscope controller。 2. 將樣本以銅膠固定於鐵片上，並將 ITO 與鐵片之間用銀膠導通，之後放置於機台上。將導電探針夾在探針座上旋緊。 3. 調整旋鈕，使雷射的 SUM 值達到最大值。 4. 選擇機台上的 TM AFM 模式，調整 VERT 數值約±0 左右。再. 13.

(25) 將模式開到 AFM＆LFM 模式，調整 HORZ 數值約±0 左右，來回檢查數次，確保數值的正確性，也必須使 SUM 逼近最大值。之後，再將機台上的模式調回 AFM＆LFM 模式。 5. 將控制螢幕中 Other controls 的 Microscope mode 調為 tapping。 6. 點選. 進行調頻，將探針的頻率設定於 Start frequency 和 End. frequency 之間即可，並點選自動調頻 (Autotune)。 7. 在進行電腦微調下針前，先進行手動下針。機台上有 Up (上針) 和 Down (下針)，透過高倍率顯微鏡和顯示螢幕讓探針先大幅度的接近表面之後，再至控制螢幕點選下針圖示，螢幕上會出現 Approaching surface 警告，待儀器發出“逼”一聲，即表示下針完成，圖像開始於顯示螢幕進行。 8. 將 Interleave controls 中的 Lift 點開並設定好 Lift start height 和 Lift scan height。調整 Channel 2 中的 Scan line 為 Interleave。 9. 點選顯示螢幕的相機圖示，顯示螢幕下方的 Capture 顯示為 On 開始儲存影像，顯示為 Done 完成存取。. 14.

(26) 第三章實驗結果與討論 3.1 鐵蛋白之力曲線(Force curve)分析鐵蛋白(FT)是生物體內常見的一種儲鐵蛋白，是生物體藉以調節鐵離子的重要蛋白質。有鑒於 FT 的生化特性與結構，本實驗擬以場效應 AFM 以及 Force Curve 分析法辨識其與缺鐵鐵蛋白 (apoFT)的結構差異。進行 Force Curve 分析前，我們先將 FT 吸附於 ITO 導電玻璃上。為避免在測量時 FT 受到探針的擠壓而偏離原有位置，我們先以 thionine chloride (簡稱 TC)作為蛋白質分子膠(molecular adhesive)，將之修飾於 ITO 表面（簡稱 ITO|TC)後，再將 ITO|TC 浸置於 FT 或 apoFT 溶液中，藉以吸附蛋白質。對於吸附有 FT 與 apoFT 的 ITO|TC 試片(簡稱 ITO|TC|FT 與 ITO|TC|apoFT)，我們先以 C-AFM 進行影像分析以確定其位置，結果如圖 3-1 所示，其中深藍色與綠色的點即為蛋白質。俟位置確定後，我們再對這些微粒量測 I-V curve，代表性結果如圖 3-2 所示。. 15.

(27) (a). (b). (c). (d). 圖 3-1 (a)空白 ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT 與(d) ITO|TC|apoFT 之 C-AFM 影像圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 16.

(28) Current (pA). 400. (a). (b). 200. (c). 0. (d). -200 -400 1.0. 0.5. 0.0 Bias (V). -0.5. -1.0. 圖 3-2 以 Pt-coated AFM 導電探針對(a) ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT 與(d) ITO|TC|apoFT 所測得之 I-V 曲線，掃瞄速度：0.67 Hz。. 17.

(29) 實驗結果顯示 ITO 的導電度最佳，ITO|TC 次之，被吸附蛋白質最差，與預期頗為符合。確定蛋白質位置後，我們對其進行 Force Curve 分析，並與空白 ITO 所得的結果進行比較，代表性結果如圖 3-3 所示。Force Curve 是藉由探針懸臂的彎曲量以探討物質引力的有效工具，如圖(a)中所示的橫軸即為探針與樣本間的距離，而縱軸為懸臂的彎曲量。圖中所示的 A 點代表探針與樣本沒有接觸時的狀態，此時懸臂並無彎曲。當懸臂開始下壓，探針會逐漸接近樣本表面。當探針幾乎接觸樣本時，即到達 B 點時，二者間的引力增強，強度足夠讓懸臂向樣本彎曲。當探針繼續下壓至 C 點時，二者直接接觸，斥力開始出現，導致懸臂向上彎曲。當探針下壓至 D 點後開始上提，即到達 E 點，則懸臂逐漸伸展，路徑顯現出類似於壓縮時的路徑，但因壓電材料遲滯現象，二者稍有差異。若繼續上提到 E 與 F 間，因探針與樣本間的吸力仍大於斥力，故懸臂仍往下彎曲，但當懸臂彎曲所累積脫離樣本的力足夠掙脫二者間的引力時，即在 F 點，則探針與樣本會瞬間分開，致使懸臂恢復為原有狀態。藉由 A 與 F 間的懸臂彎曲量以及懸臂的彈性常數，便可估計探針與樣本間的吸引力[18]。. 18.

(30) (a) D. E A C B F. (b). 19.

(31) (c). (d). 圖 3-3 以 Pt-coated AFM 導電探針對(a) ITO；(b) ITO|TC；(c) ITO|TC|FT；(d) ITO|apoFT 所測得之 force 曲線，掃瞄速度：0.68 Hz。. 20.

(32) 根據文獻報導[19-20]，FT 所包覆的鐵核具有弱磁性，因此我們在測量 Force Curve 時也對 FT 與 apoFT 施加電壓，以觀察二者與探針間的吸引力是否有所差異，所得結果如圖 3-4 所示。我們發現 FT 與探針間的引力確實會隨偏壓的絕對值增加而增加。我們也對 ITO|TC 與 ITO|TC|apoFT 進行類似實驗，其結果如圖 3-5 所示。雖然三者的引力均隨偏壓增加而增加，但相較而言，鐵蛋白對偏壓的敏感度較高，推測應與鐵蛋白內部所含鐵核有關。測量時，我們也發現施以負偏壓，如-3 V，其吸引力多下降而非上升，我們推測這可能是過負偏壓會將 ITO 導電玻璃中的氧化錫還原所致。為了避免這種情形發生，我們多將偏壓控制在> -2.5 V 區。. 21.

(33) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 3-4 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 22.

(34) (a) (b) (c). 60. Force (nN). 50. 40. 30. 20. 10 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-5 (a) ITO|TC、(b) ITO|TC|FT 與(c) ITO|TC|apoFT 之吸引力與施加偏壓間的關係。. 23.

(35) 3.2 其他蛋白質的 Force Curve 分析對於 FT 與 apoFT 的差異，我們也以不含鐵核的其他蛋白質，如鮭魚卵蛋白(Deoxyribonucleic acid from salmon tests 簡稱 DNA)、葡萄糖氧化脢(Glucose oxidase 簡稱 GOx)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin 簡稱 BSA)，進行比較，結果如圖 3-6、3-7 與 3-8 所示。我們也以具磁性的四氧化三鐵(Fe3O4)進行比較，所得結果如圖 3-9 所示。因外加電壓所引起的磁力與電壓值的平方成正比[21]，即式 3-1 故我們也以其與偏壓平方值進行比較 (圖 3-10~3-15)，並分析其斜率，並將數值列於表 3-1 中以資比較。結果顯示四氧化三鐵對偏壓變化最為靈敏，FT 次之，而不含磁性的 apoFT 與其他蛋白質又次之。據此，我們推論 FT 之比 apoFT 靈敏主要是因其結構內含有鐵核所致。. 24.

(36) 62 60 58. Force (nN). 56 54 52 50 48 46 44 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-6 ITO|TC|DNA 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 25.

(37) 58 56 54. Force (nN). 52 50 48 46 44 42 40 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-7 ITO|TC|GOx 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 26.

(38) 52. Force (nN). 48. 44. 40. 36. 32. 28 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-8 ITO|TC|BSA 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 27.

(39) 65. Force (nN). 60. 55. 50. 45. 40. 35 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-9 ITO|Fe3O4 之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 28.

(40) 60. Force (nN). 55. 50. 45. 40. 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-10 ITO|TC|FT 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 20. Force (nN). 18. 16. 14. 12. 10 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-11 ITO|TC|apoFT 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 29.

(41) 56. Force (nN). 54. 52. 50. 48. 46 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-12 ITO|TC|DNA 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 54. Force (nN). 52. 50. 48. 46. 44. 42 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-13 ITO|TC|GOx 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 30.

(42) 54 52. Force (nN). 50 48 46 44 42 40 38 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-14 ITO|TC|BSA 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 70. Force (nN). 65. 60. 55. 50. 45. 40. 35 0. 2. 4. 6. 8. 10. 2. bias (V ) 圖 3-15 ITO|TC|Fe3O4 與探針間的引力與施加偏壓平方值之關係。. 31.

(43) 表 3-1 吸引力對偏壓平方作圖分析其斜率數值。 ____________________________________________________ 樣本 ______________________________________ FT apoFT DNA GOx BSA Fe3O4 ____________________________________________________ 斜率平均值. 1.78. 0.25. 0.61. 0.39. -0.01. 2.11. ____________________________________________________. 32.

(44) 3.3 蛋白質變性結構分析根據文獻報導[22-23]，蛋白質若與強酸或強鹼作用會因而變性，不僅其特定三度空間結構會改變，其生化活性也會隨之改變或喪失。有鑒於此，我們也以 C-AFM 與 Force Curve 分析法分析經氫氧化鈉處理後的蛋白質其結構變化差異。實驗時，我們先對 FT (圖 3-16~3-19)與 apoFT (圖 3-20~3-22)進行探討。根據 I-V Curve 分析，當施加電壓值為 0 的偏壓時，C-AFM 影像最為清晰，故可藉以確定蛋白質位置。實驗顯示若將 FT 浸泡於 1 M NaOH 不等時距，則所得的吸引力會逐漸下降，其代表性結果如圖 3-16~3-19 所示，顯示蛋白質經氫氧化鈉處理後會逐漸變性，致使其後結構改變，最終“攤平”在試片上。我們也對 apoFT 進行類似實驗，所得結果如圖 3-20~3-22 所示。. 33.

(45) 21. 20. Force (nN). 19. 18. 17. 16. 15. 14 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-16 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 34.

(46) 22. Force (nN). 20. 18. 16. 14. 12. 10 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-17 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 2 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 35.

(47) Force (nN). 18. 15. 12. 9. 6 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-18 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 36.

(48) Force (nN). 9. 8. 7. 6. 5. 4 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-19 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 37.

(49) 19. Force (nN). 18. 17. 16. 15. 14. 13 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-20 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後之 C-AFM 影像圖(上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 38.

(50) 15. Force (nN). 14. 13. 12. 11. 10 -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-21 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後之 C-AFM 影像圖 (上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 39.

(51) 18. Force (nN). 16. 14. 12. 10. -3. -2. -1. 0. 1. 2. 3. bias (V) 圖 3-22 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後之 C-AFM 影像圖 (上) 與其吸引力與施加偏壓間的關係圖。掃瞄速度：0.75 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，施加偏壓(探針接地)：0.5 V。. 40.

(52) 我們若以 FT 與 apoFT 所量得的引力對浸置 NaOH 的時間作圖，其結果如圖 3-23 所示，顯示二者都會隨時間增長而下降，並趨近 ITO|TC 的數值。 FT apoFT. 45 40. Force (nN). 35 30 25 20 15 10 5 -5. 0. 5. 10. 15. 715. 720. 725. 730. 735. Time (min) 圖 3-23 FT 與 apoFT 所量得的引力對浸置 NaOH 的的時間的關係圖。. 41.

(53) 3.4 磁效應原子力顯微鏡影像分析雖然 C-AFM 難以分辨 FT 與 apoFT 間的差異，FT 因具有弱磁性，所以我們以 MFM 對 FT 與 apoFT 進行影像分析，並與具有磁性的四氧化三鐵進行比較，其結果如圖 3-24 所示。我們發現：具有磁性的四氧化三鐵影像最清晰，FT 次之，apoFT 與 TC 再次之，空白 ITO 則幾乎沒有影像。在施加偏壓使樣本受到電場的影響下，可以發現空白 ITO 依然沒有影像，而 apoFT 與 TC 雖然有影像卻不及 FT。. 42.

(54) (a). (b). (c). (d). (e). 圖 3-24 (a)空白 ITO、(b) ITO|TC、(c) ITO|TC|FT、(d) ITO|TC|apoFT 與(e) ITO|Fe3O4 之未施加偏壓(左)與施加偏壓(樣本接地)：2 V 的 MFM 影像圖。掃瞄速度：1 Hz，掃描範圍 500 nm × 500 nm，lift height：6 nm。. 43.

(55) 第四章結論 1. 根據 MFM 與 Force Curve 分析以及施予偏壓下，我們發現鐵蛋白與探針間的引力比缺鐵鐵蛋白高。 2. 我們也發現鐵蛋白與缺鐵鐵蛋白均會因氫氧化鈉處理而逐漸變性，致使其與探針間的引力逐漸下降。 3. 根據磁性模組原子力影像分析，鐵蛋白的影像比缺鐵鐵蛋白清晰，顯示鐵核具有微弱磁性。. 44.

(56) 第五章參考文獻 [1] T. M. Kelley and C. D. Frisbie, J. Vac. Sci. Technol. 2000, B 18, 632. [2] M. J. Donlin, R. F. Frey, C. Putnam, J. K. Proctor, J. K. Bashkin, J. Chem. Educ. 1998, 75, 437. [3] D. Rugar, H. J. Mamin, P. Guethner, S. E. Lambert, J. E. Stern, I. McFadyen, T. Yogi, J. Appl. Phys. 1990, 68, 1169. [4] Insight II graphical program; Molecular Simulations, Inc. [5] B. S. Skikne, P. Whittaker, A. Cooke, J. D. Cook, Br. J. Haematol. 1995, 90, 681. [6] S. S. Gropper, J. L. Smith, J. L. Groff, Advanced Nutrition and Human Metabolism 5th Edition [7] G. Binnig, H. Rohrer, C. Gerber, E. Weibel, Phys. Rev. Lett. 1982, 49, 57. [8] G. Binnig, H. Rohrer, Rev. Mod. Phys. 1999, 71, S324. [9] R. J. Colton, D. R. Baselt, Y. F. Dufrêne, J.-B. D. Green, G. U. Lee, Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 370. [10] L. A. Bottomley, Anal. Chem. 1998, 70, 425. [11] G. Binnig, C. F. Quate, C. Gerber, Phys. Rev. Lett. 1986, 56, 930. [12] J. Y. Kim, H. K. Lee, S. C. Kim, J. Membr. Sci. 1999, 163, 159.. 45.

(57) [13] N. Yu, A. A. Polycarpou, J. Colloid Interface Sci. 2004, 278, 428. [14] 楊志文，原子力顯微術原理及其應用，原力精密儀器公司技術顧問。 [15] V. Shahin, Y. Ludwig, C. Schafer, D. Nikova, H. Oberleithner, J. Cell Sci. 2005, 118, 2881. [16] B. Cappella, G. Dietler, Surface Science Reports 1999, 34, 1. [17] 楊鏡堂，童凱煬，AFM 原子力顯微鏡，國立清華大學動力機械工程學系。 [18] B. Cappella, P. Baschieri, C. Frediani, P. Miccoli, C. Ascoli, IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 1997, 16, 58. [19] J. W. M. Bulte, R. A. Brooks, Scientific and clinical applications of magnetic carriers, Plenum, New York, 1997. [20] M. Miglierinia, A. Lancokb, Acta Physica Polonica A. 2010, 118,. 944.. [21] R. D. Gomez, A. O. Pak, A. J. Anderson, E. R. Burke, A. J. Leyendecker, I. D. Mayergoyz, J. Appl. Phys. 1998, 83, 6226. [22] M. A. Baraibar, A. G. Barbeito, B. B. Muhoberac, R. Vidal, J. Biol. Chem. 2008 , 283, 31679. [23] R. R. Crichton, C. F. A. Bryce, Biochem. J. 1973, 133, 289.. 46.

(58) 第六章附錄 (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-1 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 47.

(59) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-2 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 48.

(60) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-3 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|DNA 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 49.

(61) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-4 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|GOx 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 50.

(62) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-5 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|BSA 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V； (f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 51.

(63) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-6 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|Fe3O4 所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 52.

(64) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-7 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 53.



(67) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-10 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|FT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。 56.

(68) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-11 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 1 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V； (c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 57.

(69) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-12 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 10 分鐘後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 58.

(70) (a). (b). (c). (d). (e). (f). (g). 圖 6-13 以 Pt-coated AFM 導電探針對 ITO|TC|apoFT 浸泡於 1 M NaOH 12 小時後所測得之 force 曲線，施加偏壓(探針接地)為(a) 3 V；(b) 2 V；(c) 1 V；(d) 0 V；(e) -1 V；(f) -2 V；(g) -2.5 V。掃瞄速度：0.68 Hz。. 59.

(71)