添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠脾臟細胞激素
添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠脾臟細胞激素mRNA mRNA表現之影響 表現之影響 Effects of glutamine supplementation on
Effects of glutamine supplementation on splenocyte splenocyte cytokine mRNA expression cytokine mRNA expression in rats with septic peritonitis
in rats with septic peritonitis
賴育妮賴育妮** 邱琬淳
邱琬淳商惠芳商惠芳葉松鈴葉松鈴# #
陳維昭陳維昭 台北醫學大學保健營養研究所台北醫學大學保健營養研究所微生物免疫學科微生物免疫學科台灣大學醫學院外科台灣大學醫學院外科
0 10 20 30 40 50 60
CD45Ra+ CD3+ CD4+ CD8+
%
control -- -+
+- ++
a
b
ab b
b
b b
a ab b a
b b b
b b
a
ab ab
ab
Gln- Gln - supplemented supplemented
without without Gln Gln Casein
Casein 165 165 220 220
Corn starch
Corn starch 667 667 657 657
Soybean oil
Soybean oil 44 44 44 44
Gln Gln 45 45 -- --
Total nitrogen
Total nitrogen 35.2 35.2 35.2 35.2
Vitamin
Vitamin a a 10 10 10 10
Salt mixture
Salt mixture b b 35 35 35 35
Methyl
Methyl- -cellulose cellulose 30 30 30 30 Choline
Choline chloride chloride 1 1 1 1
DL DL- -Methionine Methionine 3 3 3 3
Total calorie
Total calorie 3904kcal 3904kcal 3904kcal 3904kcal
+
+Gln Gln -- --
Glucose Glucose soln soln (50%) (50%) 20% Fat emulsion 20% Fat emulsion Moriamin Moriamin- -SN (10%) * SN (10%) * Gln Gln (g) (g)
Infuvita Infuvita **No1 **No1 Infuvita Infuvita **No2 **No2 NaCl NaCl 3% 3%
KCl KCl 7% 7%
K K 3 3 PO PO 4 4 8.7% 8.7%
Ca Ca- -gluconate gluconate MgSO MgSO 4 4 Zn SO Zn SO 4 4
Choline Choline chloride(g) chloride(g)
418 418 50 50 417 417 11 11
7 7 1 1 35 35 10 10 10 10 10 10 4 4 2 2 1 1
412 412 50 50 556 556 -- -- 7 7 1 1 35 35 10 10 10 10 10 10 4 4 2 2 1 1
Table 2. Composition of TPN solution (mL/L)
Table 1. Composition of semipurified diet ( g/kg )
IL IL- -2 2 IL IL- -4 4 IL IL- -10 10 IFN IFN- -γ γ TNF- TNF -α α (ratio of 15S
(ratio of 15S rRNA rRNA) ) Control
Control 1.9 1.9± ±0.11 0.11 a a 1.87± 1.87 ±0.16 0.16 a a 1.79 1.79± ±0.11 0.11 a a 1.99± 1.99 ±0.26 0.26 a a 1.65± 1.65 ±0.05 0.05 a a
－－
－－ 2.06 2.06± ±0.21 0.21 ac ac 2.13 2.13± ±0.30 0.30 ac ac 1.90 1.90± ±0.23 0.23 a a 2.21± 2.21 ±0.26 0.26 a a 1.79± 1.79 ±0.24 0.24 a a
－＋
－＋ 2.45± 2.45 ±0.16 0.16 b b 2.49± 2.49 ±0.16 0.16 b b 2.21 2.21± ±0.19 0.19 b b 2.68 2.68± ±0.21 0.21 b b 2.31 2.31± ±0.41 0.41 b b
＋－
＋－ 2.26± 2.26 ±0.26 0.26 bc bc 2.35± 2.35 ±0.22 0.22 bc bc 1.97± 1.97 ±0.21 0.21 ac ac 2.57 2.57± ±0.34 0.34 b b 1.99± 1.99 ±0.21 0.21 ab ab
＋＋
＋＋ 2.42± 2.42 ±0.23 0.23 b b 2.37± 2.37 ±0.29 0.29 b b 2.12 2.12± ±0.17 0.17 bc bc 2.52 2.52± ±0.33 0.33 b b 2.19 2.19± ±0.34 0.34 b b 0
10 20 30 40 50 60
1
NO 3 - /N O 2 - (u M )
control - - - + + - + + a
ab ab
ab b
Figure 1. The distribution of CD45Ra+, CD3+, CD4+ and CD8+ lymphocytes in the spleen in the five groups 3 days after CLP.
Different letters indicate significant difference among groups (p < 0.05)
Figure 2. Nitric oxide (NO) concentrations in PLF of the five groups 3 days after CLP. Different letters indicate significant difference among groups (p < 0.05)
Figure 3. The mRNA expression of cytokines in the spleen of the five groups 3 days after CLP
Values are expressed as means ± SD. Groups without sharing common letters in the same column indicate significant difference at p < 0.05
前言
敗血症（sepsis）是一種在臨床上十分常見且死亡率極高的併發症，
當細菌及其內毒素侵入人體後，會造成體內的代謝失衡以及組織之分解，
最後導致多重器官之衰竭。已有研究顯示，代謝失衡主要是由於敗血症引 致免疫系統及器官細胞中細胞激素分泌不正常所致，許多研究均以細胞激 素之分泌量作為發炎或受傷嚴重程度之指標。然而由於細胞激素半衰期很 短，分泌的高峰期各有不同，在體液內的濃度極低，故有些細胞激素並無 法偵測到。於是敏感性及準確度皆高之RT-PCR (reverse-transcription polymerase chain reaction)技術被廣泛的運用在偵測細胞激素mRNA的
全靜脈營養（total parenteral nutrition,，TPN）是一種非經腸道的營 養支持方式，常用於腸道功能障礙之病人，由於TPN之使用會造成腸黏膜 細胞及組織內gut associated lymphoid tissue (GALT)發生萎縮，而使得 腸黏膜通透性增加，增加細菌轉移的比例而引發感染，並併發敗血症。因 此如何增進病人免疫功能，降低感染是重要的研究方向，近年來免疫營養 (immunonutrition)遂成為研究之重點，而glutamine (Gln)之添加受到相 當之重視。Gln為人體中含量最多的游離胺基酸，同時也是腸黏膜及免疫細 胞之重要能量來源。已有研究顯示Gln添加於TPN配方中，有助於維持腸道 構造和功能之完整性、增加氮保留量並防止細菌轉移。另外，於TPN溶液 中添加Gln可維持Th2細胞所分泌的細胞激素－IL-4、IL-10 mRNA的表現 量並維持小腸IgA的分泌，增進黏膜免疫的功能。本實驗室前之研究顯示，
於敗血症前給予飲食中補充Gln，可增進腹腔巨噬細胞之吞噬能力；而無論 是在敗血症前或後給予Gln之補充皆可增加GALT內淋巴細胞之增生，並促 進IgA之分泌。為了更進一步探討Gln之補充對敗血症所引起之免疫反應，
到底是偏向細胞性或是體液性免疫反應，故本實驗以盲腸結紮並穿刺手術 (cecal ligation and puncture, CLP) 引致老鼠敗血症，進而觀察Gln對敗 血症老鼠脾臟淋巴細胞分佈及Th1或Th2所分泌之細胞激素mRNA表現
目的
CLP為最接近人體因腹膜炎引致敗血症之良好動物模式，故本實驗以 此方式引致敗血症，並在敗血症前以由口進食，敗血症後以TPN輸入方式 給與Gln，來研究Gln對敗血症的影響。由於敗血症之發生並無法預知，因 此本實驗在敗血症發生之前後給或不給Gln來模擬有敗血症危險之重症病 人，探討是否可在住院後即給予Gln，來預防敗血症或減輕敗血症之嚴重 表現量，以預測細胞激素之分泌量。
之影響。
程度，或敗血症發生後以靜脈輸入也可達到同樣之效果。
材料與方法
實驗以Wistar雄性老鼠為對象，共分為五組，一組為normal control 組，不做CLP但做頸靜脈插管手術，手術前給予一般飼料配方，術後給予 傳統之TPN輸液。其餘四組均施行CLP及頸靜脈插管手術，分別為：CLP 前給一般飼料配方，術後給傳統之TPN輸液（－－）； CLP前給一般飲 食，CLP後給富含Gln之TPN輸液（－＋）； CLP前給富含Gln之飲食，手 術後給傳統之TPN輸液（＋－）； CLP前後均給富含Gln之配方（＋
＋）。五組之營養素組成、總熱量以及總氮量均相等，富含Gln之配方以 Gln取代總氮量之25%。在引致敗血症三天後犧牲老鼠，取腹水及脾臟供
分析項目
腹水中NO的測定：ELISA kit
脾臟細胞中T細胞、B細胞之分佈: Flow cytometry
細胞激素包括Th1: interferon (IFN)-
γ , interleukin (IL)-2 ； Th2: IL-4, IL- 10,及tumor necrosis factor (TNF)-α mRNA表現量之測定: RT-PCR
分析之用。結論
1. 研究結果顯示敗血症會造成脾臟T細胞分布之減少，但無論是在敗血 症前或後給予Gln的補充皆可以維持脾臟T細胞之分佈。
2. 在敗血症前後皆補充Gln其腹水中NO之濃度較control組高，脾臟細 胞內TNF-α mRNA表現量亦較高，可能TNF-α 之表現促進敗血症後巨 噬細胞之活性，因而釋出較多之 NO 增進巨噬細胞之吞噬能力，此
3. 在敗血症後給予Gln的補充會增加脾臟細胞內Th1及Th2細胞激素 mRNA 表現量，雖然Th1與Th2細胞兩者所分泌之細胞激素具拮抗作 用，但細胞激素之分泌還要經過一連串post-transcription修飾，並 經translation之後才能合成蛋白質，是否細胞激素之分泌會在此期間 結果與本實驗室前之研究結果有一致性。
受到一些因子之調控則需更進一步之研究 。
