飛秒雷射膠原蛋白加工之動態現象

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成大研發快訊 - 文摘

成大研發快訊第七卷第二期 - 2008年十二月二十六日

[ http://research.ncku.edu.tw/re/articles/c/20081226/2.html ]

飛秒雷射膠原蛋白加工之動態現象

陳顯禎

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、董成淵

²

1國立成功大學工學院工程科學系

2國立台灣大學物理學系

sheanjen@mail.ncku.edu.tw

整理摘錄自發表之V. Hovhannisyan, W. Lo, C. Hu, S.-J. Chen, and C. Y. Dong, “Dynamics of femtosecond laser photo-modification of collagen fibers,” Optics Express, vol. 16, no. 11, pp. 7958-7968, May 2008.

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線性光學顯微術(nonlinear optical microscopy，NLOM) 自1990年發展以來，生物醫學領域中的顯微造影及操控就進入一個新時代。不同於傳統的單光子技術，NLOM利用飛秒脈衝雷射光(femtosecond pulse laser)對螢光分子的非線性激發，或者獲得極化效應的倍頻光訊號進行生物樣品造影。此方法擁有下列許多顯著的優點：

1. 在生物材料中的聚焦點才有足夠的光通量引發非線性效應，其優點是造影時不需要共軛焦顯微術的孔洞，就可以達到光切片(optical biopsy)的效果；

2. 光破壞的範圍侷限在焦點體積內，大幅降低了對樣品整體的破壞程度，也擁有較長的樣品觀察時間；

3. NLOM使用的近紅外光在生物組織中被吸收和散射的程度比可見光或紫外光小，因此可以達到較深的探測深度；

4. 光源本身波長和多光子所激發(multiphoton excited，MPE)的螢光波長相差夠遠，激發生物樣品中不同的螢光分子，可以獲得較完整的光譜資訊。

上述優點使得NLOM普遍應用於生醫分子影像(molecular imaging)相關的領域。

除了顯微造影之外，飛秒脈衝雷射光和組織之間的交互作用也可達到三維的光修飾作用。飛秒雷射光可應用於無機材料如矽和玻璃的顯微加工上。生物組織方面，則可運用於基因轉殖、三維組織工程骨架和神經再生等等的研究。

NLOM藉由樣品中所產生的非線性光學效應，進行造影及操控。在雙光子激發(two-photon excited，TPE) 的過程中，一個螢光分子吸收兩個近紅外光波段的光子，從基態躍遷到激發態。藉由量子力學計算結果可知：雙光子螢光的躍遷機率和激發光強度的平方成正比。相較於TPE螢光訊號，倍頻訊號是利用非線性的極化現象進行樣品造影。一般而言，材料的極化可表示為外加電場的次方展開式：

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其中第二項與二倍頻(second harmonic generator，SHG)效應的產生有極大的關係，SHG過程中將兩個光子轉換成一波長減半(頻率為兩倍)的光子。非中心對稱的生物材料，例如膠原蛋白和肌肉纖維能產生很強的二倍頻。因為TPE螢光和SHG兩種訊號在光譜上可以區分，結合這兩種模式可得到高對比的影

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像。在這方面的研究，也成功地應用於細胞和細胞外基質的造影。

NLOM除了在生物醫學影像上被廣泛應用外，可結合飛秒雷射輔助顯微操控術(femtosecond laser assisted microprocessing，FLAM)，對生物系統做前所未有的顯微操控並且造影。例如，我們可以使用這項技術，來設計製作或雕刻合適的三維骨架材料，來使組織工程的過程達到最佳化，再結合多光子或倍頻造影術，來操控和觀察所培養出來的組織結構，這樣的技術在生物醫學領域裡有許多前瞻性的應用。本研究已將飛秒雷射輔助顯微操作技術使用於顯微處理膠原蛋白纖維，其中膠原蛋白纖維在生物組織中是極為重要的結構性成份。

1. 飛秒雷射輔助顯微手術：我們發現，在膠原蛋白纖維上，重覆的將聚焦的飛秒雷射光束來回掃描，

可以將膠原蛋白纖維束切斷，在斷面的邊緣，我們發現到自發螢光有增加的現象(圖一套用綠色的部分)。我們發現延長飛秒雷射在膠原蛋白纖維停留的時間，會有降低二倍頻訊號及增加自發光螢光強度的趨勢(圖二)。

2. 顯微加工處理：選定的式樣外，飛秒雷射輔助顯微操作技術也可應用於顯微蝕刻的應用。在圖三中，我們可以看到利用飛秒雷射光束所在牛角膜上所蝕刻出的字母「V」及「I」。

圖一飛秒雷射輔助顯微操作技術作用於大鼠尾腱。圖左為作用前的大鼠尾腱影像，而圖右是將聚焦的飛秒雷射沿著藍色線切割後的影像，圖中所套用紅色為二倍頻訊號，綠色為自發螢光。

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圖二大鼠尾腱上的光破壞。在我們定量分析圖中兩個區域的二倍頻及螢光訊號後，發現：隨著雷射停留在膠原蛋白纖維上時間的增加，二倍頻訊號的強度會隨之衰減，而自發螢光的強度會隨之漸增。

圖三利用飛秒雷射輔助顯微操作技術在牛角膜上刻出字母，圖A、C裡刻了字母「V」，圖B中裡刻了字母

「I」。

根據上述之實驗結果可作出下列結論：利用飛秒鈦藍寶石雷射對膠原蛋白纖維以光學加工的效果評估中可發現，此種效應可再重複掃描第一類膠原蛋白(鼠尾和牛筋)和牛眼角膜所完成。在這過程中，我們發現不可逆雙光子自發螢光的增加和二倍頻訊號的減少，並利用共焦光譜影像驗證了新螢光物質的產生。在膠原蛋白和牛眼角膜樣品中，我們所使用的方法可達成可控制與解析度約為2微米的光學加工。

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