行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
腸病毒 71 型中樞神經感染致病機轉研究--(總計畫與子計
畫一)腸病毒 71 型神經侵入性分子機轉(2/3)
期中進度報告(完整版)
計 畫 類 別 ： 整合型 計 畫 編 號 ： NSC 98-3112-B-006-005- 執 行 期 間 ： 98 年 05 月 01 日至 99 年 04 月 30 日 執 行 單 位 ： 國立成功大學微生物學科（所） 計 畫 主 持 人 ： 余俊強 報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 99 年 01 月 30 日
目
錄
一、 計畫摘要
1a. 中文摘要
(一頁為限)---
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1b. 英文摘要
(一頁為限)---
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二、 背景介紹
(至多不超過三頁)2a. 研究目的 ---
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2b. 文獻探討 ---
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2c. 研究方法 ---
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三、 研究成果
(至少二頁)3a. 具體研究成果 ---
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3b. 分析與討論 ---
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3c. 所遭遇之困難與因應對策 ---
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四、 未來研究構想 ---
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五、 成果自評
(整合型計畫之總計畫主持人需另針對整體計畫評估)5a. 研究成果與原設定目標之相符程度 ---
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5b. 達成預期目標情形 ---
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5c. 研究成果之學術或應用價值 ---
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5d. 學術期刊發表情形 ---
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六、 參考文獻 ---
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七、 附件
7a. 學術論文 ---
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7b. 可供推廣之研發成果資料表 ---
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一、計畫摘要
1a. 中文摘要 自 1998 年大爆發後，腸病毒 71 型已經成為台灣最被重視的傳染病之一。雖然我 們過去的努力已對腸病毒 71 型的致病機轉有一定的了解，然而對決定病毒毒力的宿主及 病毒基因因子仍有許多未解決課題。我們針對腸病毒 71 型研究的長期目標是要找尋決定 疾病感受性的宿主因子以及控制病毒的毒性基因。在這段補助期間中，我們使用小鼠適 應株 EV71/MP4 顱內感染 7 日齡 ICR 小鼠，在中樞神經可發現無菌性腦膜炎和腦幹腦炎， 並伴隨血清中與神經性肺水腫 (neurogenic pulmonary edema；NPE)相關之細胞素包括 IL-6、IL-10、IL-13 和 IFN-濃度暫時性升高；同時 EV71 感染小鼠出現後肢癱瘓以及肺 功能異常，組織病理學檢查也發現 EV71 感染小鼠死亡前二天發生肺氣腫，但卻沒發生肺 水腫。因此，我們假設 EV71 感染中樞神經，伴隨血清中足夠濃度的 IL-6、IL-13 和 IFN- 才能引發 NPE。首先，我們給予 EV71 感染小鼠腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-，與控制 組相比，小鼠在死亡前出現嚴重肺功能異常，及重度肺氣腫和輕微肺水腫，並且小鼠肺 重與體重比顯著增加。接著，為了釐清 EV71 感染中樞神經合併細胞素所導致肺部機能 惡化是否為 EV71 特有的現象，我們給予第一型單純皰疹病毒 (herpes simplex virus-1; HSV-1) 感染小鼠腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-，小鼠雖出現腦炎和神經症狀，但沒有肺 臟異常加劇或發生 NPE。總括而言，本研究證明以外源性 IL-6、IL-13 和 IFN-注射 EV71 感染小鼠可加劇肺臟異常、促進神經性肺水腫發生，且為 EV71 感染所特有的現象。一、計畫摘要
1b. 英文摘要 (一頁為限)
Since the 1998 epidemic, enterovirus 71 (EV71) has become one of the most concerned health issues in Taiwan. Although we have made some progress in understanding the pathogenesis of EV71, there are still many unresolved questions regarding viral- and host-encoded determinants of EV71 virulence. Studies to determine the disease mechanism are essential for the development of vaccines and therapeutic regimen. The long-term objective of our research is to clarify the pathogenesis of EV71 by determining the host factors that relate to disease susceptibility and the viral genetic elements that involve in the nature of the neurovirulence of the virus. In an EV71 experimental infectious model in which 7-day-old mice were intracranially inoculated with a mouse-adapted EV71 strain MP4, we observed that there was transient increase of serum IL-6, IL-10, IL-13 and IFN-, and the animals developed hind-limb paralysis, pulmonary dysfunction and emphysema without neurogenic pulmonary edema (NPE) afew daysbeforedeath.Weassumed thatthedevelopmentofEV71-induced NPE may require a combined effect of CNS infection and a sufficient amount of IL-6, IL-13, and IFN-. We found that EV71-infected mice with post-treatment of IL-6, IL-13, and IFN- developed mild PE and severe emphysema accompanying with a more severe pulmonary dysfunction than control mice. Contrarily, we treated herpes simplex virus-1 (HSV-1) infected mice with IL-6, IL-13, and IFN-,but no such effect was found. In conclusion, we proved that PE could be induced in EV71-, but not HSV-1-infected mice with exogenous IL-6, IL-13, and IFN- treatment.
二、背景介紹
(至多不超過三頁) 2a. 研究目的 在腸病毒感染引起腦幹腦炎之重症患者中，往往因為併發神經性肺水腫而死亡，因此 探究造成神經性肺水腫之相關因子並在臨床治療上加以阻斷，將可有效降低腸病毒感染幼 兒造成的死亡病例和後遺症。本實驗室所建立 EV71 口服感染之小鼠模式雖可造成神經感 染、肺功能異常和死亡，但沒有類似人類病例中引發肺水腫導致心肺衰竭致死的情形，因 此我們懷疑是否在老鼠感染模式中缺乏某些引發肺水腫的關鍵性因子，而這些關鍵性因子 可能就是造成人類病患發生神經性肺水腫的主因。由於先前的研究中發現，炎症性細胞素： IL-1、IL-6、IL-10、IL-13 和 IFN-似乎與神經性肺水腫的發生有密切關聯，因此我們研究 目的是希望證明增加這些細胞素在 EV71 感染小鼠體內的濃度，是否可以引發小鼠發生神 經性肺水腫。 2b. 文獻探討 (一) 腸病毒 71 型之中樞神經侵犯併發神經性肺水腫EV71 感染致死的腦幹腦炎患者中，有許多人出現自律神經失調 (autonomous nerve dysregulation)、心肺衰竭 (cardiopulmonary collapse)、肺水腫和肺出血 (lung hemorrhage)， 有研究指出在台灣的 EV71 腦幹腦炎死亡病例，大多是因為肺水腫導致呼吸緊迫致死。在 沒有與任何肺水腫相關之心血管疾病病史的情況下，中樞神經損傷之後快速產生的急性肺 水腫，可定義為神經性肺水腫 (neurogenic pulmonary edema；NPE)，而一般認為 EV71 腦 幹腦炎引發的肺水腫符合神經性肺水腫的定義。事實上，在 EV71 感染導致肺水腫之病患 的理學檢查中，並沒有肺炎 (pneumonua) 或是心肌炎 (myocarditis) 的發現。
許多的文獻指出，除了 EV71 腦幹腦炎，其他包括動脈瘤性蜘蛛膜下腔出血 (aneurismal subarachnoid hemorrhage；ASH)、 創傷性腦傷 (traumatic brain injuries)、 頸椎處延髓損傷 (cervical medulla injuries)、 腦部出血 (intracerebral hemorrhage)、 顱內腫瘤 (intracranial tumors)、癲癇 (epilepsy) 、 腦膜炎 (meningitis)等腦部損傷和疾病都和神經性肺水腫的發 生有直接關係。一般認為在腦壓突然升高或是神經性肺水腫相關腦區包括 vasomotor centers、 medulla oblongata、area postrema、caudal medulla、solitarius tractus nuclei 受損的 情況下，便容易發生 NPE。解剖位置上，大部分的神經性肺水腫相關腦區位於下視丘及延 腦。在延腦損傷中，腹側延髓的 A1 catecholaminergic neuron 群，和背側延髓的 solitarius tractus nuclei、dorsal motor vagus nucleus、medial reticulated nucleus 被認為與神經性肺水腫 的發生有很大的關係；另一方面，後下視丘的出血和局部缺血 (ischemia) 導致的交感神經 風暴 (sympathetic storm) 也被視為相當重要的因素。學理上有兩大機轉可以解釋神經性肺 水腫的發生： 1. 血液動力學機轉 (hemodynamic mechanism) 腦傷合併顱內壓遽升導致 hemodynamic alteration 所引起的肺水腫，屬於血液動力學機 轉造成的神經性肺水腫。腦傷合併腦內壓遽升之後，往往引起-adrenergic catecholaminergic hyperactivity 而導致劇烈但暫時之全身性或局部呼吸器官的血管收縮，繼而引發肺部血壓的 劇烈升高；在這樣的高血壓下，肺部血管內的淨水壓會失去平衡，使得液體滲出血管進入
肺泡或是間質組織間。有實驗證明，以血管內灌流 (perfusion) 方式模擬淨水壓失衡性肺水 腫，若是灌流壓力超過 39 mmHg 將超過肺泡壁所能承受的限度，導致微血管內皮受損，進 而傷害基底膜 (basement membrane) 使肺泡上皮受到破壞，如此便徹底損壞了 blood-gas barrier，致使紅血球和蛋白質滲出液漏出血管進入肺泡腔和肺泡間隙。 異常的肺動脈高壓往往併發心臟功能受損，心肌工作量一旦過度，就容易發生心肌疲 乏甚至無力導致左心室收縮衰竭。 實際上， 在 EV71 引起腦幹腦炎的患者中，臨床上可以發現血清中有高濃度的 catecholamine 存在、自主神經的過度活化、全身性高壓、血清心臟酵素升高、心肌凋亡和 心肌退化。因此，當 EV71 入侵中樞神經導致腦幹腦炎時，可能會使得大量 catecholamine 釋放進入血液中，產生自主神經風暴導致心臟衰竭以及肺部微血管通透性的增加，進而發 生神經性肺水腫。 2. 炎症性機轉 (inflammatory mechanism) 神經性肺水腫的炎症性機轉指的是當急性腦損傷發生時，腦部或是受損部位的周邊組 織或器官會釋出大量的細胞素 (cytokine) 或是細胞趨化素 (chemokine)，引起全身性的炎症 反 應 進 而 導 致 神 經 性 肺 水 腫 的 發 生 。 另 外 也 有 研 究 指 出 ， 腦 死 會 導 致 實 質 器 官 中 pro-inflammatory cytokine 基因的表現量增加。
腦傷患者中已被報告會全身性增加的 pro-inflammatory cytokines 包括 IL-1、IL-6、tumor TNF-和 IFN-，上述這些細胞素已知可增加血管內皮的通透性。
上述 pro-inflammatory cytokines 的來源除了腦傷受損部位外，周邊器官可能會因為自主 神經風暴的影響，進而釋放這些細胞素進入循環。有研究指出 catecholamine 的升高會引起 IL-6 釋放量的增加，另外其他研究也指出，catecholamine 的異常分泌增加會引起 IL-10 和 IL-13 的釋放。
在 EV71 引起腦幹腦炎併發神經性肺水腫的患者中，他們的血清測得高量 IL-1、IL-6、 TNF-和 IFN-這 類 pro-inflammatory cytokines ， 並 且 一 些 抗 炎 症 性 細 胞 素 (anti-inflammatory cytokines) 例如 IL-10 以及 IL-13 血清濃度也上升，與肺水腫的形成可能 有密切關係。事實上，臨床上發現在 EV71 感染導致腦幹腦炎之患者中，除了自律神經失 調外，若是合併血液中有高濃度的 IL-6、IL-13 和 IFN-，則有極高的傾向演變成神經性肺 水腫。因此，pro-inflammatory cytokines 增加導致的全性炎症反應也應該與神經性肺水腫的 發生密切相關。 (二) 腸病毒 71 型感染的動物模式 在本實驗室中，我們利用 EV71 在小鼠體內繼代的方式，成功得到一小鼠適應株 MP4， 能藉由口服的方式感染 7 日齡小鼠。小鼠經由口服感染，在死亡前，臨床上可見後肢癱瘓 等神經症狀，並且組織病理學檢查可見腦膜腦炎與脾臟萎縮等病變；EV71/MP4 在 14 日齡 以內的小鼠亦能以口服外之其他方式感染，例如腹腔注射 (i.p.)、肌肉注射 (i.m.) 和顱腔內 注射 (i.c.)。由先前的研究顯示，14 日齡小鼠在顱內注射感染 EV71/MP4 且發生神經症狀 後，並沒有足夠的證據顯示小鼠有併發神經性肺水腫導致死亡，臨床上只能見到肺功能下 降、病理學上亦呈現輕度至中度肺氣腫以及肺鬱血；因此在小鼠感染模式中，勢必有某些 神經性肺水腫決定性因素和人類病例不同，所以導致這樣不同的病程變化。
2c. 研究方法 本研究的特異性目標及研究方法詳述如下： 1. 釐清小鼠在單獨感染 EV71 的情況下肺部之生理及病理變化 小鼠以顱內注射 (i.c.) 的方式感染 EV71，並且引發腦膜腦炎，感染後測定每日肺功能 變化，並且在實驗結束後進行組織病理學檢查，以判斷除肺臟是否有肺水腫之發現。 2. 觀察小鼠在單獨感染的 EV71 情況下，血清、肺部以及腦部的細胞素變化 根據神經性肺水腫之炎症性機轉，在本實驗室的動物模式中，我們推測可能因為血清 或臟器中細胞素的量不夠高，或是持續不夠久即被代謝。因此，我們將顱內注射感染 EV71 之小鼠在感染後分批定時犧牲，採集其腦部、肺部以及血清定量其中細胞素含量，與發病 時機、體內病毒量分布作相關分析比較。
3. 證明是否給予外源性細胞素 IL-6、 IL-13 和 IFN-在 EV71 感染小鼠中可導致肺功能惡 化加劇與神經性肺水腫 根據感染小鼠細胞素每日變化量的數據，於小鼠顱內感染 EV71 後特定時間給予 IL-6、 IL-13 和 IFN-腹腔注射，並觀察每日肺功能變化、肺重與體重比以及組織病理學變化，以 確認是否能藉由外給細胞素的方式導致 EV71 感染小鼠肺功能異常的現象惡化，並且出現 神經性肺水腫。 4. 釐清是否單一種或兩種以上細胞素足以引發 EV71 感染小鼠產生肺水腫 由於臨床研究指出 IL-13 似乎在 EV71 感染導致神經性肺水腫之成因上扮演重要角色， 因此於小鼠顱內感染 EV71 後特定時間給予 IL-6 和 IFN-或只給予 IL-13 腹腔注射，並觀察 每日肺功能變化、肺重與體重比以及組織病理學變化，以確認是否能藉由外給細胞素的方 式導致 EV71 感染小鼠肺功能異常的現象惡化，並且出現神經性肺水腫。
5. 探討 EV71 感染合併細胞素所導致肺部機能惡化為 EV71 感染特有的現象
以同樣的模式給予 HSV 感染小鼠外源性細胞素，藉此評估肺功能惡化與肺水腫之發生 是否為 EV71 感染所特有之現象，而非單純腦炎與腦損傷合併血清 IL-6、 IL-13 和 IFN- 的上升所造成的結果。
三、研究成果
(至少二頁) 3a. 具體研究成果 (一) 以顱內注射 EV71 的方式感染會導致肺功能下降、中度肺氣腫和肺鬱血， 而沒有肺水 腫的發生 7 日齡小鼠經顱內注射感染 EV71，於感染後第四天體重開始下降，在感染三天後便出 現臨床症狀，包括活動力減退、後肢癱瘓等，接著病情就快速惡化，小鼠於感染後第七天 死亡。此外，我們藉由 Whole Body Plethysgraphy 測量小鼠每秒的最大吸氣值 (peak of inspiratory flow；PIF)、最大呼氣值 (peak of expiratory flow；PEF)，潮氣容積 (tidal volume； TV) 和每分鐘換氣量 (minute volume；MV) 作為肺功能變化指標。正常小鼠隨著年齡增 加，肺功能指標也會隨之增加；但 EV71 感染小鼠於感染後第三天便發生肺功能 (PIF、PEF、 TV、MV) 下降，與未感染小鼠相比，感染小鼠死前肺功能平均下降約 50%，臨床上可見 呼吸頻率下降以及深度的腹式呼吸，代表 EV71 感染小鼠在發生神經症狀之後便發生呼吸 困難。經由剖檢以及組織病理學檢查，EV71 感染小鼠的腦幹附近可見輕微之淋巴球浸潤性 腦膜腦炎 (meningoencephalitis) 以及神經膠細胞增生 (gliosis) 等病毒性腦炎的特徵；並且 在肺臟可見中度肺氣腫以及鬱血。不過並沒有明顯的肺水腫。(二) 7 日齡小鼠顱內感染 EV71，血清中 IL-6、IL-10 和 IFN-皆有升高的趨勢
經顱內注射 EV71 感染 7 日齡小鼠，並於感染後第 1、3、4、5、6 日分別犧牲，收取 血清、腦以及肺部進行 sandwich ELISA 以檢測其臟器及血清中細胞素的含量。實驗結果發 現，正常小鼠血清、肺臟及腦部中 IL-6、IL-10 和 IFN-濃度，在實驗觀察過程中皆呈現基 礎值；不過，EV71 感染小鼠血清中 IL-6、IL-10 和 IFN-濃度，在感染三天後明顯地升高， 然而小鼠腦部 IL-6、IL-10、IL-13 和 IFN-濃度在感染五天後才開始升高，肺臟中細胞素的 濃度變化在感染後，並沒有明顯的改變。因此，我們選定以腹腔注射的方式給予外源性細 胞素，如此小鼠體內細胞素才會全身性地增加，並且為配合神經症狀出現的時間，EV71 感 染後第三及第四天給予細胞素注射。
(三) 給予 EV71 感染小鼠 IL-6、IL-13 和 IFN-加劇肺功能異常、顯著增加肺/體重比，並 且在組織病理學檢查中可見輕微肺水腫及中度至重度肺氣腫 由於單獨顱內注射 EV71 無法引發肺水腫，所以我們嘗試合併給予外源性細胞素是否 能導致肺水腫；由上述細胞素的試驗，我們發現在感染後第三天小鼠血清中細胞素濃度升 高，和神經症出現的時間相近。因此，我們選定以腹腔注射的方式，於感染後第三及第四 天給予細胞素，以配合神經症狀出現的時間點。正常小鼠經腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN- 後，其肺功能指標依然持續增加，與只注射 BSA 的小鼠相似；但經腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-後，同時觀察到 EV71 感染小鼠，比起 BSA control 發生肺功能惡化加劇。不論是 否給予 IL-6、IL-13 和 IFN-細胞素注射，正常小鼠的每日體重變化都持續增加；EV71 感 染小鼠於感染後第三天出現臨床症狀，體重變化才開始下降；不過，接受細胞素注射的 EV71 感染小鼠比起單純感染之小鼠提早發生較嚴重的臨床症狀，包括後肢無力、癱瘓等。組織 病理學檢查中發現，給予 EV71 感染小鼠 IL-6、IL-13 和 IFN-注射，除中度至重度肺氣腫 與肺鬱血外，在部分肺泡腔與支氣管 (約佔 12%) 中可見少量嗜伊紅性、均質樣之滲出液，
表示有輕微肺水腫之發生；並且其肺泡發生肺氣腫的比例超過 75%、肺/體重比也較單純感 染之小鼠高出將近 0.5 倍，表示 EV71 感染小鼠肺臟受損較嚴重。
(四) 只給予 EV71 感染小鼠 IL-6 和 IFN-不加劇肺功能之異常，但顯著增加肺/體重比，組 織病理學檢查可見中度至重度肺氣腫，但不見肺水腫
根據先前的研究，IL-13 可能在 EV71 引發之神經性肺水腫中扮演較重要的角色，因此 為釐清單一種或兩種以上細胞素足以引發 EV71 感染小鼠產生肺水腫，我們給予 EV71 感染 小鼠腹腔注射 IL-6 和 IFN-，劑量和注射時間點都與前實驗相同。實驗發現，正常小鼠經 腹腔注射 IL-6 和 IFN-後，其肺功能指標依然持續增加，與只注射 BSA 的小鼠相似；但比 起 BSA control，腹腔注射 IL-6 和 IFN-卻不加劇 EV71 感染小鼠肺功能異常之情形，不過， 注射 IL-6 和 IFN-的感染小鼠，其肺/體重比，比起 BSA control 增加將近 0.5 倍，並且在組 織病理學檢查中可見中度至重度肺氣腫，肺泡腔與支氣管內也有少量之滲出液，不過其滲 出液量化值比起單純感染之小鼠無差異。不論是否給予 IL-6 和 IFN-細胞素注射，正常小 鼠的每日體重變化都持續增加；EV71 感染小鼠於感染後第三天出現臨床症狀，體重變化才 開始下降；不過，接受細胞素注射的 EV71 感染小鼠比起單純感染之小鼠提早發生較嚴重 的臨床症狀，包括後肢無力、癱瘓等。實驗結果得知，只給予 EV71 感染小鼠 IL-6 和 IFN- 細胞素注射雖不影響肺功能的惡化，但卻加劇臨床症狀以及肺臟損傷。
(五) 只給予 EV71 感染小鼠 IL-13 可加劇肺功能異常，卻不增加肺重與體重比，組織病理 學檢查除中度至重度肺氣腫也不見肺水腫
正常小鼠經腹腔注射 IL-13 後，其肺功能指標依然持續增加，與只注射 BSA 的小鼠相 似；但經腹腔注射 IL-13 後，同時觀察到 EV71 感染小鼠，比起 BSA control 發生肺功能惡 化加劇，此結果與給予 IL-6、IL-13 和 IFN-注射的結果類似。雖然 IL-13 可加劇 EV71 感 染小鼠的肺功能異常，但比起 BSA control 卻不增加其肺/體重比；經腹腔注射 IL-13，EV71 感染小鼠的組織病理學檢查可見中度至重度肺氣腫，肺泡腔與支氣管內也有少量之滲出 液，不過其滲出液量化值比起單純感染之小鼠無差異。不論是否給予 IL-13 細胞素注射， 正常小鼠的每日體重變化都持續增加；EV71 感染小鼠於感染後第三天出現臨床症狀，體重 變化才開始下降；而且接受 IL-13 注射的 EV71 感染小鼠比起單純感染之小鼠，並不提早發 生較嚴重的臨床症狀。
(六) 於 EV71 感染後第三天至第四天內 3 次給予小鼠 IL-6、IL-13 和 IFN-，其肺功能變化、 肺重與體重比和組織病理學檢查，皆與先前實驗之結果類似
為了確認是否增加細胞素施打量可更加惡化先前實驗所見之結果，我們於小鼠感染 EV71 第三天後的 48 小時內，每隔 16 小時腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-，藉此增加細胞 素的總施打量和體內的維持時間。實驗結果發現，正常小鼠經 48 小時內給予 3 次 IL-6、IL-13 和 IFN-後，其肺功能指標依然持續增加，與只注射 BSA 的小鼠相似；但經 48 小時內給予 3 次 IL-6、IL-13 和 IFN-後，同時觀察到 EV71 感染小鼠，比起 BSA control 發生肺功能惡 化加劇，與給予 2 次 IL-6、IL-13 和 IFN-注射的結果類似。臨床症狀方面，接受 3 次或 2 次細胞素注射，都不使正常小鼠發生生理功能異常，但 EV71 感染小鼠皆提早發生較嚴重 的臨床症狀，包括後肢無力、癱瘓等，並且比起 BSA control 增加肺/體重比，但是比較接 受 3 次與只接受 2 次細胞素注射的 EV71 感染小鼠，他們的肺/體重比並無差異。組織病理
學檢查也發現，接受 3 次細胞素注射的感染小鼠發生中度至重度的肺氣腫病變，但是滲出 液量化值比起接受 2 次細胞素注射的小鼠並沒有差異。不論是否給予 EV71 感染小鼠 2 次 或 3 次 IL-6、IL-13 和 IFN-注射，他們的肺臟異常程度都相當類似，單純增加細胞素的總 施打量和體內的維持時間，似乎不能加劇肺水腫的發生。 (七) 第一型單純皰疹病毒顱內感染合併 IL-6、IL-13 和 IFN-注射不加劇小鼠肺功能異常， 也不增加肺重與體重比，且組織病理學檢查不見肺水腫
7 日齡小鼠於 HSV-1/KOS 感染後第三、第四天以腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-，結果 發現單獨 HSV-1 感染小鼠在感染後第三天開始發生肺功能異常和抽蓄、呼吸頻率、運動神 經過度興奮等臨床症狀，於感染後第四天小鼠陸續發生昏迷、死亡。不過，於感染 HSV-1 後再給予 IL-6、IL-13 和 IFN-並不會加劇 HSV-1 感染小鼠的肺功能異常。另外，HSV-1 感 染小鼠之肺/體重比，與正常小鼠相比雖有明顯增加，但不論是否接受 IL-6、IL-13 和 IFN- 細胞素注射，其間沒有顯著差異。組織病理學檢查發現，HSV-1 感染小鼠之肺臟損傷都相 當輕微，除可見輕度至中度肺氣腫和肺鬱血外，並沒有任何肺水腫的發生，且結合外源性 細胞素注射沒有惡化肺臟病理變化。雖然顱內感染 EV71/MP4 和 HSV-1/KOS 在小鼠都能引 起神經症狀，以及腦幹處的腦膜腦炎，EV71 感染合併體內細胞素濃度的增加比起 HSV-1 感染更容易引發神經性肺水腫，這樣的差異可能肇因於 HSV-1 不感染腦部與神經性肺水腫 發生相關之特定區域。 3b. 分析與討論 EV71 一直是造成幼兒手足口病流行的重要病毒，但當 EV71 侵犯中樞神經後會引起腦 幹腦炎併發神經性肺水腫往往導致極高的致死率。 肺部高壓導致微血管內淨水壓失衡、細胞素引起肺臟血管內皮通透性變大、自律神經 失調引發肺臟淋巴液回流受阻，以上這些因子的交互作用可導致神經性肺水腫。臨床上， EV71 感染中樞神經會引發自律神經失調、全身性高壓和交感神經風暴，可能改變肺部微血 管內的淨水壓；另一方面，EV71 引起神經性肺水腫患者的血清 IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、 TNF-和 IFN-濃度都偏高。綜合而言，EV71 感染中樞神經導致自律神經失調及細胞素風 暴，可能是導致 EV71 感染後神經性肺水腫發生的主要原因。 本實驗室的研究指出 EV71 感染小鼠中樞神經的主要標的是腦幹，組織病理學檢查也 發現感染小鼠有腦幹腦炎、神經元受損，然而卻沒有肺水腫的發生。血管內皮通透性的改 變也強烈影響神經性肺水腫的發生，推測可能與神經性肺水腫相關的細胞素 (IL-6、IL-13 和 IFN-) 上升量不足，或是體內持續時間不夠久，導致在小鼠 EV71 感染模式中無法發現 肺水腫。 過去關於神經性肺水腫模式的研究，主要著重在交感神經風暴引起的微血管內淨水壓 失 衡 上 ， 包 括 給 予 大 鼠 靜 脈 注 射 catecholamine ， 或 是 利 用 能 引 起 神 經 興 奮 毒 性 (excitotoxicity) 的 藥 物 ， 例 如 紅 藻 氨 酸 (kainic acid) 注 射 大 鼠 的 延 髓 (medulla oblongata)50，都能有效引起交感神經風暴導致神經性肺水腫；不過，針對神經性肺水腫炎 症性機轉方面的研究，大多只探討肺水腫發生伴隨細胞素升高的關係，並沒有相關的動物 實驗可證明細胞素風暴在炎症性機轉中扮演的角色，因此，我們試圖以腹腔注射外源性細 胞素，在感染小鼠建立人為的細胞素風暴，藉此釐清在小鼠 EV71 感染模式中，肺水腫的
發生是否需要中樞神經感染與細胞素風暴的共同作用。 首先，我們再確認 7 日齡小鼠以顱內注射 (i.c.) 感染 EV71/MP4，除腦幹腦炎與肺鬱血 外，不能引發肺水腫；不過，感染小鼠在死亡前都會發生肺功能下降、呼吸困難的症狀， 證明單純 EV71 感染小鼠雖不能引發肺水腫，卻能造成一定程度的心肺功能障礙，這可能 與 EV71 感染中樞神經導致交感神經風暴有關；臨床上 EV71 感染幼兒並不會導致肺氣腫， 而 EV71 感染小鼠可能因為發燒，或呼吸中樞功能異常加劇原本小鼠的高換氣頻率，導致 換氣過度而發生肺氣腫。
利用 sandwich ELISA 檢測 EV71 感染小鼠之臟器與血清中，神經性肺水腫相關之細胞 素含量，發現感染小鼠血清中的細胞素濃度變化有顯著差異，且與臨床症狀及肺功能下降 的時機較相關，推測感染小鼠血清中這些細胞素濃度的上升，可能與神經症狀和心肺衰竭 的惡化有關。此外，EV71 感染小鼠血清中 IL-6、IL-10 和 IFN-的濃度升高，與臨床報告 類似，但是 IL-13 濃度卻未見差異，推測在小鼠感染模式中可能較缺乏 Th2 反應參與，所 以不易發生肺水腫。
根據臨床報告、感染小鼠的細胞素變化，搭配神經症狀出現的時機，我們給予 EV71 感染小鼠腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-，建立人為的細胞素風暴；由本實驗室先前的研究 中得知，顱內注射 (i.c.) 感染 EV71/MP4 比起口服 (p.o.) 或肌肉 (i.m.) 感染，小鼠的病程 發展較為一致，較容易掌握外源性細胞素注射的時機，並且小鼠模式中以顱內感染 EV71 不會在消化道發現病毒，可以避免 cagemate transmission 的發生，因此實驗中我們皆以顱內 注射 (i.c.) EV71 感染 7 日齡小鼠。EV71 感染小鼠給予腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-與不 給予腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-相比，發現肺功能下降加劇、輕微肺水腫、重度肺氣 腫，且肺/體重比也顯著增加，顯示 EV71 感染中樞神經合併血清中 IL-6、IL-13 和 IFN-濃 度的上升，可加劇心肺衰竭並且增加神經性肺水腫發生的機會。
有臨床研究指出，Milrinone (一種 phosphodiesterase inhibitor，可提高細胞內 cAMP 的 含量) 有效降低 EV71 引起神經性肺水腫的死亡率，推測其功效可能與降低患者血清 IL-13 濃度有關。因此，我們給予 EV71 感染小鼠腹腔注射 IL-6 和 IFN-或單獨給予 IL-13。與不 給予腹腔注射細胞素的 EV71 感染小鼠相比，發現單獨給予 EV71 感染小鼠腹腔注射 IL-13， 可加劇肺功能下降、重度肺氣腫，卻不見肺水腫發生，肺/體重比的增加也不顯著；相反的， 給予 EV71 感染小鼠腹腔注射 IL-6 和 IFN-，發現肺功能下降情況與不給予細胞素注射的感 染小鼠類似，組織病理學檢查也不見肺水腫發生，但仍可見中度至重度肺氣腫以及顯著增 加的肺體重比。顯示血清 IL-13 的上升在 EV71 感染中，主要影響肺功能異常與增加呼吸阻 力，而 IL-13 與 IL-6 和 IFN-的共同作用則可增加肺重，並且促進肺水腫的發生。
最後，我們利用 HSV-1/KOS 感染小鼠中樞神經引發腦炎，合併腹腔注射 IL-6、IL-13 和 IFN-的方式，與 EV71 感染小鼠做比較。發現單純 HSV-1 感染小鼠也會引起肺功能下降、 肺氣腫和肺重增加等肺臟異常，但是合併注射 IL-6、IL-13 和 IFN-無法加劇肺臟異常的發 生，推測原因可能與神經性肺水腫相關腦區並非 HSV-1 感染小鼠中樞神經的主要標的有 關；雖然 HSV-1 感染曾被報導與免疫抑制患者 (immunocompromised patient) 發生急性呼吸 緊迫症候群 (acute respiratory distress syndrome；ARDS) 有關。但是在小鼠顱內感染模式 中，HSV-1 引起肺功能下降與肺重增加，原因推測與 HSV-1 腦炎影響杏仁核 (central amygdala；cAMG) 引發 hypothalamic-pituitary-adrenal axis 過度活化有關，與注射 IL-6、IL-13 和 IFN-無關，這也間接證明 IL-6、IL-13 和 IFN-在 EV71 引起之神經性肺水腫中扮演重要 角色，並且中樞神經感染合併細胞素風暴引發神經性肺水腫是 EV71 特有的併發症。
雖然血清中 IL-6、IL-10、IL-13 和 IFN-這四種細胞素濃度上升，與 EV71 引起神 經性肺水腫相關，不過他們可能在促進神經性肺水腫上扮演不同的角色。研究指出，將牛 血管內皮細胞與 IL-6 (100 ng/ ml) 培養 21 小時後，血管內皮細胞的形態改變與通透性會顯 著增加，而且血管內皮的通透性與添加 IL-6 的濃度及培養時間成正比。另外，IFN-被報導 能增加大鼠皮膚血管的通透性，並且改變人類腦部微血管細胞的型態，可能對血腦障壁 (blood-brain-barrier) 的開啟與腦炎的發生有重要影響。根據過敏性氣喘的研究，IL-13 被發 現可直接造成呼吸道過度反應 (airway hyperreactivity ；AHR)、大量黏液分泌 (mucus overproduction)、肺部血管通透性增加、平滑肌增厚，這些呼吸道的病變都會導致肺功能障 礙，間接促成肺水腫的發生。臨床上使用 Milrinone 改善 EV71 引起的神經性肺水腫，患者 經治療後血清中 IL-13 的濃度都有顯著下降，而死亡率也隨之下降。IL-10 是具有抑制炎症 反應能力的細胞素，在中樞神經發生急性或慢性神經炎症反應時，IL-10 可被大量釋放藉以 調節免疫系統。由 EV71 患者的臨床觀察，血清中 IL-10 濃度上升與神經性肺水腫的發生相 關；在 EV71 感染小鼠發病末期，血清 IL-10 的濃度也會升高，顯示在 EV71 引起神經性肺 水腫或腦幹腦炎過程中，可能有一保護機制被啟動。根據先前研究指出，IL-10 可降低肺部 血管通透性，並調節炎症性細胞素包括 TNF-、IL-1、IL-6 和 IL-8 等，可避免肺水腫的發 生。本研究雖然未證實 IL-10 在 EV71 引起神經性肺水腫中具有保護作用，但不排除此可能 性，且針對保護機制所做的研究，可以提供預防或治療 EV71 引起神經性肺水腫一個新方 向。 綜合而言，在本實驗中我們比較了在 EV71 或 HSV-1 感染小鼠中，以不同方式給予神 經性肺水腫相關的細胞素所造成的肺臟異常。我們發現 EV71 感染合併給予 IL-6、IL-13 和 IFN-可加劇肺功能異常與惡化肺臟的損傷；若是少了 IL-13，雖然也能惡化肺臟的損傷， 但是沒有加劇肺功能異常的能力；相反的，只給予 IL-13 無法惡化肺臟損傷，但卻加劇肺 功能異常的現象，顯示 IL-13 升高在 EV71 感染小鼠中扮演的主要角色，可能是導致肺功能 異常，而 IL-6 和 IFN-則可能與增加血管通透性引起水腫液進入肺泡腔內有關；這也可以 解釋臨床上發現以 Milrinone 治療肺水腫患者，能有效降低血清 IL-13 的量並增加患者存活 率，可能與減緩患者呼吸功能障礙，進而避免心肺衰竭有關。另外，在 HSV-1 的實驗中也 發現，雖然 HSV-1 感染小鼠也能導致與單純 EV71 感染類似的心肺功能障礙，但是合併給 予外源性細胞素卻沒有更加惡化肺臟異常，顯示在病毒引發神經性肺水腫的成因中，病毒 感染中樞神經合併細胞素風暴為 EV71 所特有的現象，至少在 HSV-1 感染小鼠的模式中沒 有類似的關連性存在。此外，本實驗室的研究也發現 Type I IFN 可有效增加 EV71 感染小 鼠的存活率，而單純 EV71 感染會抑制小鼠 Type I IFN 的產生 (李一平，未發表報告) ，並 促進 IL-6、IL-13 和 IFN-的釋放，因此這些炎症性細胞素在 EV71 感染中，除了促進肺水 腫的發生外，可能對病毒感染中樞神經與傳播有重要影響。
3c.所遭遇之困難與因應對策
在確認血清細胞素濃度上升會促進 EV71 引起之神經性肺水腫後，我們增加注射 IL-6、 IL-13 和 IFN-的次數，看是否有 dose-dependent effect。卻發現增加施打次數與不增加施打 次數的實驗結果類似，無法觀察到 dose-dependent effect，可能是因為細胞素已達引起肺水 腫之施打量的極限，或是增加施打細胞素次數的時機不正確。此外，雖然 IL-6、IL-13 和 IFN-
對於血管內皮通透性的改變都有影響，但是我們的實驗證明個別或共同給予能夠影響生理 值的外源性細胞素，也不能在正常小鼠引發肺水腫或肺功能異常；反觀在小鼠 EV71 感染 的模式中，EV71 感染中樞神經引發神經症狀後，合併給予外源性的細胞素可在少數小鼠發 現輕微的肺水腫，並且多數小鼠有肺重增加、重度氣腫和肺功能惡化加劇的情況發生，暗 示要引發肺水腫，除中樞神經感染外還需要細胞素之類額外的因子。雖然我們的實驗證明， EV71 感染中樞神經合併給予外源性細胞素可以促進肺水腫的發生，但多數小鼠身上沒有明 顯肺水腫的原因，可能與細胞素施打的時機不夠正確，或 EV71 感染小鼠所導致的自律神 經失調不夠嚴重有關；若能延後或縮短細胞素施打的間距，並選擇感染小鼠發病較後期的 時間點注射細胞素，也許可以找到更適當的細胞素注射時機。另外，因為在小鼠 EV71 感 染模式中，我們只能感染 14 日齡以內的仔鼠，所以難以藉由靜脈注射細胞素，或是 hydrodynamic injection 的 方 式 送 入 已 建 構 好 細 胞 素 的 plasmid ； 若 是 以 腺 病 毒 載 體 (adenoviral vector) 在小鼠大量表現細胞素，又會遭遇病毒之間互相競爭與引起第一型干擾 素 (type I IFN) 釋放的問題，所以難以維持外源性細胞素在小鼠體內存在的時間，這可能 是在我們的小鼠 EV71 感染模式中所遇到最大的限制。
四、未來研究構想
在台灣每年都有許多腸病毒的流行疫情，包括克沙奇病毒 A 及 B、伊科病毒及腸病毒 71 型 (EV71)，對幼兒健康造成極大威脅。病毒毒力因子的變異是增加病毒病原性的主因， 但造成腸病毒疫情爆發的原因仍未明瞭，目前有限的流行病學資訊仍然無法建立腸病毒的 流行模式及預測流行。 針對 EV71 的基礎研究，本實驗室率先利用小鼠適應株建立 EV71 小鼠感染模式，證實 抗體及第一型干擾素是主要對抗 EV71 的免疫反應。我們亦證實克沙奇 A16 (CA16)和 EV71 有免疫交叉反應，並且在動物感染實驗證明此免疫交叉反應可保護小鼠，避免 EV71 強毒 株感染引起的嚴重症狀。此外，我們發現不同腸病毒在相同免疫條件下，引起的特異性細 胞和體液免疫能力各有不同，且細胞免疫力的強弱與腸病毒盛行率有若干相關性。 因此我們假設不同腸病毒之間的交互作用會影響腸病毒感染的致病機制。未來我們將 以腸病毒感染族群為對象，探討族群的免疫力(特異性及交叉反應)是否會影響腸病毒感染或 疾病的表現，建構解釋腸病毒流行的模式，以做為預測流行的依據。此外，對腸病毒在族 群中免疫特性的了解以及釐清不同腸病毒間的免疫交叉反應，將有助於多價病毒疫苗的開 發。 針對未來研究構想的特異性目標包括： 1. 以動物實驗 (1)了解腸病毒特異性免疫力特性、強度，(2)腸病毒間免疫交叉反應的廣度 及強度，(3)針對臨床重要的腸病毒，如 EV71、CB2 等，探討免疫交叉反應可否提供感染 的保護效力，或反之引起免疫增強效應 2. 以細胞實驗探討不同腸病毒間 (特別是 EV71 和 CA16)是否有基因重組的現象 3. 分析台灣地區腸病毒感染族群對不同腸病毒之特異性免疫力的趨勢五、成果自評
(如為整合型計畫，請各子計畫主持人分別撰寫進度評估；另請總計畫主持人整合各子計畫 之執行進度與總計畫之相關性後，撰寫整體計畫之進度評估。) 5a. 研究成果與原設定目標之相符程度 總計劃 (97IRP004): 腸病毒 71 型中樞神經感染治病機轉研究 (CNS Pathogenesis of Enterovirus 71)結合三個子計畫以完成了解腸病毒 71 型致病機轉的長期目的。，茲將各子 計畫研究成果與原設定目標之相符程度分述如下： 子計畫一 (97IRP004-1)腸病毒 71 型神經侵入性分子機轉 (The Molecular Mechanism of Enterovirus 71 Neuroinvasiveness)
本子計畫具體目標為探討第一型干擾素對決定宿主感受性及組織親和性的重要性及釐 清決定病毒感染、複製、傳播及環境抗性基因與病毒神經毒力關係。在第二年度上半期計 畫補助期間，已完成之研究成果與原設定目標之相符程度百分比為 100%。
子計畫二 (97IRP004-2)
腸病毒 71 感染引發神經毒性之分析 (Characterize neurotoxicity of enterovirus 71 infection) 本子計畫具體目標為比較臨床病毒分株神經毒性與臨床症狀輕重相關性，另藉
infectious clones 製作重組病毒找尋決定基因。在第二年度上半期計畫補助期間，已完成之 研究成果與原設定目標之相符程度百分比為 100%。
子計畫四 (97IRP004-4)
利用醣微矩陣研究腸病毒 71 型之感染致病機轉 (Discover the infection mechanism of enterovirus 71 by carbohydrate microarray)
本子計畫具體目標為探討病毒外殼蛋白與宿主細胞表面醣體的相互作用是病毒結合的 一種方式，並釐清其中結合性質及開發有效競爭測試平台找尋可干擾病毒結合的小分子。 在第二年度上半期計畫補助期間，已完成之研究成果與原設定目標之相符程度百分比為 90%。 5b. 達成預期目標情形 總計劃 (97IRP004): 腸病毒 71 型中樞神經感染治病機轉研究 (CNS Pathogenesis of Enterovirus 71)包含三個子計畫，茲將各子計畫達成預期目標情形分述如下： 子計畫一 (97IRP004-1)
腸病毒 71 型神經侵入性分子機轉 (The Molecular Mechanism of Enterovirus 71 Neuroinvasiveness)
在子計畫一的研究中，我們利用 EV71 小鼠適應株感染小鼠動物模式來探討第一型干 擾素與發炎性細胞激素在 EV71 感染疾病進程中所扮演的角色及研究 EV71 逃脫宿主免疫攻
擊的機制。小鼠感染 EV71 後會產生病毒血症、後肢癱瘓、肺功能異常及肺氣腫等臨床症 狀並伴隨著血中與腦中 interleukin (IL)-6、monocyte chemoattractant protein-1、tumor necrosis factor 與 IFN-的顯著增加，但 IL-10、IL-12、IL-13 與第一型干擾素並未增加。我們假設： 神經性肺水腫的誘發可能需要足夠量的肺水腫相關性細胞激素 (如 IL-6、IL-13、及 IFN-) 參與。實驗結果顯示：EV71 感染小鼠給予 IL-6, IL-13 與 IFN-細胞激素刺激後可誘發小鼠 產生肺水腫與嚴重肺氣腫症狀，其嚴重程度遠大於 EV71 感染但未給予細胞激素刺激的組 別。另外，接種 EV71 小鼠，血清中第一型干擾素的產量明顯低於接種人工合成雙股 RNA： poly (I:C)、腺病毒第五型或克沙奇病毒 B3 的小鼠。事先感染腸病毒 71 型能夠有效抑制 poly (I:C)及克沙奇病毒 B3 所誘發的第一型干擾素產生並且降低克沙奇病毒 B3 感染的小鼠周邊 血中 IFN-producing plasmacytoid dendritic cell 的比例。將 RAW264.7 細胞事先與腸病毒 71 型共同培養亦能有效降低 poly (I:C)誘發的第一型干擾素的產生。此外，我們使用過量表現 的系統在 RAW264.7 及成鼠的研究平台證實 EV71 抑制第一型干擾素的產生是透過病毒的 3C 蛋白酶所達成。因此，EV71 可能透過病毒的 3C 蛋白酶抑制宿主第一型干擾素合成進而 干擾先天性免疫防禦機制；另一方面，藉由增強發炎性細胞激素反應而導致肺水腫病程加 劇。 子計畫二 (97IRP004-2)
腸病毒 71 感染引發神經毒性之分析 (Characterize neurotoxicity of enterovirus 71 infection) 在這段補助期間，我們利用神經細胞與新生小鼠模式分別進行試管內與活體內試驗， 比較具有較強神經毒性之腸病毒 71 型小鼠適應病毒株 MP4 與臨床分離病毒株 4643 的神經 毒性與毒力，結果發現 MP4 病毒株的感染會造成較多的神經細胞死亡，並且對於小鼠也具 有較高的毒性。為了進一步的分析病毒神經毒性與毒力決定因子，我們建構一系列 4643、 MP4、以及針對不同位點突變的重組病毒，並分析這些病毒神經毒性及病毒毒力。我們發 現，腸病毒 71 型外殼蛋白是主要影響神經毒力、病毒毒性及病毒複製的決定性區域，其中 在 VP2 蛋白第 149 個位點與 VP1 蛋白第 145 個位點，分別由 lysine 突變為 methionine 與由 glutamine 突變為 glutamic acid 均可以部分增加病毒對於神經細胞的毒性，而若同時將 VP2 蛋白突變為 methionine（VP2K149M）與 VP1 蛋白突變為 glutamic acid (VP1Q145E)，對於增加
腸病毒 71 型在小鼠神經細胞中的神經毒性及病毒複製則有加成的效果。類似的結果也在新 生小鼠感染模式中發現， VP1Q145E 與 VP2K149M 突變株也會同時降低腸病毒 71 型對於小 鼠的致死劑量，因此，VP1Q145E 與 VP2K149M的突變被認為是主要影響腸病毒 71 型對於小 鼠毒性的決定位置。我們的研究發現了腸病毒 71 型的外殼蛋白是造成病毒神經毒性與毒力 的決定區域，同時外殼蛋白中 VP2K149M與 VP1Q145E是主要決定腸病毒 71 型在神經細胞中 的神經毒性、複製能力與毒力的位置。 子計畫四 (97IRP004-4)
利用醣微矩陣研究腸病毒 71 型之感染致病機轉 (Discover the infection mechanism of enterovirus 71 by carbohydrate microarray)
在子計畫四的研究中，於這段補助期間，我們已經製備了一百零二種聚丙烯醯-寡醣類 受質，其中包含了十種硫酸化寡醣類，以及二十三種含有唾液酸結構的寡醣類。為了增加 醣微矩陣的多樣性，尤其是在末端醣類的變異性，並且避開步驟複雜且產率低的合成方法， 我們已經轉殖並大量表現 alpha2-3 以及 alpha2-6 唾液酸轉移酵素，做為延伸醣類種類的方
法之一。我們也同時建立了 GFP 表現病毒，用來測試病毒感染的效能。此外，為了測試醣 微矩陣的效能，我們利用了數種 lectin、抗體、以及流感病毒顆粒，成功確認了這個平台的 功能。經過多次的分析測試，我們發現 EV71 病毒顆粒會與 sialyl lewis X 結合，並有一定 的專一性。此外，流式細胞儀的結果也顯示，RD 細胞表面也發現具有許多的 alpha2-3 以及 alpha2-6 唾液酸分子。對照之前腸病毒的結構蛋白具有半乳糖或是乙烯胺基半乳糖修飾的 結果，我們將會繼續探討醣類分子在 EV71 感染細胞中所扮演的角色。 5c. 研究成果之學術或應用價值 在基因體計畫經費支持下，我們結合三個子計畫以完成了解腸病毒71型致病機轉的長 期目的。子計畫一著重在找尋決定疾病感受性的宿主因子以及控制病毒的毒性基因。在這 部分的研究中我們利用已建立的實驗系統和工具釐清病毒的結合、複製及侵入能力是否與 疾病發展有關。另外，我們也藉由探討先天免疫對病毒的辨認以及第一型干擾素與疾病發 展的關係，進一步了解病毒與宿主的交互作用和感受性。目前的研究成果證實腸病毒71型 可能透過病毒的3C蛋白酶抑制宿主第一型干擾素合成進而干擾先天性免疫防禦機制；另一 方面，藉由增強發炎性細胞激素反應而導致肺水腫病程加劇。此部分的發現對於學術上對 腸病毒71型的致病機轉以及腸病毒71型與宿主間交互作用的瞭解有突破性的發現。子計畫 二針對腸病毒71型神經毒性與致病因子進行分析，並利用基因重組、體外細胞培養系統、 新生小鼠感染模式等，以進一步了解腸病毒71型造成中樞神經系統疾病的致病機轉。我們 的研究發現了腸病毒71型的外殼蛋白是造成病毒神經毒性與毒力的決定區域，同時外殼蛋 白中VP2K149M與VP1Q145E是主要決定腸病毒71型在神經細胞中的神經毒性、複製能力與毒力 的位置。這部分的研究成果增進了科學上對腸病毒71型神經毒性與致病因子的瞭解。子計 畫四著重在探討病毒外殼蛋白與宿主細胞表面醣體的相互作用是病毒結合的一種方式，並 釐清其中結合性質及開發有效競爭測試平台找尋可干擾病毒結合的小分子。我們已經製備 了一百零二種聚丙烯醯-寡醣類受質，其中包含了十種硫酸化寡醣類，以及二十三種含有唾 液酸結構的寡醣類。在這部份的研究中，我們發現EV71病毒顆粒會與sialyl lewis X結合， 並有一定的專一性，我們將會繼續探討醣類分子在EV71感染細胞中所扮演的角色，並更進 一步地針對EV71以及其外鞘VP蛋白質的醣類結合特性、感染機制、細胞毒性因子、以及上 列三項與病毒基因之間的相關性進行研究、探討與確認。找尋具有潛力破壞EV71與細胞表 面醣類結合的小分子，以期能夠提供腸病毒流行的預防與治療另一個新的思考方向。 5d. 學術期刊發表情形
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七、附件
7a. 學術論文
Lee, Y. P., Huang, S. W., Wang, Y. F., & Yu, C. K. Modification of the type I interferon and proinflammatory cytokine responses by enterovirus 71.14th International congress on infectious diseases, No. 84.018 (2010).
7b. 可供推廣之研發成果資料表 NIL
可供推廣之研發成果資料表
□ 可申請專利 □ 可技術移轉 日期：___年___月___日國科會補助計畫
計畫名稱： 計畫編號： 計畫主持人： (中文)產品/技術名稱
(英文)發明人/單位
(中文)產品/技術說明
(100～500 字) (英文)應用範圍
產品/技術優勢
市場潛力
(可能競爭之國內外廠商及其產品？可能技轉或合作之國內外廠商？)產品/技術
保護狀況
(專利名稱？專利通過年度/申請日期？是否有技轉?) 1. 每項研發成果請填寫一式二份，一份隨成果報告送繳本會，一份送 貴單位研發成果推廣 單位（如技術移轉中心）。 2. 本項研發成果若尚未申請專利，請勿揭露可申請專利之主要內容。 3. 本表若不敷使用，請自行影印使用。出國會議心得報告
計畫名稱：腸病毒 71 型中樞神經感染致病機轉研究 The Molecular
Mechanism of Enterovirus 71 Neuroinvasiveness
計畫編號: 97IRP004-1
計畫主持人: 余俊強 教授
壹、會議地點：泰國曼谷 貳、會議日期：2009 年 4 月 25 至 4 月 30 日 參、參加人員：國立成功大學基礎醫學所 蘇珮誼 國立成功大學微生物暨免疫學研究所 葉玟伶肆、會議名稱：2009 International Symposium on Laboratory Animal Science (ILAS) 伍、會議行程:
4/25 由高雄小港機場搭機前往曼谷
4/26 於 The Royal Navy Convention Hall 參加研討會 4/27 於 The Royal Navy Convention Hall 參加研討會 4/28 曼谷市區參觀
4/29 泰國名勝參觀 陸、參訪心得:
這次參加 International laboratory animal symposia，最主要的收穫是聆聽了許 多豐富的演講，在研討會過程中有許多傑出的講者分享他們的研究成果及提供許 多很珍貴的資訊，在此列舉了幾位令人印象深刻的講者來與各位分享。
首先是泰國僧侶 Dr. Phra Dharmakosajarn 的演講，議題為 Buddhism and Biomedical Research，以佛家的角度去看動物實驗的犧牲與照顧，認為人沒有權 利決定一個生命的去留，殺一隻老鼠與殺一個人是一樣的，但科學研究必須犧牲 動物生命來造福更多人類，因此在執行動物實驗時應該要報有感恩及耐心，不可 以製造太多的痛苦。
第二位演講者是 Dr. Ann Turner，議題為 Advancing Laboratory Animal Science，她是 American Association for Laboratory Animal Science (AALAS)的成 員，她提到，在美國的實驗動物中心人員，除了必須通過各項國家考試及實作外， 還必須參加訓練並通過中心的檢定才能夠擔任實驗人員，而她們的分工也是相當 精細的，從 information dissemination 到各部門皆有專職人員，在會議中也提供了 未來 AALAS 的國際會議行程給在場的聽眾做參考。
諾 貝 爾 獎 得 主 Dr. Peter Doherty 演 講 議 題 為 Laboratory Animals in Biomedical Research: from the Nobel Perspective，Dr. Peter C. Doherty 在 1996 年 獲得 Nobel Prize in Physiology or Medicine 的殊榮，在這次的研討會中，Dr. Peter
C. Doherty 與我們分享他利用 influenza virus 在大鼠動物實驗模式中發現到的趣 事； Dr. Peter C. Doherty 首先指出以 influenza virus 為例，不同 serotypes influenza virus 來自於不同的 hosts，在 host cells 中 epigenetic change 影響 immune cells 的分化，Dr. Peter C. Doherty 利用 knock-out and knock-in mice 發現 CD8+ 會專 一性的識別 T cell， 之後更進一步的證實 single nucleotide polymorphism (SNP) is very important for virus transplantation and host stain immune-response. 他也提供 他 在 做 研 究 時 的 時 常 考 慮 的 因 素 給 我 們 做 參 考 。 1. The information and interpretation from than current studies in human were wrong and were fundamentally confusing. 2. Without the power of mouse experimentation and the availability of genetically-defined, inbred mouse strains developed for the analysis of transplant immunity, it could have been decades before we understood how cell-media immunity really works. Dr. Peter C. Doherty 的演講中令人留下很深刻的印象，virus infection 可能會因為一個 nucleotide mutation 就改變了 host 身上整個 immuno-response。
Dr. Amanda McGuigan 的演講議題為 Genetically Modified Animals: An Overview of Technological and Resource Development，年輕的外貌一上台開口就 是感謝台下老公的陪伴，是個令人印象深刻的講者， Dr. Amanda McGuigan 提 供了 animal model 中可利用的技術給我們參考，從最小的 DNA technique 開始， DNA construction 、 embryo injection (microinjection) 、 reporter genes 、 vectors choose、Lentivirus choose、tetracycline systems、production of knockout mice by blastocytes、Identification and selection、knockout mice design、produced ES cell methods、lesser technique、brain brow mice、RNA in mice (how to choose correct lentivirus)、non-surgical embryo transfer、stem cell transfer cloning technique、ENU mutation (point mutation) to change phenotype 。 這 些 技 術 都 是 Dr. Amanda McGuigan 在動物模式中所運用過的技術，並且以他過來人的經驗提供其優缺點 給我們做為參考，這些使我們之後在設計動物實驗時多了許多可應用的技術。
Dr. Kazuyoshi Taya 所演講的議題為 The Hatano Rat as an Excellent Model for Studying Physiology of Stress Response，當主持人在介紹 Dr. Kazuyoshi Taya 便引 起了我的興趣，他是這麼說的：Dr. Kazuyoshi Taya 所利用的實驗動物小至 mice 大至 elephant，可以說是一位動物實驗的專家啊! 這樣的開場介紹，著實讓令人 吃了一驚。當然，在這次演講中 Dr. Kazuyoshi Taya 還是以大家所熟悉的 murine model 來做為主題，並沒有真的以 elephant model 來做探討。 Dr. Kazuyoshi Taya 以大鼠為 model，利用老鼠對於壓力會有焦躁不安的反應，以 Shuttle box avoidance test，給予刺激後將 Hatano rats 大鼠分為: HAA (highly avoidance rats) and LAA (lowly avoidance rats)，之後分別給予受試大鼠不同的刺激，例如：光線 強弱、空間大小、電刺激、氧氣供應含量、、、等，再去觀測這些大鼠體內的各 種生理值，再給予藥物，便可以觀察到這些老鼠的情緒差異、生理差異，是用來 研究心理及精神疾病藥物的理想動物。之後再進一步分析鼠體內神經傳導與器官 變化之差異他發現到當這些大鼠受到刺激產生焦慮後，體內的免疫系統功能會顯 著下降，且根據性別、年齡、adrenal size 也發現會影響生理狀況，這些狀況與人 類頗相似。在聆聽 Dr. Kazuyoshi Taya 講述他的實驗過程時，能夠深切的感受到 Dr. Kazuyoshi Taya 對實驗的講究、自我要求及對待實驗動物的照護，不因為實 驗動物的大小而改變對待實驗動物的方式，尊重且珍惜每一隻實驗動物。
柒、致謝:
本次參訪支出由國科會經費支出，非常感謝國科會基因體計畫的支持，令我 們有機會參加這次的國外學術演講，藉此彼此互相分享及交流，拓展自己的視 野，啟發自己對於看待事物角度的不同層面，提升對於實驗的敏感度，僅此致謝。 捌、照片集:
